产生ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或其内酰胺的重组细胞的制作方法

专利名称：：产生ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或其内酰胺的重组细胞的制作方法
技术领域：
：本发明涉及相对于其野生型转基因的细胞；转基因细胞的制备方法，以及可通过该方法获得的细胞；co-氨基羧酸、co-氨基羧酸酯或者从o)-氨基羧酸衍生的内酰胺的制备方法，以及可通过该方法获得的co-氨基羧酸、co-氨基羧酸酯或者从C0-氨基羧酸衍生的内酰胺；基于CD-氨基羧酸或者内酰胺的聚酰胺的制备方法，以及可通过该方法获得的聚酰胺。
背景技术：
：聚鹏安是是其重复单元(单体)具有酰胺基作为特征的聚合物。"聚酰胺"这一名称通常作为合成工程使用的热塑性塑料的名称，并且以此将该物质，区别于具有类似化学结构的蛋白质。几乎所有重要的聚酰胺均从伯胺衍生而来，也就是在其重复单元内均会出现官能团-C0"NH-。此外也存在源于仲胺(-C0"NR-，R=有机基团)的聚酰胺。尤其可将氨基羧酸、内TO和/或二胺和二元羧酸作为聚酰胺的单体。基于内酰胺制备聚駒安的方法尤为重要。例如，可通过幵环聚合e-己内酰胺来获得工业上常用的产品"聚酰胺6",而通过开环聚合月桂内酰胺则可获得工业上同样重要的"聚酰胺12"。内酰胺的共聚物也有很大的工业意义，例如e-己内酰胺和月桂内酰胺的共聚物("聚酰胺6/12")。s-己内酰胺的制备通常是让环己酮与硫酸氣盐或者羟胺盐酸盐进行反应形成环己酮肟，通过Beckmann重排法将其转换淑-己内,安，通常使用浓硫酸作为催化剂。通常通过环己烷与空气氧的催化氧化反应来制备环己酮，通ii^的加氢反应获得环己烷。月桂内,安的制备特别费事。其工业规模的制备方法为首先使丁二烯进行三聚反应形成环十二碳三烯。接着对环十二碳三烯进行加氢反应形成环十二烷，然后对以此得到的环十二烷氧化得到环十二酮。然后将以此获得的环十二酮与l劲安进行反应形成环十二酮躬，然后再利用Beckm朋n重排法将其转换成月桂内,。这些由现有技术已知的利用Beckmann重排法由酮躬制备内,的方法的缺点在于-会形成大量的必须加以处置的盐类副产物，例如硫鹏内。因此在现有技术条件下，也有人对没有这些缺点的其它内翻安制备方法进行了描述。例如专利EP-A-0748797就描述了一种用二腈制备内,安的方法，即对二腈进行加氢反应形成氨基腈，然后通过环化水解使得氨基腈转变成内,安。按照该发明所述，使用例如酸性沸石、硅酸盐和非沸石分子筛的分子筛、金属磷,和金属氧化物或者混合金属氧化物作为环化7k解的催化剂。但是该方法的主要缺点在于ilii环化水解使氨基腈转变的选择性很小，因此会形成大量的副产物。除此之外，按照现有技术描述的这种内,安制备方法，要^1汽油或石油获得的苯或者丁二烯之类的碳氢化合物，因此源自于不可再生的原料。因此从生态角度来看，基于这样制备的内酰胺制备聚酰胺的方法存在缺点。
发明内容本发明的任务在于，克服现有技术的缺点。本发明的任务尤其在于阐述一种可以用尽可能少的方法步骤，并且在副产物尽可能少的情况下形成内,安尤其是月桂内酰胺的方法。本发明的另一项任务就是阐述一种能够使用可再生原料制备内酰胺尤其是月桂内,安的方法。有助于解决上述任务的是一种细胞，该细胞相比于其野生型以如下方^a行基因工程修饰使得该细胞肖,比其野生型由羧酸或羧酸酯产生更多的co-氨基羧酸、co-氨基羧酸酯，或者产生更多从ca-氨基羧酸衍生而来的内,。可以4顿这种细胞以发酵方法制备由羧酸繊酸酯(例如月桂酸或月桂酸酯)来制^co-氨基羧酸、co-氨基羧酸酯，或者从co-氨基羧酸衍生而来的内,安。"使得该细胞能够比其野生型由羧酸離酸酯产生更多的co-氨基羧酸、w-氨基羧酸酯，或者产生更多从co-氨基羧酸衍生而来的内酰胺"这一^M也涉及这种情况，即转基因细胞的野生型根本不能形fc-氨基羧酸、co-氨基羧酸酯，或者不能形成从co-氨基羧酸衍生而来的内酰胺，至少不能形成可检出数量的这些化合物，且只有经过转基因(gentechnischenVer^nderung)之后，才能形成可检出数量的这些成分。所谓"野生型"细胞，尤其指其基因组(Genom)处在自然进化状态的细胞。这一概念既可用于整个细胞，也可用于单个的基因。因此"野生型"这一并不包括那些人类利用重组方法至少部分改变了其基因序列的细胞或者基因。按照本发明优选的是，对转基因细胞进行如下方式的基因工程修饰，使其兽滩在限定的时间间隔之内，皿在2小时之内，更雌在8小时之内，且最优选在24小时之内，形成为野生型细胞的至少2倍之多、尤其至少10倍、此夕Ht选至少100倍、此外更,至少1000倍以及最好^M至少10000倍的co-氨基羧酸、co-氨基羧酸酯或者从(o-氨基羧酸衍生而来的内酰胺。例如可ilii下述方式测定形成产物的增加量在相同条件下(相同的细胞密度，相同的培养基(船hrmedium)，相同的培养条件)，将本发明所述的细胞与野生型细胞在适当的培养基中培养一定的时间，然后测定培养基内的目标产物含量(co-氨基羧酸、co-氨基羧酸酯或者从co-氨基羧酸衍生而来的内,)。本发明所述的细胞可以是原核生物或At亥生物。其可以是哺乳动物细胞(如人的细胞)、植物细胞或者如酵母、真菌或细菌之类的微生物，其中微生物是尤其im的，且细菌和酵母是最为的。适合作为细菌、酵母或真菌的尤其是DeutschenSammlungvonMikroorganis固undZellkulturenGmbH(德国微生物与细胞培养菌种保藏中心)(DSMZ)作为细菌、酵母或真菌菌株保存的那些细菌、酵母或真菌。本发明所述的适用细菌属于下列网站上列出的种类http:〃www.dsmz.de/species/bacteria.htm本发明所述的适用酵母属于下列网站上列出的种类http:〃www.dsmz.de/species/yeasts.htm本发明所述的适用真菌属于下列网站上列出的种类http:〃www.dsmz.de/species/fungi.htm本发明所述特别适用的细胞来自于棒状杆菌属(^02"//^^"^^〃边)、短杆菌属(i9rer/力a"er/"迈)、雜杆菌属(&ci77"s)、乳酸杆菌属aa"oZac/"ws)、乳球菌属aa"ococcws)、假丝酵母属(C朋力Va)、毕赤酵母属(/Vc力/a)、克鲁维氏酵母属(A7"Keroz^c")、糖酵母属(^cc/aro迈/ces)、埃希氏菌属(^sc/e"'c力、发酵单孢菌属(Z/迈o迈o"as)、耶氏酵母属(^/ro"a)、甲基杆菌属(/f/et/^/o^cz^i"/"边)、劳尔氏菌属(/Wsto//a)、假单胞菌属(/^ei/c/o边o/73s)、伯克霍尔德菌属(^"r;ir力o/yer/3)以及梭菌属(6VoWr/力》迈)，其中特别适用的是大肠杆菌(&c力er/c力/aco//)、谷氨酸棒状杆菌(Car/Z7e力3(^er/w迈^7w/^边/c"边)和恶臭假单胞菌(/^ewy。迈oy7as/〃"iya),最为适用的是大肠杆菌(&c力er/c力/aco//)。按照本发明所述细胞的一种优选实施方案，该细胞与其野生型相比，具有至少一种下述酶的增强活性i〉酶E,，鄉羧酸或者羧酸酷催化转换淑目应的co-羟基羧酸或者(0-羟基羧酸酯；ii)酶E，期每co-羟基羧酸或者(o-羟基羧酸酯催化转换成相应的co-氧代羧酸或者co-氧代羧酸酯；iii)酶E,，期各co-氧代羧酸或者co-氧代羧酸酯催化转换成相应的co-氨基羧酸或者co-氨基羧酸酯。"酶的增强活性"这一概念，例如就，酶E,及随后实施方案中所使用的酶E',等等而言，,理解为细胞内的活性增强。下，来提高细胞内酶活性的实施方案既适用于提高酶E,的活性，也适用于任，能提高其活性的所有随后提及的酶。原则上可以提高酶活性的方式为提高用来编码酶的一个或多个基因序列的拷贝数、使用强启动子，或者使用针对相应的酶以增强活性进行编码的基因或者等位基因和视需要这些措施的组合。例如可Mii转化、转导、接合作用，或者将这些方法与一种载体结合起来产生本发明所述的转基因细胞，所述载体含有所需的基因、该基因的等位基因或者其部分和含有肖滩表达该基因的载体。