专利名称：：发酵制备l-氨基酸的方法
技术领域：
：本发明涉及L-氨基酸
技术领域：
，尤其涉及一种发酵制备L-氨基酸的方法。
背景技术：
：L-氨基酸广泛应用于饲料工业、保健食品和医药工业。自1956年日本协和发酵公司用发酵法生产谷氨酸以后，氨基酸的发酵生产发展很快，到目前为止，绝大多数氨基酸已能用发酵法和酶法生产。近年来，随着经济的发展，人民生活水平的逐步提高，人们对健康方面给于越来越多的关注，L-氨基酸的需求量也在逐年上升。但是大多数L-氨基酸的发酵产酸水平较低，生产成本较高，抑制了L-氨基酸的应用。因此，提高L-氨基酸的产酸率具有非常重要的现实意义。中国专利CN101235401公开了一种发酵制备L-氨基酸的方法，为了提高收率和降低成本，它以甜菜碱磷酸盐为发酵助剂，取得了较好的效果。但是，以甜菜碱磷酸盐为发酵助剂，由此制得的L-氨基酸中必然含有磷的成分，在安全性要求较高的保健食品和医药行业，往往不能直接应用。
发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种发酵制备L-氨基酸的方法，以提高L-氨基酸的收率并降低生产成本，由此制得的L-氨基酸，可直接应用在安全性要求较高的保健食品和医药行业。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是发酵制备L-氨基酸的方法，包括用于培养种子培养基的步骤，用于将发酵菌接种于所述种子培养基得到种子的步骤，用于培养发酵培养基的步骤，用于将所述种子接入所述培养发酵培养基进行发酵的发酵步骤，在所述发酵培养基的培养步骤中或在所述的发酵步骤中用盐酸甜菜碱、无水甜菜碱或一水甜菜碱作为发酵助剂。其中，所述发酵助剂在发酵液中的浓度为0.05~2.5g/dl。由于在所述发酵培养基的培养步骤中或在所述的发酵步骤中用盐酸甜菜3碱、无水甜菜碱或一水甜菜碱作为发酵助剂，明显提高了L-氨基酸的收率，降低了生产成本，而且盐酸甜菜碱、无7jC甜菜碱或一水甜菜碱都不含有磷成分，因而由其生产的L-氨基酸可直接应用在安全性要求较高的保健食品和医药行业。具体实施例方式在未特别注明的情况下，以下实施例培养基中各组分含量的单位均为g/dl，g/dl是发酵行业中惯用的单位，dl表示分升,ldl=100ml。种子培养基葡萄糖3，玉米浆3,豆浓2,K2HP040.15,MgS04'7H200.04，尿素0.2,pH调至7.0-7.2,在115。C下，加热15分钟进行灭菌。将黄色短杆菌ATCC14067接种于5L种子罐中，在32。C下，振荡培养9小时。谷氨酸发酵培养基葡萄糖14，糖蜜0.1,Na2HPO40.16,KC10.12,MgS047H200.08，FeS04*4H200.0002，MnS040.0002，维生素20mug/l。取上述培养基6份，每份3L，在6份培养基的发酵液中分别添加0.05、0.1、0.15、0.2、0.25和0.3的盐酸甜菜碱，调整pH至7.0。将每一份3L培养基放入一个5升的发酵罐中，在115。C下，加热15分钟进行灭菌。其中，盐酸甜菜碱的结构式分子式C5H14N02C1;分子量153.61;物理性能白色至微黄色结晶性粉末，无气味，味酸涩，具吸潮性，极易在每个发酵罐中接入300ml按上述培养得到的种子，通气培养，温度为34°C。在培养过程中，采用氨水调节培养基的pH,使其维持在7.2,同时，持续实施例1:溶于水。补加重量百分比浓度70%的葡萄糖水溶液，使糖浓度控制在1-2g/dl(按葡萄糖计算)。发酵培养30小时后，停止加入葡萄糖，再过2小时后，发酵完毕。测定培养基中积累的谷氨酸含量，结果见表1。表1.<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>实施例2:种子培养基葡萄糖3，玉米浆3，豆浓2，K2HP040.15，MgS04'7H200.04，尿素0.2，pH调至7.0-7.2，在115。C下，加热15分钟进行灭菌。将黄色短杆菌ATCC14067接种于5L种子罐中，在32。C下，振荡培养9小时。L-谷氨酸发酵培养基:葡萄糖14，糖蜜0.1,Na2HP040.16，KC10.10,MgS04'7H200.08,FeS04'4H200.0002，MnS040.0002，维生素20mug/1,调整pH至7.0。