专利名称：体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞分化得到胰岛样细胞的方法，具体涉及一种体外诱导 人骨髓间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法。
背景技术：
糖尿病己成为继心血管疾病和肿瘤之后危害人身健康的第三大疾病，目前 胰岛移植是此病较好的治疗方法，但这种方法因胰岛来源匮乏和异体间的免疫
排斥反应而受阻。人骨髓间充质干细胞(hMSCs)可来源于糖尿病患者，取材方 便，容易进行体外分离、培养和扩增，若将hMSCs诱导分化为胰岛样细胞，可 彻底解决胰岛细胞来源和免疫排除反应问题，有望实现用自体细胞治疗糖尿病。 目前，体外诱导hMSCs向胰岛样细胞分化研究正处于探索阶段。李艳华等 (Journal of Cellular Physiology 2007， 211 (1) :36 - 44.)将胰腺-十二指 肠同源盒基因l(Pdxl)转入hMSCs，体外诱导其向胰岛样细胞分化，将2 3Xl(f 分化细胞移植于STZ诱导的糖尿病裸鼠肾被膜下，裸鼠血糖值降低到lOmmol/L 左右，裸鼠存活率为60%。贾延劫等(中国当代儿科杂志2003， 5(5): 395 - 397)、 李艳华等(自然科学通报，2003， 13 (6): 593 - 597)、 Chen等(World J Gastroenterol, 2004， 10 (20) : 3016 - 3020 ) 、 Tang等(Diabetes, 2004， 53:1721 - 1732)、刘雅娟等(吉林大学学报，2005， 31 (6): 836 - 838)、陆 琰等(暨南大学学报，2005， 26 (6): 729 - 733)、 Choi等(BiochemBiophys Res Co誦n， 2005， 330(4): 1299 - 1305)和Wu等(Chin J Diabetes 2006; 14(3): 230-232)通过改变培养条件的途径进行体外诱导hMSCs或鼠MSCs向胰岛样细 胞分化研究，其中Chen等、Tang等和Wu等将诱导细胞移植于糖尿病模型鼠体 内，虽然模型鼠血糖值均有不同程度的下降，但均未完全达到正常水平。
以上事实证明目前在体外诱导hMSCs分化为胰岛样细胞的方法比较多， 但是得到胰岛样细胞的胰岛素分泌量都较低，应用时效果都不够理想，即目前体外诱导hMSCs分化为胰岛样细胞的方法存在缺陷。
发明内容
本发明的目的在于提供一种体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为胰岛样细
胞的方法，能将hMSCs诱导分化为胰岛素分泌量高于文献报道的胰岛样细胞， 且应用于治疗糖尿病时效果非常好。
本发明的技术解决方案是 一种体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，其特殊之处 在于包括以下步骤
1) 将第4代人骨髓间充质干细胞用Minimum Essential Medium Alpha Medium(a-MEM)和质量百分数为10%胎牛血清(FCS)完全覆盖培养皿底，培 养至70%长满培养皿底备用；
2) 吸除a-MEM和质量百分数为10% FCS培养液，将培养皿置于37。C、 5% C02和饱和湿度的培养箱内，加入含4腿ol/L 巯基乙醇的高糖Dulbcco's Modifed Eagle Medium(DMEM)至完全覆盖培养皿底诱导1小时；目的是诱导 hMSCs向Nestin阳性细胞分化。
.3)吸除含4 mmol/L 巯基乙醇的高糖DMEM溶液，再加含10 ng/mL
表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和肝细胞生长因子(HGF)， 质量百分数为2% B27和4%胎猪胰腺提取液的高糖DMEM至完全覆盖培养皿底 诱导4 6天；目的是扩增Nestin阳性细胞。其中的胎猪胰腺提取液有防止Nestin 阳性细胞向神经细胞分化的作用，也有诱导Nestin阳性细胞向胰岛细胞分化、 聚集和成团的作用。
.4)吸除含10 ng/mL EGF、 bFGF和HGF，质量百分数为2% B27和4%胎猪胰 腺提取液的高糖DMEM溶液，再加入含10 ng/mL EGF和HGF， 10 mmol/L烟碱， 25 umol/L醋酸锌，质量百分数为2%胎牛血清(FCS)和4%胎猪胰腺提取液 的高糖DMEM诱导液至完全覆盖培养皿底，在培养箱内诱导4天；目的是诱导
5Nestin阳性细胞向胰岛细胞分化，形成胰岛样细胞团。其中的酩酸锌能满足|3 细胞在成熟和合成胰岛素过程中对锌离子的需要。
5)'吸除步骤4)的诱导液，再加入含K) nmol/L Exendin 4和胰高血糖素 样多肽--1 (GLP-1)， 25 umol/L醋酸锌，质量百分数为2% K'S和4%胎猪胰腺 提取液的低糖DMEM诱导液至完全覆盖培养皿底，在培养箱内诱3 2天，有 50.3 ± 9.4%的人骨髓间充质千细胞形成胰岛样细胞团；H的是促进胰岛内分 泌细胞成熟、促进胰岛素合成、修复P细胞对葡萄糖的敏感性。
所述胰岛样细胞团直径为125.8 ± 53.5 "m，含有148. 6上63. 4个胰岛
样细胞。.