尤其可将基因或者等位基因整合入细胞染色体，或者整合在染色体外复制的载体之中，从而实现异源表达。专利DE-A-10031999以丙酮酸羧化酶为例，m^了增强细胞内酶活性的可能方法，本发明将该文献以参考的形式引入，因此该专利关于细胞内酶活性增强的可能方法的公开内容构成本发明公开的一部分。可借助一维及二维蛋白质;鹏分离法，然后1OT相应的分析软件来光学鉴定凝胶内的蛋白质浓度，检测上述以及下述所有酶或基因的表达。如果仅仅以增强基因表达为基础来增强酶活性，就能以简单的方式，通过比较野生型和转基因细胞之间的一维或二维蛋白质分离结果，定量测定酶活性的增强水平。制备,杆菌的蛋白质凝胶以及鉴定蛋白质的常见方法是Hermann等人(^7ectrop力orew's,22:1712.23(2001))所描述的方法。同样也可以使用待检蛋白质的特异性抗体进行Western-Blot-Hybridisierung(Western印迹杂交)(S柳brook等人，#。/ecw/ar"0/7//7fa/a6orator/迈朋t/a/,(分子克隆实验室手册)第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,美国纽约ColdSpringHarbor,1989),然后使用相应的浓度测定软件进行光学分析(Lohaus和Meyer(1989)Biospektrum杂志第5期第32-39页；Lottspeich(1999),麵簡威eC力e迈/e(应用化学)第111期第2630~2647页)，从而分析出蛋白质浓度。可以利用DNA条带转移分析(DNA-Band-Shift-Assays)(也称作凝胶阻滞分析)来湖啶DNA结合蛋白的活性(Wilson等人(2001)/o"靡/。"a"e"'o/og/(细菌学杂志)第183期第2151-2155页)。tel报道基因分析法所述的各种方法，可以很好地检测DNA结合蛋白对其它基因表达的影响(S柳brook等人，C/o///7f37a力orator/迈a/7i/a厶第2版.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y,USA,1989)。可以根据各种所述的方法测定细胞内酶活性(Donahue等人(2000)/o"/va70/^3"er/o/o《/(细菌学杂志)第182巻第19期第5624-5627页;Ray等人(2000)加，/。/ten'o7^/(细菌学杂志)第182巻第8期第2277-2284页；Freedberg等人(1973)/卯/77^of^"er2'o/o^r(细菌学杂志)第115巻第3期第816-823页)。如果在下述实施方案中没有指明某种酶活性的具体测定方法，贝iKm利用Hermann等人在2001年Electophoresis(电泳技术杂志)第22期第1712-23页、Lohaus等人在蘭年Bio印ektrum杂志第5期第32-39页、Lottspeich在1999年力/^e伊朋WeC力e边/e(应用化学杂志)第111期第2630"2647页以及Wilson等人在2001年/ow/va/^"er/o/c^/(细菌学杂志)第183期第2151-2155页上所描述的方法，来测定酶活性的增强水平，也可测定酶活性的减弱程度。如mil31内源基因突变来增强酶活性，则要么根据经典方法以无定向方式产生此类突变(例如通过紫外辐射或者能引起突变的化学药剂)，或者利用诸如删除、插入、禾卩/或核苷酸交换之类的基因工程方法来有目的地实现。M这些突变方法可获得转基因细胞。特别优选的酶突变体尤其也可以是那些不可以反馈抑制的，或者与野生型酶相比反馈抑制能力有所减少的酶。如果以增强,达水平的方式来增强酶活性，则可以例如增大相应基因的拷贝数，或者使得结构基因上游的启动子和调节区(Regulationsregion)发生突变。植入在结构基因上游的,盒以相同方式发挥作用。,可诱导的启动子还可以在任何时刻提髙表达水平。此外，也可以将所谓"增强子"分配给酶基因作为调节序列，这些增强子可改善RNA聚合酶与DNA之间的相互作用，因此同样也可增强基因表达。采用延长m-RNA寿命的措施同样也可改善表达水平。此外，阻止酶蛋白，同样也可增强酶活性。基因或基因构建体要么存在于具有不同拷贝数的质粒之中，或者整合在染色体内并在其中扩增。备选地，还可以Mil改变培养基组成以及培养进程的方式，达到相关基因的过度表达。专业人士可在下述文献中查阅相关说明:Martin等人(19S7年^'o/Tec力"o/ow(生物/技术杂志)第5期第137-146页)、Guerrero等人(1994年^e/e(基因杂志)第138期第35-41页)、Tsuchiya和Morinaga(1988年5/0/rec力"0/0《(生物/技术杂志)第6期第428-430页)、Eikmanns等人(1991年(e"e(基因杂志)第102期第93-98页)、EP-A-0472869、US4,601,893、Schwarzer禾口PUhler(1991年i9/o/rec力/7o7M(生物/技术杂志)第9期第84-87页)、Reinscheid等人(1994年/4p/7/e^a/7^^V7KJ'ro/7迈e/t3/JZ/croAioJog/(应用与环境微生物学杂志)第60期第126-132页)、LaBarre等人(199(3年/o"r加/o/i9acter/070《/(细菌学杂志)第175期第1001-1007页)、WO"A-96/15246、Malumbres等人(1993fe/7e(基因杂志)第134期第15-24页)、JP—A-10"229891、Jensen和H柳mer(1998年^z'otec力"o70^7aW^/oe/^/weer//^(生物技术与生物工程)第58期第191-195页)以及已知的遗传学与分子生物学教科书。J^施也可以与突变一样产生转基因细胞。例如可以1顿附加体质粒来增强各个基因的表ii7K平。适合作为质粒的尤其是在棒状杆菌中复制的那些质粒。大量己知的质粒载体例如PZ1(Menkel等人，1989年爿/v7/ec/a/7t/f/7K/ro/7迈e/7ta/#/cro6/o/og/(应用与环境微生物学)第64期第549-554页)、pEKExl(Eiknanns等人，訓年"e(基因杂志)第107期第69-74页)或者pHS2-1(So,等人，1991年"e(基因杂志)第107期第69-74页)均基于隐蔽性质粒pHM1519、pBLl或者pGAl。同样也可使用其它质粒载体，例如基于PCG4(US4,489，160)或者pNG2i(Serwold-Davis等人，1990年#/ct"oZ/o7o《/(FEMS微生11物学个射艮)第66期第119-124页)或者pAGl(US5,158,891)的那些质粒。此外合适的还有，借助其可通过整合在染色体之中来用于基因扩增方法的质粒载体，例如Reinscheid等人(1994年力////"a/c/f"K/ro/7酒ts/JZ/crM/o/ow(应用与环境微生物学杂志)第60期第126-132页)所描述的用来复制或扩增horn-thrB-操纵子的方法。这种方法可将完整的基因克隆在一种质粒载体之中，该质粒载体可以在宿主(典型的有大肠杆菌)之中复制，但是不可以在谷氨酸棒状杆菌之中复制。可以作为载体使用的例如有PSUP301(Simon等人，1983年y9/o/7^c力"o/o^K(生物/技术杂志)第1期第784-791页)、pK18mob或者pK19tnob(SCr等人，固年"e(基因杂志)第145期第69-73页)、pGEM-T(PromigaCorporation,Madison'Wisconsin,USA)、pCR2.卜T0P0(Shuman，1994年/o〃/va/o尸/57o/o《/ca/C力e迈/W/y(生物化学杂志)第269期第32678-84页)、pC咖unt(Invitrogen，Groningen，NiecJerlande)、pEMl(Schrumpf等人，/。w/V7a/o尸Sa"eWo/og/(细菌学杂志)第173期第4510-4516页)或者pBGS8(Spratt等人，1986年Gene(基因杂志)第41期第337-342页)。随后通过接合或者转化作用，将含有待扩增基因的质粒载体转移到谷氨酸棒状杆菌的所需菌株之中。