取上述培养基5份，每份3L,将每一份3L培养基放入一个5升的发酵罐中，在115。C下，加热15分钟进行灭菌。在每个发酵罐中接入300ml按上述培养得到的种子，通气培养，温度为34。C。在培养过程中，采用氨水调节培养基的pH,使其维持在7.2,同时，持续补加重量百分比浓度70%的葡萄糖水溶液，使糖浓度控制在1-2g/dl(按葡萄糖计算)。分别在发酵培养的0、3、8、14和18小时，按照0.15g/dl的比例添加盐酸甜菜碱，培养30小时后，停止加入葡萄糖，再过2小时后，发酵完毕。5测定培养基中积累的谷氨酸含量，结果见表2。表2.<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实施例3:种子培养基葡萄糖2.5，(NH4)2S040.5,KH2PO40.1,MgS04'7H200.05，玉米浆3.5-4.0,CaC031.0，pH调至7.0-7.2,0.IMpa压力下灭菌20分钟。将黄色短杆菌ATCC14067接种于5L种子罐中，在31。C下，振荡培养12h。L-赖氨酸的发酵培养基葡萄糖18,(NH4)2SO450，KH2P040.1，KC10.12，MgS04*7H200.5，玉米浆0.5-1.5,L-苏氨酸0.4,CaC034.0。取上述培养基6份，每份3.6L,在6份培养基的发酵液中分别添加0.05、0.1、0.15、0.2、0.25和0.3的盐酸甜菜碱，调整pH至7.0-7.2，将每一份3.6L培养基放入一个7升的发酵罐中，0.07Mpa压力下灭菌8分钟。在每个发酵罐中接入360ml按上述培养得到的种子，通气培养，温度为30€。在培养过程中，采用氨水调节培养基的pH，使其维持在6.7,同时，持续补加70%的葡萄糖水溶液，使糖浓度控制在3-4g/dl(按葡萄糖计算)。发酵培养72小时，L-赖氨酸的产量见表3。表3.<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例4:种子培养基葡萄糖2.5，(NH4)2S040.2,尿素0.2，KH2P040.15,MgS047H200.04,FeS(WH200.001,MnS04'4H200.001，维生素lOOmug/l，生物素30(kug/l,调整pH至7.0，灭菌。将黄色短杆菌FERM-P4164接种于5L种子罐中培养12小时。L-苏氨酸的发酵培养基:葡萄糖8，KH2P040.25,MgS04'7H200.04,(NH4)2S042.0，MnS04'4H200.001，FeS04'4H200.001，生物素50mug/l，维生素B,5mug/l。取上述培养基6份，在6份培养基的发酵液中分别添加0.05、0.1、0.15、0.2、0.25和0.3的盐酸甜菜碱，调整pH至7.0。在114。C下，蒸汽灭菌15分钟。按1。/。的接种量将上述培养好的种子液分别接入一个10L发酵罐中，发酵培养36小时，L-苏氨酸的产量见表4。表4盐酸甜菜碱的添加量(g/dl)L-苏氨酸的量(g/dl)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例5:种子培养基葡萄糖2.5，(NH4)2S040.5，玉米浆3，KH2P040.1，MgSO7H200.05，CaC031，调整pH至7.0，灭菌。将谷氨酸4奉杆菌FERM-P7274接种于5L种子罐中，在3(TC下培养24小时。L-精氨酸的发酵培养基:葡萄糖12.5，(NH4)2S043.0,KH2P040.15,MgS047H200.05,玉米浆1，CaC033.0。取上述培养基6份，在6份培养基的发酵液中分别添加O.05、0.1、0.15、0.2、0.25和0.3的盐酸甜菜碱，调整pH至7.0，在114。C下，蒸汽灭菌15分钟。按10°/的接种量将上述培养好的种子液分别接入一个IOL发酵罐中，发酵培养96小时，L-精氨酸的产量见表5。表5<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>实施例6:种子培养基蔗糖3.0，KH具O.15，MgS(WH200.04,FeS04'7H200.001，MnS04*4H200.OOl,醋酸铵0.3,尿素0.2，豆饼水解液0.2，VH0.2mg，VB,0.3mg,调整pH至7.0，在每个500ml的三角瓶中装入55ml培养基，0.075Mpa压力下灭菌20分钟。