上述步骤5)之后还包括胰岛样细胞团检验步骤，具休为用双硫腙(DTZ)染 色法检测胰岛样细胞团和部分未成团细胞。 '
i:述得到第4代人骨髓间充质干细胞的步骤具体是在实验室无菌获取流产 胎儿四肢长骨，纵向剪开骨髓腔，用a -MEM和质量百分数为2(mP(;S冲洗，1500 r/min离心10 min，弃上清，用a -MEM和质量百分数为濕FC),进行全骨髓细 胞培养；2天后半量换液，以后每3天换液1次；到梭形细胞80%长满皿底时1 : 3传代的人骨髓间充质千细胞。
上述得到第4代人骨髓间充质干细胞的步骤之后还包括检验第4代人骨髓 间充质干细胞步骤，具体是采用流式细胞仪检测其表面抗原标忐，表现为CD29、 CD44、 CD71、 CD105、 CD166间充质干细胞表面标志均为阳性，CD1 la、 CD14、 CD34、 CD45造血干细胞表面标志均为阴性。 .本发明的优点在于-
诱导方法各步骤易准确操控，且诱导得到胰岛样细胞量大，得到的胰岛样 细胞的胰岛素分泌量高于现有文献报道的胰岛样细胞，得到的胰岛样细胞应用 于治疗糖尿病时效果奇佳。
图1:胰岛样细胞团和部分未成团细胞被DTZ染色效果图，其中a为400倍显微镜下胰岛样细胞团染色效果图， 'b为200倍显微镜下胰岛样细胞团染色效果图， c为400倍显微镜下胰岛样细胞染色效果图； 图2:胰岛样细胞团的RT-PCR检测结果，
其中1道为胰高血糖素(236 bp)， 2道为j3-actin (553 bp)， 3道为GLUT-2 (395 bp)， 4道为胰多肽(337 bp)， 5道为胰岛素原(447 bp)，6道为生长抑 素(479 bp)， 7道为Marker;
图3:胰岛样细胞团的免疫组化分析结果，
其中a为胰岛样细胞团，胰岛素阳忭(XIOO)， b为胰岛样细胞团，GLUT-2 阳性(XIOO)， c为胰岛样细胞团，胰高血糖素阳性(Xl()())， d为胰岛样细胞 团，生长抑素阳性(XIOO)， e为胰岛样细胞团，胰多肽阳性(X'2(X))， f为胰 岛样细胞团和部分未成团细胞，Nestin阳性(X200);
图4:移植物组织切片在共聚焦荧光显微镜下的照片。
具体实施例方式
本发明公开一种由多种诱导物组合而成的分4歩诱导的新方法，其中胎猪 胰腺提取液和醋酸锌是首次采用的诱导成分。该方法能将hMSCs诱导分化为胰 岛素分泌量高于文献报道的胰岛样细胞，将其移植于STZ-诱导的糖尿病模型裸 鼠休内，裸鼠血糖值完全恢复到正常水平，裸鼠存活率达到〖00%。对照组裸鼠 全部死。。
本发明具体包括以下内容
采用由多种诱导物组合而成的新体系体外诱导hMSCs向胰岛细胞分化将 hMSCs培养至70呢长满皿底，依次采用以下4步在37'C、 5呢C0,培养箱内进行诱 导，每隔2天换液1次，共诱导10 12天。