例如Sc^fer等人在1994年/ec/a"c/i5V7K2'/w迈e/^a/#/cro6/o/og/(应用与环境微生物学杂志)第60期第756-759页中就描述了这种接合方法。例如Thierbach等人在1988年/e"JZ/cro6/o/og/a/7J^j'otec力/7o/og/(应用微生物学与生物技术杂志)第29期第犯6-362页、Dimican和Shivnan在1989年^'o/7^力/7o7o耵(生物/技术杂志)第7期第1067-1070页以及Tauch等人在1994年/^^y^/cro^'o/o^^eae/^(FEMS微生物学'賊艮)第123期第343-347页中描述了相关的转化方法。利用某种"交换(cross-over)"事件进行同源重组之后，所形成的菌株将包含相关基因的至少两个拷贝。ms下述实施方案中使用的"酶Ex相对于其野生型的增强活性"这一说法，优选理解成各酶E的活性增强到至少2倍、尤其至少10倍、此外优选至少100倍、此外更优选至少1000倍且最好优选至少10000倍。此外，本发明所述的具有"相对于其野生型增强了酶^活性"的细胞也包括其野生型没有或者至少检测不出酶E活性、且只有在例如通ail度表达增强酶活性之后才能检测出这种酶&活性的细胞。就此而言，"过度表达"或者下述实施方案中使用的"增强过量表达"也包括这种情况，即原始细胞(例如野生型细胞)没有或者至少没有可检测表达，且只有M重组方法才诱导酶&的可检测表达。此外，根据本发明优选的是，所述细胞具有酶E'和E、酶E,和Em、酶En和E,的增强活性，或者具有所有酶E,、E和E川的增强活性。此外，就本发明所述细胞的上述优选实施方案而言，-酶E,是烷烃单加氧酶或二甲苯单加氧酶，或者，{她和-酶E，，是，或者，是，烷烃单加氧酶、醇脱氢酶或醇氧化酶，或者，鹏和-酶E,是-转氨酶。优选的酶E,是，尤其是优选的烷烃单加氧酶是，源于恶臭假单胞菌-GP01的经过alkBGT基因编码的烷烃单加氧酶。例如vanBeilen等人在2002年JournalofBacteriology,第184巻第6期第1733-1742页发表的a/^/7r湖-Aw/n>e^g"er/a"—文中就描述了alkBGT基因序列的分离方法。此外可以作为烷烃单力喊斷顿的还有细胞色素-P45(K争加氧酶，尤其是源于假丝酵母属例如热带假丝酵母(Ca/力'^z^o//ca/A)或者源于植物例如鹰嘴豆(Cicerarietin园L.)的细胞色素-P450"单加氧酶。例如专利W0-A-00/20566就公幵了源于热带假丝酵母的合适细胞色素-P450-单加氧酶的基因序列，关于源于鹰嘴豆的合适细胞色素-P450-单加氧酶的基因序列例如可查阅Barz等人在2000年PlantScience(植物科学杂志)第l55巻第108页上发表的文章"^7o///7^a/7c/c力aracter/za"'(9/7e/《力tc/foc力ro迈ec"/^res(鹰嘴豆(Cicerarietin菌L)细胞悬浮培养物的八个细胞色素P450cDNA的克隆与分析)"。关于alkB基因的其它同系物也可以查阅vanBeilen等人在2003年"&7《5b/e/7ce朋"rec力/7o7og/(石油与天然气科学技术)"第58巻第4期第427-440页上发表的文章。适用于二甲苯单加氧酶的基因例如是xylM或xylA基因，其中包含这两种基因的质粒具有基因库登录号M37480。优选的酶E,,尤其是醇脱氢酶例如是经过alkj基因编码的醇脱氢酶(EC131.1.99-2)，尤其是源于恶臭假单胞菌GPol经过alkj基因编码的醇脱氢酶。关于源于恶臭假单胞菌GPol、泊库岛食烷菌(///^/7//"3%力0^認6/^/5"，〉、副百日咳博德特氏杆菌(力/c3/72'KorwZ;o7^諸e/^/s，)、支气管败血性博德特氏杆菌(5oT^/ete〃a6ro/7c力/se/3"ca)或者源于脱微瑰杆菌Woseo6a"er甴/7/^///^/^)经过alkj基因编码的醇脱氢酶，例如可查阅KEGG基因数据库。适用的co-转氨酶例如有专利US-A-2007/0092957中以序列号248、250、252和254表示的那些w-转氨酶。优选的酶E,u是，尤其是优选的co-转氨酶是，源于紫色色杆菌(C力ro迈o力a"e"力迈"o/sce"迈)DSM30191的co-转氨酶(Kaulmann等人，2007;5"〃Z5"^rates/7ect/7/边0/必一《/\3/51<9迈//7<915^/ro迈C力i-o汲oZac力erJ'w边K/o7acew历Z5"/^6757a/7c/itspc^e/7t/a7/br力/oc3ts//5/51(紫色色杆菌DSM30191ro-转氨酶的底物范围及其生物分析学潜力)，f/^/迈e朋c/約'cro6/3/7Vc力/7o/o"(酶和微生物技术杂志)第41巻第628-637页)，其基因序列编码为SEQ,ID.-No.01。有利的是使用可从植物中分离出的co-转氨酶作为酶Em。这里1M选用源自下述植物的co-转氨酶；拟南芥(///ahWopw'sMa7i'a/a)、燕麦(/fKe"asa"Ka)、舌甘菜(^"a、大豆(67/c//7e迈a,)、大麦(〃ort/e"依n//gare)、百脉根"ott/sj'apo/7/c〃50、番茄(5W朋w/z///copei^'cw/27)、木著(#3/7/力。《esc〃/e/7t3)、7jC禾舀(Or/zasat/Ka)、d、麦(厂raet/ci7迈ae5"t/Kd/迈)、玉米(Zea迈a/s)、液菜(5>//7ac/ao/eracea)、^E叶i量南星(y4r〃迈迈ac"7at"边)、多年生山靛(yf/erc"r/a/j's/ere/7/7/s)以及荨麻(^r"'ca心o/ca)，其中特别优选的是拟南芥。适合作为co-转氨酶的尤其Ji^过核酸编码的酶，所述核酸具有与SEQ.-ID,Na39序列90%、优选为95%、尤其优选为99%、最特别优选为100%的同一性(Identity)。这里可利用已知的方法测定相对于SEQ,I^Na39的核苷酸同一性。通常可在考虑特殊要求的情况下使用具有相关算法的特别计算机程序。优选的同一性测定方法首先在待比IW列之间产生最大的一致性。用于确定同一性的计算mi呈mS括(但并不仅限于此)GCG程序包，包含—GAP(Deveroy，J.等人，麵執ucleicAcidResearch(核酸研究杂志)第12期第387页，GeneticsComputerGroupUniversityofWisconsin,Medicine(Wi)(^康辛大学遗传学计算机集团，医疗工程(Wi))，以及—BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul,S.等人，1990年JournalofMolecularBiology(分子生物学杂志)第215期第403-410页)。BLAST程序可由NationalCenterForBiotechnologyInformation(国家生物技术信息中心)(NCBI)及其它来源获得(BLASTHandbuch,AltschulS.等人'NCBINlilNIHBethesdaND22894;AltschulS,等人)。同样也可使用已知的Smith-Waterman算法来确定核苷酸同一性。4，的核苷酸比较参数包括下列-Needleman禾卩Wunsch算法，JournalofMolecularBiology(分子生物学杂志)48(1970)，第443-453页-比,阵匹配=+10错配=0空位罚分=50空位长度罚分=3GAP程序同样也适合与上述参数一起使用。上述参数是核苷酸序列比较过程中的默认参数。此外还适用源于p-Ala子群(Untergr叩pe)的酶丙酮酸转氨酶。其中包括例如源于恶臭假单胞菌W619(gi:119860707'gi:119855857，gi:119856278)、恶臭假单胞菌KT2440(gi:24984391)、铜绿假单胞菌(/°se"c/ofl/o/7asaeri^/〃osa)PA01(gi15595330,gi:15600506,gi15595418,gi9951072)、天蓝色链霉菌(5Yi-e/^o迈/cescoe7/co/or)A3(2)(gi:3319731)、阿维链霉菌(e/to边/caver迈/￡j7"〉MA4680(gi:29831094,gi:29829154)以及源于紫色色杆菌(C力ro迈o6acter/歸K/o/ace"边)ATCC12472(gi34102747)的转氨酶。