将黄色短杆菌FERM-P3672接种于三角瓶中，在31。C下振荡培养45小时。L-异亮氨酸的发酵培养基:葡萄糖14.5,(NH4)2S042.5,KH2P040.22,K2HP040.1,MgS04*7H200.04，FeS04*7H200.0015,MnS04'4H200.0015,豆饼水解液0.2，VH0.01mg/dl，VB!0.25mg/dl，Met3mg/dl。取上述培养基6份，在6份培养基的发酵液中分别添加0.05、0.1、0.15、0.2、0.25和0.3的盐酸甜菜碱，调整pH至7.1,在0.075Mpa压力下，蒸汽灭菌20分钟。按10%的接种量将上述培养好的种子液分别接入一个5L发酵罐中，发酵培养80小时，L-异亮氨酸的产量见表6。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例7:种子培养基葡萄糖3.0,玉米浆3,酵母粉0.5,KH2PO40.1,MgS04*7H200.04，MnS04*4H200.001,VHO.01mg/dl，VB!0.02mg/dl,调整pH至7.0，在每个500ml的三角瓶中装入30ml培养基，0.IMpa压力下灭菌15分钟。将黄色短杆菌FERM-P512接种于三角瓶中，在32。C下振荡培养16小时。L-缬氨酸的发酵培养基:葡萄糖8，(NH4)2S040.6,KH2PO40.12,MgS04'7H200.O4,MnS04*4H200.001，蛋氨酸0.05,豆饼水解液2,玉米浆2.5,VH0.Olmg/dl,VB,0.02mg/dl。取上述培养基6份，在6份培养基的发酵液中分别添加O.05、0.1、0.15、0.2、0.25和0.3的盐酸甜菜碱，调整pH至7.0，在0.075Mpa压力下，蒸汽灭菌15分钟。按10%的接种量将上述培养好的种子液分别接入一个IOL发酵罐中，发酵培养72h,L-缬氨酸的产量见表7。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>实施例8:种子培养基葡萄糖3.0,(NH4)2S040.5，玉米浆4.0,豆饼水解液2.0,KH2P040.l,MgS04'7H200.04,FeS04,7H200.001,MnS04MH200.001,VH0.02mg/dl,VB!0.03mg/dl,调整pH至7.0,0.075Mpa压力下灭菌15分钟。将谷氨酸棒杆菌FERM-P7128接种于500ml三角瓶中，在32。C下振荡培养16小时。L-色氨酸的发酵培养基:葡萄糖13，(NH4)2S044，KH2P040.1,MgS(WH200.04，MnS04MH200.001，FeS04'7H200.001,豆饼水解液2.5,玉米浆2.2，VH0.005mg/dl,VB!0.01mg/dl。取上述培养基6份，在6份培养基的发酵液中分别添加O.05、0.1、0.15、0.2、0.25和0.3的盐酸甜菜碱，调整pH至7.0,在0.075Mpa压力下，蒸汽灭菌15分钟。按10%的接种量将上述培养好的种子液分别接入一个5L发酵罐中，发酵培养，L-色氨酸的产量见表8。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>0.31.20实施例9:种子培养基葡萄糖3,玉米浆3,豆浓2,K2HP040.15，MgS04*7H200.04，尿素0.2,pH调至7.0-7.2，在115。C下，加热15分钟进行灭菌。将黄色短杆菌ATCC14067接种于5L种子罐中，在32。C下，振荡培养9小时。另外，谷氨酸发酵培养基葡萄糖14，糖蜜0.1,Na2HP040.16，KC10.12,MgS04*7H200.08,FeS04*4H200.0002,MnS040.0002，维生素20mug/l。取上述培养基6份，每份3L，在6份培养基的发酵液中分别添加0.05、0.1、0.15、0.2、0.25和0.3的无水甜菜碱，调整pH至7.0,分别将一份3L培养基放入一个5升的发酵罐，在115。C下，加热15分钟进行灭菌。其中，无水甜菜碱的结构式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>分子式C5HN02;分子量117.05;物理性能白色结晶性粉末，无气味，味甜，具吸潮性，极易溶于水。