专利名称：一种阳离子聚合物修饰的纳米磷酸钙基因载体的制备方法
技术领域：
本发明涉及非病毒基因载体的制备方法，尤其是制备阳离子聚合物修饰的 纳米磷酸钙基因载体。
技术背景现代基因技术和人类基因组工程图谱的完成，为采用基因分子生物学方法 治疗各类疾病，提高人类生命质量提供了广阔的前景。由于裸露的核酸分子难 以在体液中稳定存在，在主要器官中只能实现低层次的表达，寻求能够实现广 泛基因表达的基因载体成为基因治疗在大规模临床应用中的关键问题。病毒载 体虽然具有较高的转染效率，但潜在的毒性、免疫原性及靶向性等问题限制了 其在临床治疗中的应用。开发具有高效安全和组织特异性的非病毒基因载体具 有非常重要的意义。磷酸钙是机体的天然成分，具有良好的组织相容性和吸收性，易被细胞胞 饮吸收，无毒副作用等特点，因此是一种优良的基因载体。目前，磷酸钙基因载体通常采用共沉淀法制备，这种方法使得DNA大部分被包裹在CaP内，能够 得到比较好的保护而不被降解。但采用上述共沉淀法制备的磷酸钙基因载体的 尺寸不稳定，接近微米水平，易被网状内皮系统清除出体内，使转染率明显降 低。如何制备纳米尺寸的磷酸钙基因载体成为研究的热点问题之一。 发明内容本发明的目的是提供一种阳离子聚合物修饰的纳米磷酸钙基因载体的制备 方法，以获得尺寸稳定、高效转染的纳米磷酸钙基因载体。本发明的制备阳离子聚合物修饰的纳米磷酸钙基因载体的方法，其步骤如下(1) 配置浓度为3 8 mmol/L的氯化钙水溶液；(2) 配制浓度为2 5 mmol/L的磷酸钠水溶液；(3) 将等体积的氯化钙水溶液和磷酸钠水溶液镟涡混合，加入质粒DNA 水溶液，使质粒DNA浓度达到50 80 y g/mL，获得表面DNA稳定的磷酸钙纳 米粒子水溶液；(4) 配置浓度为0.1 lmg/mL的阳离子聚合物水溶液；(5) 取一定量步骤(4)的溶液加入到步骤(3)的溶液中，使阳离子聚合 物分子含有的胺基与DNA分子含有的磷酸基团的摩尔比为0.5 3，混合均匀，即可。上述的质粒DNA为购自clonetech公司的绿色荧光蛋白质粒pEGFP。 上述的阳离子聚合物为聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、聚乙二醇一接枝一聚乙烯亚胺或聚乙二醇一接枝一聚赖氨酸。本发明制备方法简单，获得的阳离子聚合物修饰的纳米磷酸钙基因载体，可有效诱导DNA分子的缔合，具有高效无毒，良好生物相容性，尺寸稳定，高效转染的特性，是理想的基因传输载体之一。
具体实施方式
实施例1:分别配置3 mmol/L的CaCb水溶液、2 mmol/L的Na3P04水溶液。将1 mL CaCl2水溶液加入到1 mLNa3P04水溶液中，剧烈混合。迅速加入pEGFP水溶液， 使其浓度达到50 u g/mL，混合均匀获得壳层DNA稳定的CaP纳米粒子。加入 0.1mg/mL的聚乙烯亚胺(PEI)水溶液70yL,使N/P值达到0.5，混合，制备 PEI修饰的纳米CaP基因载体。采用溴化乙啶排除法评价这种杂化CaP基因载 体的DNA缔合特性，荧光光谱测定结果表明，少量PEI的加入能有效诱导DNA 分子的缔合，保护DNA分子的生物活性，并显示出良好的转染特性。 实施例2:分别配置6 mmol/L的CaCl2水溶液、3.5 mmol/L的Na3P04水溶液。将1 mL CaCl2水溶液加入到1 mL Na3P04水溶液中，剧烈混合。迅速加入pEGFP水溶液， 使其浓度达到75ug/mL，混合均匀获得壳层DNA稳定的CaP纳米粒子。