±^转氨酶的列在SEQ.-ID,-No.19SEQ.-ID.-No,30序列之中给出。对于打算使用本发明所述细胞由羧酸酯出发来制翻-氨基羧酸、co-氨基羧酸酯或者基于co-氨基羧酸的内酰胺的情况而言，如果除了增强酶E,、E,,和Em中的至少一种酶的活性之外，尤其是除了酶&和Em或者E,、E和E,n的增强活性之外，本发明所述的细胞还具有酶EIV的增强活性，其中该酶Ew^co-氨基羧酸酯催化转换成相应的co-氨基羧酸酯，则更为有益；所述的酶EIV优选是细鹏万分泌的酯酶。通M胞分泌酯酶的优点在于在细胞之外才断裂酯键。以这种方式，由于(0-氮基羧酸酯具有比co-氨基羧酸更好的膜滲透性，能保证有充分的目标产物离幵细胞并转移到细胞周围的培养基之中。本发明所述的优选酯酶尤其是脂肪酶，作为合适脂肪酶的实例提及源自荧光假单胞菌(/^5^壳迈o"as/7〃oresze〃z)HU380的月旨肪酶LipA(ACCCodeQ76D26,Kojima禾卩Shimizu在2003年/o"/V7a/i57osc/e/7ce5/oe/^//^er//^(生物学与生物工程杂志)第96巻第3期第219~226页上发表的文章"尸w/7/Ycat/0/7a/7c/C力aracter/zat/c/7o/t力e厶/pase/>0边/^e^o迈o/as/7woresce/7s〃MW(荧光假单胞菌HU380脂肪酶的净化与性质)")。为了保证分泌酯酶，可以按照专业人士已知的方式，赋予其保证进行分泌的相应信号序列。当例如J^来自荧光假单胞菌HU380的脂肪酶LipA在大肠杆菌中过度表达时，就可以使其具有铜绿假单胞菌细胞表面上自然出现的酯酶EstA的信号序列(Becker等人在2005年F朋5^e"ers(FEBS快讯)第579巻第1177-1182页上发表的文章'M卯/7er/c"^e迈/brt力e肠杆菌细胞表面显示脂肪分解酶的通用系统)")。其它适用的酶是南极假丝酵母(C.3/7&rc"ca)、米黑毛霉(屋边/e力ej')以及洋葱假单胞菌(尸，ce/ac/a)的脂肪酶(Vaysse等人，2002年￡V，e朋"J/!'cro6!'a/rec/mo/og/(酶与微生物技术杂志)第31巻第648-655页)。也可以按照传统方式分裂所分泌的co-氨基羧酸酯，以便获ffo)-氨基羧酸，例如可舰氢氧化物(例如氢氧化钠)水溶液将co-氨基羧酸酯皂化即水解的方式。按照本发明所述，如果除了酶E，、E,,和E,中至少一种酶的增强活性之外，im除了酶E,和E,或者E,、E,,和E,的增强活性以及视需要除了±3^酶E1V的增强活性之外，本发明所述的细胞也具有酶Ev的增强活性，其中酶^%)-氨基羧酸催化转换成相应的内酰胺，贝i殿为有益；如果从细胞分泌这种酶Ev，也较为有益。以这种方式可以将直接由细胞形成的co-氮基羧酸或者在细胞外分^co-氨基羧酸酯才产生的co-氨基羧酸转移到相应的内酰胺之中，从而便于在视需要提纯目标产物。按照本发明所述细胞的另一种特殊实施方案，该细胞除了具有一种或多种酶E,、E或E,的增强活性以及任选地酶禾B/或Ev的增强活性之外，也具有酶EVI的增强活性，其中酶Ev,^-酮羧酸催化转换成氨基酸，这种酶优选是氨基酸脱氢酶。这种细胞修饰方式的优点在于如果使用氨基酸作为Nfi基团的供体，即在Mil转氨酶(Em)介导co-氧{，酸或者。-氧代羧酸酯反应形成相应的co-氨基羧酸、相应的co-氨基羧酸酯或者相应的co-氨基羧酸酯的过程中所需的基团，则可以再生这，基酸。作为氨基M氢酶的tt^是枯草，杆菌s"力"7/s)的丙氨酸脱氢酶(ECNo.1.4.1.1;基因ID:936557)，用基因序列SEQ.-ID,No.02对其进行编码。其它适用的氨基酸脱氢酶有丝氨酸脱氢酶、天冬氨酸脱氢酶、苯丙氨酸脱氢酶以及谷氨酸脱氢酶。有助于解决开头所述任务的还有转基因细胞制备方法，包括增强细胞内至少一种下列酶的活性的方法步骤,-i)酶E,，其将羧酸或者羧酸酯催化转换成相应的co-羟基羧酸或者co-羟基羧酸酯；ii)酶E,，co-羟基羧酸或者co-羟基羧酸酯催化转换成相应的co-氧微酸或者co-氧代羧酸酯，或者iii)酶E,，其将o)-氧代羧酸或者co-氧代羧酸酯催化转换成相应的co-氮基羧酸或者co-氨基羧酸酯，其中,iIM前述方法来增强酶活性。按照上述方法的一种特殊实施方案，在该方法的过程中除了增强酶E,、E和/或E,"的活性之外，也增强酶Erv的活性，该酶Ew^co-氨基羧酸酯催化转换成相应的co-氨基羧酸；和/或增强酶Ev的活性，该酶Ev^co-,羧酸催化转换成相应的内醜按，方法是增强这些酶的表达水平；其中优^;人细胞分泌所述的酶Erv禾口/或者Ev。有助于解决开头所述任务的还有可通^iJa方法获得的转基因细胞。有助于解决开头所述细胞的还有用于制^-氨基羧酸、co-氨基羧酸酯或者从CO-氨基羧酸衍生而来的内酰胺的方法，包括下列方法步骤I)在肖滩使得细胞从接酸或者从羧酸酯形^0)-氨基羧酸、CD-氨基羧酸酯或者从co-氨基羧酸衍生而来的内酰胺的条件下，使本发明所述的细胞与含有羧酸或者羧酸酯的培养基接触，或者与邻接含有羧酸或羧酸酯的有机相的培养基接触；II)视需要分离出所形成的co-氨基羧酸、CO-氨基羧酸酯或者从co-氨基羧酸衍生而来的内翻安。在本发明所述方法的方法步骤I)中，首先让细胞与含有羧酸或者羧酸酯的培养基接触，或者与邻接含有羧酸，酸酯的有机相的培养基接触，且在能够使得细胞从羧酸或羧酸酯形to-氨基羧酸、CO-氨基羧酸酯或者从co-氨基羧酸衍生而来的内醐安的剝牛下进行接触。可以采用批次法"atc力-Verfahren)(批次培养(Satzkultivierung))、进料批次法(feJ-/>afc/-Verfahren)(回流法(Zulaufverfahren))或者重复进料批次法(repea"J-尸e(/-6a"/r-Verfahren)(重复回流法(repetitivesZulaufverfahren))，以连续或不连续方式，使得本发明所述的转基因细胞与培养基进行接触、培养，以便产生co-氨基羧酸或者从co-氨基羧酸衍生而来的内,安。也可以考虑使用GB-A-1009370所述的半连续法。在Chmiel的孝女禾斗书("^'o/xroze&sz;ec力/7/'/r/.￡7/尸〃力/^/7《//c//ey9/orer/a力re/7"ec力/7/A"(生物过程工程初探)"(斯图加特GustavFischer出版社1991年出版))或者Storhas的教科书("i9/orea"ore/7/7er//7/^re￡Y/r/c/^"/^e/7(生物反应器与外围设备)"，布伦斯维^/威斯巴登Vieweg出版社1994年出版)中有关于己知培养方法的综述。所使用的培养基必须以恰当方式满足相应菌株的要求。有关各种微生物培养基的描述可参阅美国细菌学助会(derAmericanSocietyforBacteriology)的"脸/7〃a/o/、#"/oo^/brfe/era/S3"er/0/0《(通用细菌学方法手册)"(WashingtonD.C.，USA,1981)。除了羧酸繊酸酯之外，可以作为碳源i顿的碳水化合物例如还有葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素、油和脂肪(例如豆油，葵花籽油，花生油及椰子油)、脂肪酸(例如棕榈酸，硬脂舰亚油酸)、醇类(例如丙三醇和甲醇)、烃类(例如甲烷)、氨基酸类(例如L-谷氨酸或者L-缬氨酸)或者有机酸(例如醋酸)。可以单独使用这些物质，或者作为混合物使用。特别使用碳水化合物，尤其是单糖、寡糖或者多糖，例如US6，01，4941禾nUS6,136，576所述的那些，C5-糖或者丙三醇。18可以作为氮源4顿的含氮有机化合物例如有蛋白胨、酵母提取物、肉浸膏、麦芽浸膏、玉米浆、大豆粉、尿素或者无机化，，例如硫,、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵以及硝酸铵。