第〗步采用含4mmol/L e -巯基乙醇的高糖DMEM诱^ 1小时； 第2步采用含10 ng/mL EGF、 bFGF和HGF，质量百分数为2%B27和4%胎 猪胰腺提取液的高糖DMEM诱导4 6天；
.第3步采用含IO ng/mL EGF和HGF， 1_0咖ol/L烟碱》 2b umol/L醋酸
7锌，质量百分数为2% FCS和4%胎猪胰腺提取液的高糖DMEM诱导4天；
第4步采用含10函1/L Exendin-4和GLP-1， 25請1/L醋酸锌，质 量百分数为2% FCS和4%胎猪胰腺提取液的低糖DMEM诱导2天。
诱导后大约有50%的细胞形成胰岛样细胞团。胰岛样细胞团和部分未成团 细胞用'DTZ染色呈强阳性(被染成深红色)，用RT-PCR和免疫组化检测有胰岛 素、生长抑素、胰多肽和胰高血糖素m腦A和蛋白质表达，并且在葡萄糖PBS溶 液刺激T分泌胰岛素和C-肽。
将获得的胰岛样细胞移植于STZ-诱导的糖尿病模型裸鼠体内，可使其血糖 水平恢复正常，治愈率达到100%,该方法有望用于治疗人的糖尿病。
实施步骤l: hMSCs分离、培养与鉴定
经患者和医院同意，取得新鲜流产胎儿。在实验室无菌获取流产胎儿四肢 长骨，纵向剪开骨髓腔，用ci-画和质量S分数为20%FCS冲洗，1500 r/min 离心10min，弃上清，用a-MEM和质量百分数为20%FCS进行全骨髓细胞培养。 2天后半量换液，以后每3天换液1次。到梭形细胞80%长满皿底时1 :. 3传代。 取第4代细胞，采用流式细胞仪检测其表面抗原标志，CD29、 a)44、 C！)71、 CD105、 CD166等间充质干细胞表面标志均为阳性，CDlla、 CD14、画、CD45等造血干 细胞表面标志均为阴性，以证明分离细胞是hMSCs。
实施步骤2:体外诱导hMSCs分化为胰岛细胞
将hMSCs培养至70%长满皿底，*采用4步诱导方法在37°C、 5% CU培养箱内 诱导hMSCs向胰岛细胞分化，每隔2天换液1次，共诱导10 12天。诱导后， 有50. 3 ± 9.4%的hMSCs形成胰岛样细胞团(直径为125.8 ± 53.5 u m，含 有148.6 ± 63.4个细胞)。胰岛样细胞团和部分未成团细胞用)TZ染色后呈深 红色，用RT-PCR和免疫组化法检测有胰岛素、生长抑素、胰多肽和胰高血糖素 基因表达。将2X10"胰岛样细胞分别用20、丄0和5 mmo丄/L葡萄糖PBS溶液刺 激1 h，胰岛素分泌量分别为320. 66 ± 30. 73、 89. 95 ± 21. 65和25. 99 ± 11. 07 U 1U/mL， C-肽分泌量分别为3. 42 ± 0. 48、 1, 55 ± 0. 13和0. 71 士 0.21 ng/mL， 均极显著高于对照组，且不同浓度葡萄糖刺激引起的胰岛素分泌量差异极显著， 证明胰岛样细胞对葡萄糖浓度变化有反应。
8实施歩骤3:体内移植治疗糖尿病实验 .