在每个发酵罐中接入300ml按上述培养得到的种子，通气培养，温度为34°C。在培养过程中，采用氨水调节培养基的pH，使其维持在7.2,同时，持续补加重量百分比浓度70%的葡萄糖水溶液，使糖浓度控制在l-2g/dl(按葡萄糖计算)。发酵培养30小时后，停止加入葡萄糖，再过2小时后，发酵完毕。测定培养基中积累的谷氨酸含量，结果见表9。表9.<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>0.113.40.1512.70.212.50.2511.70.311.2实施例10:种子培养基葡萄糖3，玉米浆3，豆浓2，K2HP040.15，MgS04'7H200.04，尿素0.2,pH调至7.0-7.2,在115。C下，加热15分钟进行灭菌。将黄色短杆菌ATCC14067接种于5L种子罐中，在32。C下，振荡培养9小时。另外，谷氨酸发酵培养基葡萄糖14，糖蜜0.1,Na2,40.16,KC10.12,MgS04'7H200.08,FeS04MH200.0002,MnS040.0002，维生素B,20mug/l。取上述培养基6份，每份3L,在6份培养基的发酵液中分别添加0.05、0.1、0.15、0.2、0.25和0.3的一水甜菜碱，调整pH至7.0,分别将一份3L培养基放入一个5升的发酵罐，在115。C下，加热15分钟进行灭菌。其中，一7jc甜菜碱的结构式o分子式C5H13N03;分子量135.16;物理性能白色至微黄色结晶性粉末，无气味，味甜，具吸潮性，极易溶于水。在每个发酵罐中接入300ml按上述培养得到的种子，通气培养，温度为34°C。在培养过程中，采用氨水调节培养基的pH，使其维持在7.2,同时，持续补加重量百分比浓度70%的葡萄糖水溶液，使糖浓度控制在1-2g/dl(按葡萄糖计算)。发酵培养30小时后，停止加入葡萄糖，再过2小时后，发酵完毕。测定培养基中积累的谷氨酸含量，结果见表io。表10.<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>本发明不局限于上述实施例，根据底物的不同，发酵条件也有所改变。发酵温度控制在20-4(TC的范围之内，优选28-40。C。pH值控制在7.0-7.2。发酵在有氧条件下进行，需要搅拌或振荡。发酵时间l-7天。对于氨基酸的分离纯化，可釆用离子交换方法。本发明适用的L-氨基酸包括L-谷氨酸，L-赖氨酸，L-精氨酸，L-异亮氨酸，L-缬氨酸，L-苏氨酸，L-组氨酸，L-苯基丙氨酸，L-色氨酸，L-丝氨酸，L-鸟氨酸，L-瓜氨酸，L-酪氨酸和L-亮氨酸。本发明适用的碳源包括糖类如葡萄糖，蔗糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，粗糖，糖化的淀粉液；脂肪酸类如乙酸，丙酸，苯曱酸；有机酸类如丙酮酸，柠檬酸，琥珀酸，富马酸，苹果酸；醇类如乙醇，丁醇。本发明适用的氮源包括有机氮源如豆浓，玉米浆，尿素，酵母粉，豆饼水解液；无机氮源如疏酸铵，氯化铵，硝酸铵，醋酸铵，液氨，氨水。本发明的发酵培养基可以使用以下各种无机盐磷酸盐、镁盐、钙盐、钾盐、钠盐、铁盐、锰盐以及其他微量金属盐。本发明的发酵培养基可以使用以下各种维生素生物素、硫胺素、烟酰胺等。本发明适用于以下各种相应氨基酸的发酵菌L-谷氨酸发酵菌如双歧杆菌ATCC14020，黄色短杆菌ATCC14067,乳酸发酵短杆菌ATCC13869,乳酸发酵短杆菌FERM-P5012,嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870,谷氨酸棒杆菌ATCC13032等；L-赖氨酸发酵菌如黄色短杆菌ATCC14067，黄色短杆菌FERM-P1708,谷氨酸棒杆菌FERM-P1709，乳酸发酵短杆菌FERM-P1712,乳酸发酵短杆菌FERM-P1711，黄色短杆菌ATCC21475，谷氨酸棒杆菌ATCC12416,乳酸发酵短杆菌ATCC1470,醋麸酸棒状杆菌ATCC11472等；L-谷氨酸盐发酵菌如黄色短杆菌FERM-P4272，嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