可以单独使用氮源，或者作为混合物使用。可以作为磷源使用的有磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或者相应的含钠盐类。培养基还必须含有生长所需的其它金属盐类，例如硫酸镁或者硫酸铁。除了，物质之外，最后还可以使用必需生长物质如氨基酸和维生素。此外，还可以将适当的前体加入培养基之中。可以将所述物质以一次性批料形^W入培养基之中，或者在培养过程中以适当的方式加入。以适当的方式使用碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水，或者使用酸性化合物如磷酸或硫酸来控制培养基的PH值。可以使用消泡剂(例如脂肪酸聚乙二醇酯)来控制泡沫形成。可以在培养基中添加适当的选择性作用物质(例如抗生素)，以维持质粒的稳定性。可将氧气或者含氧混合气(例如空气)SA培养基之中，以便维持好氧条件。培养SM通常为20'C45'C，优选为25°C40°C。按照本发明所述的co-氨基羧酸、(0-氨基羧酸酯或者从co-氨基羧酸衍生而来的内制备方法的一种特别优选的实施方案，使用源于大肠杆菌细胞的重组细胞作为本发明所述的细胞，根据Riesenberg等人在1990年力p//Wcro6/0//9/otec力/7o7o/^r(应用微生物与生物技术杂志)第34巻第1期第77-82页上发表的文章"〃/《力ce//"e/s"//er迈e/""o/of/(表达人干扰素alphaI的大肠杆菌的高细胞密度发酵)"所述，使用含有氨比西林、氯霉素及卡那霉素的无机盐培养基作为培养基。优选在能够使得细胞从羧酸或羧酸酯形to-氨基羧酸、①-氨基羧酸酯或者从co-氨基羧酸衍生而来的内酰胺的割牛下，在方法步骤I)中使得本发明所述的细胞与培养基接触。可作为羧酸或羧酸酯使用的是碳原子数为620、为615、尤其为612的羧酸，且月桂,别雌作为羧酸。可作为羧酸酯1柳的是上述羧酸的甲酯或乙酯，且月桂酸甲酯特别鶴作为羧酸酯。可以考虑在方法步骤I)中采用不同的方法来制fe-氨基羧酸、co-氨基羧酸酯或者从co-氨基羧酸衍生而来的内酰胺。按照本发明所述方法的一种实施方案，首先在培养基中培养用于产生生物19质的细胞，所述培养基不含羧酸或羧酸酯，尤其不含上述的i^羧酸皿酸酯。只有在获得一定的生物质之后，才将羧酸或羧酸酯加入到培养基之中，或者使得细胞与含有羧酸或羧酸酯的新培养基接触。就此而言，在形^co-氨基羧酸、co-氨基羧酸酯或者从co-氨基羧酸衍生而来的内,安的过程中，羧酸或羧酸酯的含量优选为1200g/l，特别优选为20200g/1。按照本发明所述方法的另一种实施方案，在两相系统内执行该方法，所述两相系统包括A)水相，以及B〉有机相，在方法步骤I)中在水相中ilil细胞形^co-氨基羧酸、co-氨基羧酸酯或者从(o-氨基羧酸衍生而来的内酰胺，然后在有机相中使得所形成的(0-氨基羧酸、co-氨基羧酸酯或者从co-氨基羧酸衍生而来的内酰胺富集。以这种方式可以在原位提取所形成的co-氨基羧酸、co-氨基羧酸酯或者从co-氨基羧酸衍生而来的内酰胺。即使对于本发明所述方法的这种实施方案而言，可能有益的是首先在培养基中培养用来产生生物质的细胞，所述培养基不含羧酸或羧酸酯，尤其不含上述的优选羧酸或羧酸酯。只有在获得一定的生物质之后，才将细胞悬浮液作为水相A)与有机相B)接触，其中特别地，有机相B)的羧酸職酸酯含量雌为1200g/1，特别，为20200g/1。如果作为羧酸，酸酯使用的底物对于所使用的细胞而言没有毒性，例如月桂酸甲酯，那么有机相的这些羧酸或羧酸酯含量可以明显高一些。在这种情况下，可以使用纯羧酸或纯羧酸酯(例如月桂酸甲酯)作为有机相。可以作为有机相使用的是中等链长的l^烃，优选是logP值大于4(起沫少)的g烃，或者使用物理上类似的芳族化合物或芳族化合物酯，或者优选如以上实施方案所述，使用月桂酸酯，尤其是月桂酸甲酯、BEHP(双(2-乙基己基)邻苯二甲酸酯)或者长链脂肪酸酯(生物柴油)。此外，本发明,的是，至少在形成w-氨基羧酸、(0-氨基羧酸酯或者从co-氨基羧酸衍生而来的内酰胺的过程中，使得方法步骤I)中所用的培养基含有氨基团供体(例如氨或氨离子)或者氨基酸，尤其是丙氨酸或天冬氨酸'这些物质在通过转氨酶^o-氧代羧酸或者co-氧代羧酸酯催化转换成相应co-氨基羧酸或者CD-氨基羧酸酯的过程中起到氨基供体的作用。在本发明所述方法的方法步骤II)中，视需要可分离出所形成的CO-氨基羧酸、CO-氨基羧酸酯或者从0)-氨基羧酸衍生而来的内酰胺，且，釆用至少两个步骤的提纯法进行分离，包括a)提取步骤从培养基中提取C0-氨基羧酸、-，羧酸酯或者从(0-氨基羧酸衍生而来的内,安，以及b)提纯步骤采用蒸馏法或者选择性结晶法，对方法步骤a)中获得的提取物进一步提纯，获得纯度至少为99.8%的co-氮基羧酸相、co-氨基羧酸酯相或者内,安相。方法步骤a)中的提取操作尤其可以配置为所谓"原位"提取，其中同时执行本发明所述的co-氨基羧酸、co-氨基羧酸酯或者从co-,羧酸衍生而来的内酰胺制备方法的方法步骤I)和II)。以上己经对这禾中"原位"提取操作进行过描述。例如可以采用蒸馏或结晶法，在方法步骤II)中进行精细提纯。按照本发明所述的co-氨基羧酸、co-氨基羧酸酯或者从co-mS羧酸衍生而来的内,安制备方法的一种特殊实施方案，在额外的方法步骤中使用常规化学方法将方法步骤I)中形成的co-氨基羧酸酯转^co-氨基羧酸；优先选用的常规化学方法是皂化反应，其中禾,碱的水溶液尤其是氢氧化物的水溶液，优选使用氢氧化钠水溶液^co-氨基羧酸酯转换fc-氨基羧酸。这种方法雌用于由月桂酸酯鹏月桂酸甲酯来制备co-氨基月桂酸；有助于解决开头所述任务的还有可通itm方法获得的co-,羧酸、co-氨基羧酸酯或者从co-氨基羧酸衍生而来的内,安；且所述的内,安优选是按照本发明所述方法的方法步骤I)使用月桂酸或月桂酸酯作为羧酸或羧酸酯来制备从(0-氨基羧酸衍生而来的内酰胺时所获得的月桂内,安，所述的co-氨基羧Wt选是co-氨基月桂酸，且o)-氨基羧酸酯^m是(o-氨基月桂酸甲酯。有助于解决开头所述任务的还有制备基于co-氨基羧酸的聚酰胺的方法，包括下列方法步骤；(od),采用上述某一种制备co-氨基羧酸的方法，尤其是上述由月桂酸或月桂酸酯制^co-氨基羧酸的方法，制fe-氨基羧酸；(oc2)聚合co-氨基羧酸，获得聚翻安。按照本发明所述用于制备基于CO-氨基羧酸的聚酰胺的的方法的方法步骤((x2)，将方法步骤(al)中获得的co-氨基羧酸、尤其是将方法步骤(ocl〉中获得的co-氨基月桂酸在聚合反应中转化为聚酰胺，视需要也可使用各种co-氨基羧酸组成的混合物，其中至少一种co-氨基羧酸、视需要所有(O-氨基羧酸均可釆用本发明所述的co-氨基羧酸制备方法进行制备。可以采用已知的方法用a-氨基羧酸来制备聚,例如LNotarbartolo、In丄PlastMod.10(1958)2第44页、JP01-07德、JP01-051433、JP63286做JP58080324或者JP60179425所述的方法。有助于解决开头所述任务的还有制备基于内酰胺的聚酰胺的方法，包括下列方法步骤；((31)制备内酰胺，其采用上述制备从co-氨基羧酸衍生而来的内翻安的方法，尤其是采用上述用月桂酸或月桂酸酯制备月桂内翻安的方法进行；(P2)幵环聚合或者縮聚月桂内酰胺获得聚酰胺。按照本发明所述用于制备基于内酰胺的聚酰胺的方法步骤((32)，以开环聚合或者通过缩聚反应将方法步骤(pl)中获得的内酰胺，尤其是将方法步骤中获得的月桂内酰胺转变成聚酰胺，视需要也可使用各种内酰胺组成的混合物，尤其是月桂内酰胺与e-己内酰胺组成的混合物，其中的至少一种内、视需要所有内,均可釆用本发明所述的制备从co-氨基羧酸衍生而来的内的方法进行制备。可采用已知的方法用内鹏制备聚赚，例如DE-A-1495198、DE-A-2558480、EP-A-0129196或者1977年纽约Interscience杂志第424-467页、尤其是第444-446页上的文章"PolymerizationProcesses"所述的方法。