.(l).制作糖尿病动物模型挑选20只BaLb/c成年健康雄性裸鼠，按50 mg/kg (体重)'剂量腹腔注射STZ，每天1次，连续5天；最后一次注射后72h开始测 定空腹血糖，每天1次，连续3天；3次空腹血糖值均高于18 ,d/L者入模。 结果，20只裸鼠中有17只连续3次空腹血糖值均高于18 mmoVL,进入试验， 其余3只3次空腹血糖值中至少有l次低于18mmol/L，被淘汰。制模成功率为 85% (17細。
(2) 治疗糖尿病将17只糖尿病模型裸鼠随机分为三组试验组(7只) 每只右侧睾丸内注射CM-Dil标记的胰岛样细胞约1X105;对照组(5只)每只 右侧睾丸内注射CM-Dil标记的hMSCs约1 X iO5;空白对照组(5只)每只右侧 睾丸内注射等体积PBS。试验组7只裸鼠在移植胰岛样细胞后两周内血糖完全恢 复正常1月后摘除其中3只裸鼠的移植侧睾丸，裸鼠血糖值又升高到原来水平
(〉18mmol/L)，体重直线下降，在术后30d内死亡；其余4只裸鼠维持正常血 糖水平，恢复健康。两个对照组裸鼠持续高血糖，体重逐渐减轻，并在60d内 全部死亡。 -
(3) 移植物检测将摘除的移植侧睾丸制作石蜡切片，在共聚焦荧光显微 镜下观察，带红色荧光的移植细胞主要分布于曲细精管周围的睾丸间质区；用
胰岛素单抗和FITC标记的绿色荧光二抗进行免疫组化染色后，带绿色荧光的细 胞也分布于曲细精管周围的睾丸间质区，证明移植细胞生产胰岛素，而对照组 虽有移植细胞存在(有红色荧光)但不生产胰岛素(无绿色荧光)。
权利要求
1.一种体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，其特征在于包括以下步骤1)将第4代人骨髓间充质干细胞用α-MEM和质量百分数为10％胎牛血清完全覆盖培养皿底，培养至70％长满培养皿底备用；2)吸除α-MEM和质量百分数为10％胎牛血清培养液，加含4mmol/L β-巯基乙醇的高糖至完全覆盖培养皿底，将培养皿置于37℃、5％CO2和饱和湿度的培养箱内诱导1小时；3)吸除含4mmol/L β-巯基乙醇的高糖溶液，再加含10ng/mL表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和肝细胞生长因子，质量百分数为2％B27和4％胎猪胰腺提取液的高糖至完全覆盖培养皿底诱导4～6天；4)吸除含10ng/mL表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和肝细胞生长因子，质量百分数为2％B27和4％胎猪胰腺提取液的高糖溶液，再加入含10ng/mL表皮生长因子和肝细胞生长因子，10mmol/L烟碱，25μmol/L醋酸锌，质量百分数为2％胎牛血清和4％胎猪胰腺提取液的高糖诱导液至完全覆盖培养皿底，在培养箱内诱导4天；5)吸除步骤4)的诱导液，再加入含10nmol/L Exendin-4和胰高血糖素样多肽-1，25μmol/L醋酸锌，质量百分数为2％胎牛血清和4％胎猪胰腺提取液的低糖诱导液至完全覆盖培养皿底，在培养箱内诱导2天，有50.3±9.4％的人骨髓间充质干细胞形成胰岛样细胞团；所述胰岛样细胞团直径为125.8±53.5μm，含有148.6±63.4个胰岛样细胞。
2. 根据权利要求1所述体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方'法， 其特征在于上述步骤5)之后还包括胰岛样细胞团检验步骤，具体为用双硫腙 染色法检测胰岛样细胞团和部分未成团细胞。
3. 根据权利要求1或2所述体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为胰岛样细胞的 方法，其特征在于上述得到第4代人骨髓间充质干细胞的步骤具体是在实验室无菌获取流产胎儿四肢长骨，纵向剪开骨髓腔，用a-MEM和质量百分数为 20%胎牛血清冲洗，1500 r/min离心10 min，弃上清，用a -MEM和质量百分数 为20%胎牛血清进行全骨髓细胞培养；2天后半量换液，以后每3天换液1次； 到梭形细胞80%长满皿底时1 : 3传代的人骨髓间充质干细胞。
4.根据权利要求3所述体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法， 其特征在于上述得到第4代人骨髓间充质千细胞的步骤之后还包括检验第4 代人骨髓间充质干细胞步骤，具体是采用流式细胞仪检测其表面抗原标志，表 现为CD29、 CD44、 CD71、 CD105、 CD166间充质干细胞表面标志均为阳性，CDlla、 CD14、 CD34、 CD45造血干细胞表面标志均为阴性。
全文摘要
一种体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，包括四步诱导法把人骨髓间充质干细胞分化为胰岛样细胞，其中主要的诱导液中首次采用胎猪胰腺提取液和醋酸锌的诱导成分，分化为胰岛样细胞的胰岛素分泌量显著提高。该方法得到的胰岛样细胞有望突破目前糖尿病的技术难题，适用于实验研究以及以后的规模化生产。
文档编号C12N5/08GK101603027SQ20081015003
公开日2009年12月16日 申请日期2008年6月12日 优先权日2008年6月12日
发明者张翊华, 窦忠英 申请人:西北农林科技大学