加入 0.5mg/mL的聚乙二醇-接枝-聚乙烯亚胺(PEG-PEI)水溶液，使N/P值达到2， 获得PEG-PEI修饰的纳米CaP基因载体。光散射粒径分布仪测定结果表明经 PEG-PEI修饰的纳米磷酸钙基因载体在生理盐溶液中具有良好的稳定性，并显 示出良好的转染特性。 实施例3:分别配置5 mmol/L的CaCl2水溶液、3 mmol/L的Na3P04水溶液。将1 mL CaCl2水溶液加入到1 mL Na3P04水溶液中，剧烈混合。迅速加入pEGFP水溶液， 使其浓度达到60 ii g/mL，混合均匀获得壳层DNA稳定的CaP纳米粒子。加入 0.3 mg/mL的聚赖氨酸(PLL)水溶液，使N/P值达到1,获得PLL修饰的纳米 CaP基因载体。《-电位测定结果表明PLL的加入能有效诱导DNA分子的缔合。分别配置8 mmol/L的CaCl2水溶液、5 mmol/L的Na3P04水溶液。将1 mL CaCl2水溶液加入到1 mL Na3P04水溶液中，剧烈混合。迅速加入pEGFP水溶液， 使其浓度达到80ug/mL,混合均匀获得壳层DNA稳定的CaP纳米粒子。加入 lmg/mL的聚乙二醇-接枝-聚赖氨酸(PEG-PLL)水溶液，使N/P值达到3，获 得PEG-PLL修饰的纳米CaP基因载体。光散射粒径分布仪测定结果表明经 PEG-PLL修饰的纳米CaP基因载体在生理盐溶液中具有良好的稳定性，并显示 出良好的转染特性，是一种理想的纳米磷酸钙基因载体。
权利要求
1.一种阳离子聚合物修饰的纳米磷酸钙基因载体的制备方法，其特征在于，它的步骤如下(1)配置浓度为3～8mmol/L的氯化钙水溶液；(2)配制浓度为2～5mmol/L的磷酸钠水溶液；(3)将等体积的氯化钙水溶液和磷酸钠水溶液漩涡混合，加入质粒DNA水溶液，使质粒DNA浓度达到50～80μg/mL，获得表面DNA稳定的磷酸钙纳米粒子水溶液；(4)配置浓度为0.1～1mg/mL的阳离子聚合物水溶液；(5)取一定量步骤(4)的溶液加入到步骤(3)的溶液中，使阳离子聚合物分子含有的胺基与DNA分子含有的磷酸基团的摩尔比为0.5～3，混合均匀，即可。
2. 根据权利要求1所述的阳离子聚合物修饰的纳米磷酸钙基因载体的制备 方法，其特征在于所说的质粒DNA为绿色荧光蛋白质粒pEGFP。
3. 根据权利要求1所述的阳离子聚合物修饰的纳米磷酸钙基因载体的制备 方法，其特征在于所说的阳离子聚合物为聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、聚乙二醇一 接枝一聚乙烯亚胺或聚乙二醇一接枝一聚赖氨酸。
全文摘要
本发明公开了一种阳离子聚合物修饰的纳米磷酸钙基因载体的制备方法，步骤如下分别配置浓度为3～8mmol/l的氯化钙水溶液和2～5mmol/l的磷酸钠水溶液；将等体积的氯化钙水溶液和磷酸钠水溶液漩涡混合，加入质粒DNA水溶液，获得表面DNA稳定的磷酸钙纳米粒子水溶液；配置浓度为0.1～1mg/ml的阳离子聚合物水溶液，加入到表面DNA稳定的磷酸钙纳米粒子水溶液中，使阳离子聚合物分子含有的胺基与DNA分子含有的磷酸基团的摩尔比为0.5～3，混合均匀，即可。本发明通过阳离子聚合物修饰的纳米磷酸钙基因载体，可有效诱导DNA分子的缔合，具有高效无毒，可生物降解，是理想的基因传输载体之一。
文档编号C12N15/63GK101402966SQ200810122110
公开日2009年4月8日 申请日期2008年10月28日 优先权日2008年10月28日
发明者徐志学, 沈家骢, 王幽香, 胡巧玲 申请人:浙江大学