可ii^述方法获得的聚酰胺也有助于解决开头所述的任务。其中特别优选的是，聚酰胺的重量百分比的至少10%、特别优选至少25%、更皿至少50%、最i^l至少75%基于月桂酸、月桂酸酯或者月桂内酰胺，它们采用本发明所述制备月桂酸、月桂酸酯或来自月桂酸或月桂酸酯的月桂内,的方法来获得。以下将根据非限制性附图和实施例，对本发明进4亍说明。22附图l示意性示出用来将alk基因染色体^"入大肠杆菌之中的重组质粒(tnp:转座麟因；bla:氨比西林抗性基因，oriTRP4:移动区；I和0标记微转座子Tn5的"反向重复")。附图2示意性示出在控制阿拉伯糖可诱导启动子斷兄下表达转氨麟口丙氨^E氢酶的重组质粒(bla:氨比西林抗性基因；CV2025:青紫色色杆菌(D-转氨酶的基因；aid:枯草杆菌丙氨酸脱氢酶的基因；araC:转录调节因子)。附图3示意性示出用M达大肠杆菌的LipA的重组质粒以及细胞表面上的酶(colEl，ColEl:复制起点；estA*，estA:用丙氨酸相对于丝氨酸进4豫基酸替换的基因(Codon#38)，cat:氯霉素抗性基因；phoA:针对碱性磷酸酶前导序列进行编码的基因片段)。附图4示出由酶分析确定紫色色杆菌转氨酶的活性，其中ffl31来自紫色色杆菌的"-转氮酶转化12-氧代月桂酸甲酯。通过光度计测定以两次测定法(活性1，活性2)测定活性。{顿不含协同底物L-丙氨酸的批次(aCos)、含有热灭活酶的批次(非活性)、以及大肠杆菌表达培养基与空载体组成的批次(空载体)，對以于"-TA进行提纯，作为阴'舰照。附图5示出在毅隹须糧开始之时(上)(参比物质12-氨基月桂酸甲酯，10.2仝H中时达到峰值)以及^顿提纯后的转氨酶进份咅养2小时之后(下)(经过2小时后的转化率,10.2辦中时达到峰值)，底物12-氨基月桂酸甲酯的色谱图。附图6示出经过24小时齡析之后(上)(经过24小时后的转化率，10.2辦中时达到峰值)以及底物增加之后(对照组，下)(经过24小时后的转化率，参比物质增加10.2射中时达到峰值)，底物12-氮基月桂酸甲酯的色谱图。附图7示出将酶进行热灭活之后(上)(对比:热灭活蛋白质，经过24小时后的转化率。没有产物可检出)以及经过0小时之后(下)(对比:经过0小时后的转化率。没有产物可检出)，底物12-氨基月桂酸甲酯的色谱图。附图8示出用于作为alkBGTS扩增模板的起始质粒pGEc47。附图9示出所使用的引物以及由此而得到的PCR产物alkBFG和alkT。附图10示出用于合成羟基月桂酸甲酉旨和氧代月桂酸甲酯的重组载体pBT10。附图11示出标准物12-氧代月桂酸甲酯的GC-色谱图。附图12示出标准物12-羟基月桂酸甲酯的GC-色谱图。附图13示出月桂酸甲酯生物反应器内静息细胞生物转化作用产生的有机相的色谱图，时刻0併中。附图14示出月桂酸甲酯生物反应器内静息细胞生物转化作用产生的有机相的色谱图，时刻150併中。附图15示出含AT3G22200的pGJ3130的表达载体。附图16示出通过耦合SI^析检测酶活性(非活性，热灭活蛋白质；aCos.，没有添加丙氨酸；akt,提纯后的活性酶)。附图17示出通过HPLC检测异源表达的蛋白质AT3G22200。上10.8分钟时经过20分钟培养后的产物；下；10.8併中时的参比物质。附图18示出表达含转氨酶基因ppta5(pPPTA5)的载体pET-21a(+)的载体卡。附图19示出含转氨酶基因psta(pPSTA)的皿载体pET-21a(+)的载体卡。附图20示出5mM12-氧代月桂酸甲酯与转氨酶PPTA5的胺化反应。为了进行分析，由所得的中性和酸性提取物的色谱图，将12-氧代月桂酸甲酯和12-氨基月桂酸甲酯的峰面积相加进行分析，然后计算进料物或产物的百分比含量。附图21示出5mM12-氧代月桂酸甲酯与m酶PSTA的胺化反应。为了进行分析，由所得的中性和酸性提取物的色谱图，将12-氧代月桂酸甲酯和12-氨基月桂酸利旨的峰面积相加，然后计算迸料物^物的百分比含量。具体实施例方式实施例A.将月桂酸或月桂酸甲酯转换成月桂内《给大肠杆菌补充所需的单加氧酶、醇脱氢酶、co-转氨酶、丙氨酸脱氢酶以及脂肪酶，将月桂酸或者月桂酸甲酯转换成月桂内酰胺。在大肠杆菌中过度表达这些酶，各个酶的表达水平取决于各个反应的动力学，必须使其彼优匹配。iiil添力隨量诱导物调整^ii7K平。〗OT正辛掠诱导表达单加氧,Q醇脱氢酶，使用阿拉伯糖诱导转氨酶和丙氨,氢酶，4顿IPTG诱导脂肪酶。Al.克隆各个酶羟基化与成醛反应使用来自恶臭假单胞菌GPol的烷烃羟化酶系alkBGT进行月桂酸或月桂酸甲酯的羟基化反应。ilil醇脱氢酶alkj催化第二个成醛步骤。在大肠杆菌中通谢爾入到微转座子Tn5之中的方式，将这些反应所需的基因alkBGJT染色体^"入大肠杆菌的基因组之中(deLorenzo等人，1990年JBacteriol杂志第172巻第11期第6568-6572页和第6557-6567页；1999年如/77朋￡/&">0/7迈.J//c/Y^/o7.(应用与环境微生物学杂志)第5619-5623页)。应在控制alkB启动子和正调节子alkS的情况下5l^达基因。借助Panke等人1999^iJ^杂志上描述的可移动质粒Km，将Tn5-alkBGFJST-构建体转移到大肠杆菌耙标生物体上。在alkBFGHJKL操纵子之外组织alkST基因座与表达相关的调节因子alKS,然后在恶臭假单胞菌的基因组中反向排列。在克隆到载有转座子的质粒之中时保持基因的排列。依次将片段alkST和alkBFGJ整合到该质粒之中。在恶臭假单胞菌中也就是在操纵子alkBFGHJKL中组织待克隆的基因alkB(SEQ.-瓜-No,03)、alkG(SEQ.-ID.-No.04)和alkj(SEQ.-ID.-No.05)，但是将其与针对醛脱氣酶进行编码的基因alkH分开。该酶可能会重新爐所需的中间产物，也就是月桂酸的醛，因此必须将其隔离在alkBGJ基因的克隆过程之外。为了简化alkB和alkG的克隆操作，将基因alkF与alkB和alkG—起进行扩增、克隆。AlkP对于待催化的反应而言无关紧要。在两个分开的PCR批次中扩增基因alkBFG和alkj，然后皿S0E-PCR将其相互融合(Horton等人，1989年Gene(基因杂志)第77巻第61-68页)。作为目标DNA的是恶臭假单胞菌GPol的OCT质粒。A2.克隆策略使用alkT上游的Notl切位点对片段alkST=4077bp(SEQ.-ID.-No.06(alkS)和SEQ,-ID.-No,07(alkT))进行PCR扩增引物alkT-正向-Notl(SEQ.-ID.-No.08)5'ACGTAGCGGCCGCCTAATCAGGTAATTTTATACalkS-反向(SEQ.-ID.-No.09)5'GAGCGAGCTATCTGGT将PCR片段克隆到载有转座子的载体pUT-Km之中。为此可在Tn5之内利用Notl切幵载体，然后采用平末端(blund-end)连接反应将其与alkST片段连接在一起。重组质粒的名称为pUT-Km-alkST。A3.利用S0E-PCR技术合成alkBFG.I构建体合成片段halkBFG+alkB上游启动子及5'-末端的Notl切位点(产物25大小1409bp):引物alkBFG-正向-Notl(SEQ.-ID,-No.10)5'TCGTAGCGGCCGCCCAGCAGACGACGGAGCAAalkBFG-反向-SOE(SEQ.-ID.-No.11)5'ATTTTATCTTCTCGAGGCTTTTCCTCGTAGAGCACAT利用与5'-末端上的alkG和3'-末端上的Notl-切位点互补的末端合成片段3、alkJ(产物大小1723bp):引物alkJ-正向-SOE(SEQ.-ID.-No.12)5'TGCTCTAACGAGG/UAAGCCTCGAGAAGATAAAATGTAalkJ-反向-NotI(SEQ.-ID.-No.13)5'ATTGACGCGGCCGCTTACATGCAGACAGCTATCAMSOE-PCR将两个单一片段相互融合。(需要3个分幵的PCR反应)。使用Notl切割、连接重组质粒pUT-Km-alkST和alkBFGJ构建体。