870，黄色短杆菌FERM-BP662，醋麸酸棒状杆菌ATCC13870,谷氨酸棒杆菌FERM-BP663等；L-精氨酸发酵菌如黄色短杆菌FERM-P4948,谷氨酸棒杆菌FERM-P7274,黄色短杆菌NRRL12235，醋麸酸棒状杆菌NRRL12239等；L-苯基丙氨酸发酵菌如乳酸发酵短杆菌FERM-P5417，黄色短杆菌FERM-P1916,谷氨酸棒杆菌ATCC21670，柠檬酸节杆菌ATCC21422，乳酸发酵短杆菌ATCC21420,嗜乙酰乙酸才奉杆菌ATCC21421,黄色短4干菌NRRL12269;L-苏氨酸发酵菌如大肠埃希氏菌FERM-P4900，谷氨酸棒杆菌FERM-P5835,黄色短杆菌FERM-P4164,乳酸发酵短杆菌FERM-P4180，黄色短杆菌ATCC21269,嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC21270等；L-异亮氨酸发酵菌如黄色短杆菌FERM-P3672,乳酸发酵短杆菌FERM-P4192,谷氨酸棒杆菌FERM-P756，谷氨酸棒杆菌FERM-P757,谷氨酸棒杆菌FERM-P758，黄色短杆菌FERM-BP759,黄色短杆菌FERM-BP760等；L-组氨酸发酵菌如黄色短杆菌FERM-P2317,乳貌t酵短杆菌FERM-P1565,谷氨酸棒杆菌ATCC14297,乳酸发酵短杆菌ATCC21086，嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC21407,黄色短杆菌ATCC21406，枯草芽孢杆菌FERM-BP217，柠檬酸节杆菌ATCC21412等；L-缬氨睃发酵菌如乳^酵短杆菌FERM-P1845,黄色短杆菌FERM-P512，乳酸发酵短杆菌FERM-P1968,大肠杆菌NRRL12285等；L-丝氨酸发酵菌如乳酸发酵短杆菌FERM-P1371;L-鸟氨酸发酵菌如乳酸发酵短杆菌FERM-P5936，谷氨酸棒杆菌FERM-P5644，柠檬酸节杆菌ATCC21040，谷氨酸棒杆菌ATCC13232等;L-瓜氨酸发酵菌如谷氨酸才奉杆菌FERM-P5643，黄色短杆菌FERM-P1645等；L-酪氨酸发酵菌如谷氨酸棒杆菌FERM-P5836,黄色短杆菌FERM-P7914，枯草芽孢杆菌FERM-P6758等；L-色氨酸发酵菌如枯草芽孢杆菌FERM-P5286，乳酸发酵短杆菌FERM-P7127,黄色短杆菌FERM-P2551,谷氨酸棒杆菌FERM-P7128,黄色短杆菌ATCC2"27,黄色短杆菌FERM-BP114，枯草芽孢杆菌FERM-BP208，黄色短杆菌FERM-BP475，谷氨酸棒杆菌，枯草芽孢杆菌FERM-BP200等；L-亮氨H酵菌如乳酸发酵短杆菌FERM-P1769，黄色短杆菌FERM-P420,谷氨酸棒杆菌FERM-P1966，黄色短杆菌FERM-BP755，谷氨酸棒杆菌FERM-BP756,谷氨酸棒杆菌FERM-P757,黄色短杆菌FERM-BP759等。权利要求1.发酵制备L-氨基酸的方法，包括用于培养种子培养基的步骤，用于将发酵菌接种于所述种子培养基得到种子的步骤，用于培养发酵培养基的步骤，用于将所述种子接入所述培养发酵培养基进行发酵的发酵步骤，其特征在于在所述发酵培养基的培养步骤中或在所述的发酵步骤中用盐酸甜菜碱、无水甜菜碱或一水甜菜碱作为发酵助剂。2、根据权利要求l所述的发酵制备L-氨基酸的方法，其特征在于所述发酵助剂在发酵液中的浓度为0.05~2.5g/dl。全文摘要本发明公开了一种发酵制备L-氨基酸的方法，包括用于培养种子培养基的步骤，用于将发酵菌接种于所述种子培养基得到种子的步骤，用于培养发酵培养基的步骤，用于将所述种子接入所述培养发酵培养基进行发酵的发酵步骤，在所述发酵培养基的培养步骤中或在所述的发酵步骤中用盐酸甜菜碱、无水甜菜碱或一水甜菜碱作为发酵助剂。本发明可明显提高L-氨基酸的收率，降低生产成本，由其生产的L-氨基酸可直接应用在安全性要求较高的保健食品和医药行业。文档编号C12P13/04GK101423851SQ20081016001公开日2009年5月6日申请日期2008年11月7日优先权日2008年11月7日发明者刘世普,吴品芳,马兴群申请人:潍坊祥维斯化学品有限公司