在大肠杆菌HB101之中转化新的重组质粒pUT-Km-alkBGJST(见附图1)，然后通过接合质粒转移转移到大肠杆菌JM101上。A4.胺化反应与氨基供体再生利用重组质粒pBAChCV2025-aid转化载有Tn5:alkBGJST的大肠杆菌菌株JMIOI，用于进行胺化反应形成co-氨基月桂酸酯.并且再生氨基供体。该质粒基于载体pBAD30(Guzman等人在1995年Bacteriol杂志第177巻第14期第4121-4130页上发表的文章"TightRegulation,Modulation,andHigh-LevelExpressionbyVectorsContainingtheArabinoseP眺Promotor'，)。pBAD~CV2025_ald载有来自紫色色杆菌DSM30191的转氨酶CV2025的基因(SEQ:-ID,No.01;Kaulmann等人在2007年f/^/迈e朋V/f//cro6/a7^c力加7^/(酶与微生物技术杂志)第41巻第628-637页发表的文章)并且载有针对枯草芽抱杆菌(&c^7mm&i7^5V/A"j")的丙氮酸脱氢酶进行编码的基因aid(SEQ.-ID.-No.02;NP_391071)。这些基因鼓lj阿拉伯糖可诱导的启动子的控制。A5.克隆策略利用紫色色杆菌DSM30191的染色体DNA对转氨因进行PCR扩增(产物大小1415bp):引物CV2025-正向-5^c/1(SEQ,-ID.-No.14)5'CGAGGAGCTCAGGAGGATCCAAGCATGCAGAAGCAACGTACGCV2025-反向-KpnI(SEQ.-ID.-No,15)5，GTCATGTACCCCTAAGCCAGCCCGCGCGCCT正向引物除了含有Xbal切位点之外，还含有可用于克隆到载体pBAD30之中的核糖体结合位点。ilil切位点SacI和你/7/连接到载体pBAD30之中。重组载体的名称为pBAD~CV2025。禾'J用枯草魏杆菌的染色体DNA(NP—391071)对丙氨酸脱氢酶基因ald进行PCR扩增(产物大小1171bp)。引物AlaDH-正向-Xbal(SEQ.-ID.-No.16)5'ACCTATCTAGAAGGAGGACGCATATGATCATAGGGGTTCCTAlaDH-反向-PstI(SEQ.-ID.-No.17)5'AACCTCTGCAGTTAAGCACCCGCCAC为了克隆到重组载体pBAD"CV2025之中，正向引物除了含有Xbal切位点之外，还含有核糖体结合位点。通过切位点Xbal和Pstl克隆到载体之中。所得到的质粒的名称为pBAD"CV2025-aid(参见附图2)。A6.针对密码子优化表达的来自紫色色杆菌DSM30191的co-转氨酶基因备选地克隆到大肠杆菌中Geneart公司已针对大肠杆菌密码子的使用优化合成了转氨酶的编码基因(SEQ，-ID.-No.42)并且已经将其克隆到载体pGA15(Geneart〉之中。已在基因合成ilf呈中在侧面植AS因合成切位点Sacl和Kpnl，并且在^fflSacl和Kpnl进行消解之后，将其克隆到之前利用Sacl和Kpnl进行了线性化处理的载体pGA15之中。使用限制性核酸内切酶Sacl和Kpnl消解所得到的载体，跑屯片段(转氨酶)，然后连接到表达载体paCYCDuet-1(Novagen)之中。采用限制性分析法检查正确的质粒。所得到的载体称作paCYCDuet-1::co转氨酶。A7.通过6xHis-Tag提纯异源表达蛋白质将载体(paCYCDuet-1::"转氨酶).转化到大肠杆菌XUblue之中后，在、皿为28。C的条件下，在含有抗生素氨比西林(100pg/ml)的双份YT培养基(dYT)中培养所的转化菌株，直到密度0D600nnFO.3-0,4。在控制Plac启动子的情况下使用IPTG(最终浓度1mM〉诱发,。溶解细菌表达培养基；将50ml培养基以2360xg离心分离，然后将其重新悬浮于含有5幽EDTA、300mMNaCl和lmg/ml溶菌酶的5ml磷勝内缓冲液(pH8)之中，在室温下培养1小时。以2360xg将溶解产物离心分离105H中，然后,ProtinoNi-TED2000填充柱(根据制造商说明；Macherey-Nagel,DUren)提纯上清液。利用Bradford测定蛋白质浓度。A8.采用偶联分析检测酶活性以偶联分析测定活性，在第二步骤中使作为转氨酶反应副产物出现的丙酮酸继续反应，将NADH氧化成NAD+。在340nm光度计中测定NADH浓度的下降率(原理测定消光系数下降程度)，将浓度下降率作为活性评估尺度。批次50mM磷麵PH7.550mML-丙氨酸100mM磷酸吡眵醛250vig12-氧代十二烷酸甲酯1.25mM麵10U乳M氢酶10pg#^表达的蛋白质用HaO〕娜补充至1ml加入5(il12-ODWE(50mg/ml)开始进行分析。在340nm及室温条件下每5H中测定一次，连续测定最多205H中。使用灭活蛋白质及不含协同底物的批次进行对比。附图4可以看出使用光度计测定的消光率变化。A9.通过HPLC检测异源表达的蛋白质批次50mM磷,PH7.550mML-丙氨酸28100250Mg50pg磷,比眵醛12-氧代十二烷酸甲酯异源表达的蛋白质补充至500一在室温条件下培养4小时之后，使用1Vol.MeOH终止反应使用邻苯二甲醛(oPA)衍化批次进行HPLC分析，然后从中取250进行分析。使用50mMNaACpH4:乙腈4:1(v:v)作为流动相A。流动相B是含有5%50mMNaACPH4的乙腈。梯度在4分钟内从30%B变为60%B,在25M中内从60%B变为100%B。流速为1.2ml/分钟。舰AgilentZorbax隨色谱柱(AgilentTechnologies,USA)进行分离°色谱柱温度为40t:。附图5和6所示12-氧代月桂酸甲酯的标准以及下降程度。热灭活瞓乍为阴性对照(附图7)。A6,酯爐使用来自荧光假单胞菌的脂肪酶LipA(Q76D26)(Kojima&Shimizu,2003年/of6i'osc/e/7ce5/oe/7g/".(生物科学与生物工程杂志)第96巻第3期第219-226页))|%o-氨基月桂酸甲酯，fc-氨基月桂酸。使用含有荧光假单胞菌染色体的引物Lip^Sfil-up和LipA-Sfil-down扩增基因，然后通过Sfil切位点将其克隆到载体pEST100之中。重组质粒的名称为pEST-lipA(参见附图3)。皿克隆将lipA(SEQ.-ID,Na18)融合在来自铜绿假单胞菌的碱性磷酸酶phoA的信号序列和酯酶EstA的自动转运域上，从而可通,胞质膜转移脂肪酶，并且在大肠杆菌的细胞表面上显示出来。相关操作方法可参阅Becker等人在2005年/^561"〃ew(FEBS快讯)第579期第1177-1182页上发表的文章"力《e/7e/"/cs/5^e边/'ort力ev5^c力er/c力/aco7ice7/—st^r/acea7s//a/of〃/7o//t/Ce/7^迈es(大肠杆菌细胞表面显示脂肪懒早酶的通用系统)"。在控制Plac启动子的情况下使用IPTG(最终浓度1mM)诱发表达(产物大小:1894bp)。引物引物lipA-Sfi-up(SEQ.-ID.-No.19)5'AACAAAAGGGCCGCAATGGCCATGGGTGTGTATGACTAC引物lipA-Sfi-down(SEQ.-ID.-No.20)5'TACAGGGGCCACCACGGCCTCAGGCGATCACAATTCCB禾lj用恶臭假单胞菌GPol的AlkBGT烷烃羟化酶系从月桂酸甲酯出发合成12-羟基月桂酸甲酯和12-氧代月桂酸甲酯Bl.构建alkBGT,载体从pC0M出发从pC0M系(Smits等人，2001Plasmid64:16-24)制备构建体pBT10(附图10,SEQ,ID.-No.31)，该构建体含有氧化成醛所需的恶臭假单胞菌的，羟化酶(AlkB)、红素氧还蛋白(AlkG)及红素氧还蛋白还原酶(AlkT)t种成分。将alkBFG基因序列置于alkB启动子的控制之下和将alkT基因置于alkS启动子的控制之下，棘达i^H种基因。B2.克隆策略为了简化alkB和alkG的克隆操作，将基因alkF与alkB和alkG—起进行扩增、克隆。AlkF对于待催化的反应而言无关紧要。利用alkB的上游Ndel切位点以及alkG的下游Sail切位点，对片段alkBFG-2524bp(参见SEQ,-瓜-No.03(alkB)和SEQ.-ID.-No.04(alkG))进行PCR扩增引物alkBFG正向(SEQ,-ID,-No.32)AAGGGAATTCCATATGCTTGAGAAACACAGAGTTC引物:alkBFG反向(SEQ.-ID.-No.33)A嵐TTCGCGTCGACAAGCGCTGAATGGGTATCGGPCR扩增片段alkT(2958bp)(参见Seq,ID,-No.07(alkT))引物alkT正向(SEQ.-ID.-No.34)TGAGACAGTGGCTGTTAGAG引物alkT反向(SEQ.-ID.-No.35)TAATAACCGCTCGAGAACGCTTACCGCCA八CACAG利用PCR扩增片段alkBFG和alkT。鹏质粒pGEc47(附图12)作为模板(Eggink等人在1987年J.BioLChem.第262期第17712-17718页上发表的文章)。利用亚克隆载体pSMARTHCKan(LucigenCorporation)进行克隆。需要这一附加步骤，因为直接克隆不会成功。为此将市面上能买到的、已经过线性化处理且配有平头末端的载体pSMA!T^HCKan(Lucigen)与相应的平头末端PCR产物(附图9)连接起来。接着j柳限串敝酶Ndel和Sail切割alkBFG片段，然后1柳亚克隆载体的限制性酶Pacl和Xhol切割alkT片段。在琼^離(1%)中分离这些片段，从凝胶中将其切除，然后^^凝胶提取试剂盒将其分离出。依次将片段连接到载体pC0M10之中(Smits,T.H.M.，Seeger,M.A.,Withot,B,&vanBeilen，J.B.(2001)Plasmid46.16-24)。在第一个步骤中通过切位点NdeI和Sall将alkBFG置于pCQM10之中，然后在第二步骤中MH切位点Pacl和Xhol进行克隆。首先在大肠杆菌DH5a中转化重组质粒。在含有卡那霉素的LB培养基上选择载有质粒的克隆。,酶切分析和排序控制从中分离出的质粒。质粒名称为pBT10(附图10)。B3.在生物反应器中将月桂酸甲酯生物转化成羟基月桂酸甲酯和12-氧代月桂酸甲酯为了生物转化，在42。C剝牛下热激2辦中，将质粒pBT10转化成为化学感受态大肠杆菌菌株W3110。在3(TC条件下以180卬m,在M9培养基中培养一夜大肠杆菌W3110-pBT10，收获合成羟基月桂酸甲酯和12-氧代月桂酸甲酯。在含有0.5%葡萄糖的M9培养基中吸收生物质，直至达到0D450=0,2。生长4小时之后使用双环丙基酮诱发表达，然后继续培养4小时。重新离心分离出细胞，将细胞团块重新悬浮于KPi缓冲液(50mM，pH7.4)之中，然后放入生物反应器之中。将生物质浓度调整到约为1.8gCDW/L。一边猛烈搅拌(1500转/^中)，一边按照1:3比例将底物月桂酸甲酯加入到细胞悬浮液之中(100ml细胞悬浮液，50ml月桂酸甲酯)。保持30°C恒温。对反应批次进行色谱分析，检测产物羟基月桂酸甲酯和12-氧代月桂酸甲酯的形成情况。经过0射中后从反应批次的有机相中取样作为阴性对照(附图13),经过150併中后(附图14)从反应批次的有机相中取样，然后使用GC31(ThermoTraceGCUltra)进行分析。将VarianInc.FactorFourTMVF-5m作为色谱柱，长度.*30m，胰厚0.25Mm,内径0.25mm。分析割牛，-炉温80-280°C斜坡分流比15辦量1)Ul载流1,5ml房中PTV进样器80—280。C，斜坡为15。C/s检测器基本鹏320。CiM:注入纯物质显示12-氧代月桂酸甲酯(附图U)和12-羟基月桂酸甲酯(附图12)的检测。C将12-氧代月桂酸甲酯转化成12-氨基月桂酸甲酯CI:分离、表达拟南芥的转氨酶对拟南i的己知im酶进行分析。分析结果令人惊奇4-氨基丁酸,酶(at3g22200，SEQ,-ID.-No.38)展现出，表达蛋白质相对于12-氧代十二烷酸甲酯的活性约为14U/ing。利用HPLC确认产物12-氨基十二烷酸甲酯。如果没有其它说明，所有方法均根据Sambrook，J.，Fritsch.,E.F.,&Maniatis，T(1989).Molecularcloning,第2版，纽约冷泉港实验室出版社所描述的，，进行。分离拟南芥的4-氨基丁酸转氨酶(at3g22200)按照制造商QIAGENGmbH(Hilden)的说明，利用RNeasyMiniKit从一种完整的开花拟南芥植物中分离出RNA。然后根据制造商的说明，禾IJ用RTSkriptKit(USBEuropeGmbH,Staufen)合成cDNA。按照制造商(ThermoFisherScientificInc.Walth柳USA)的说明，利用Nanodrop测定RNA质4/数量。拟南芥cDNA的PCR以^A切位点使用下列引物将编码为SEQ.-ID.-No.39的4-氨基丁酸转氨酶的DNA克隆到已消解了Nael、BamHI的载体之中。正向弓卿駄蛋白酶切位点和Nael,SEQ.-ID,No.36GCCGGCGAGAACCTGTACTTTCAGATGGCAAGTAAGTATGCCACTTG反向引物嵌入B柳HI，SEQ.-ID.-No.37GGATCCTCACTTCTTGTGCTGAGCCTTG根据下列程序迸行PCR-<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>4顿NucleoSpinExtractIIKit(Macherey-Nagel,德国，根据制造商说明)提纯得到的PCR产物。表达异源蛋白质^ffi，PCR产物，Mit标准分子生物学方法制备载体PGJ3130(附图15，SEQ,ID.-No.43),然后在大肠杆菌XUblue中进行转化。在28°C条件下，在含有抗生m比西林(100pg/ml)并且加入了0.5mMIPTG的双份YT培养基(dYT)中培养转化后的大肠杆菌菌株，直至密度达到0D600nnFO.3-0.4。iiil6xHis-Tag提纯，表达蛋白质溶解细菌表达培养基；将50ml培养基以2360xg离心分离，然后将其重新悬浮于含有5mMEDTA、300raMNaCl和1mg/ml溶菌酶的5ml磷酸钠缓冲液(pH8)之中，在室温下培养1小时。以2360xg将溶解物离心分离10併中,然后通过ProtinoNi-TED2000填充柱(根据制造商说明;Macherey-Nagel,DUren)提纯上清液。利用Bradford测定蛋白质浓度。采用偶联分析检测酶活性以偶联分析测定活性，在第二步骤中使作为转氨酶反应副产物出现的丙酮酸继续反应，将NADH氧化成NAD+。在340nm光度计中测定NADH浓度的下降率(原理测定消光系数下降程度)，将浓度下降率作为活性评估尺度。<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>50mM磷勝内pH7.550mML-丙氨酸100|iM磷酸吡眵醛250)ug12-氧代十二烷酸甲酯1.25mM薩10U乳酸脱氢酶10Vig，皿的蛋白质1柳H2。;^3SW补充至1ml加入5pi12-0DME(50mg/ml)开始进行分析。在340nm及室温条件下每射中测定一次，连续测定最多205H巾。使用灭活蛋白质及不含协同底物的批次进行对比。附图16可以看出使用光度计湖淀的消光率变化。皿HPLC检测异源表达的蛋白质批次50mM磷,pH7,550mML-丙氨酸訓磷驗比眵醛25012-氧代十二烷酸甲酯50ng#^表达的蛋白质j顿H20;;;纖补充至500^在室温条件下培养4小时之后，使用IVol.MeOH终止反应使用邻苯二甲醛(oPA)衍化批次迸行HPLC分析，然后从中取250进行分析。使用50mMNaACpH4:乙腈4:1(v:v)作为流动相A。流动相B是含有5%50mMNaACpH4的乙腈。梯度在4分钟内从30%B变为60%B，在2併中内从60%B变为100%B。？鹏为1.2ml/分钟。AgilentZorbaxRP18色谱柱(AgilentTechnologies'USA)进行分离。色谱柱温度为40°C。附图17(上)示出12-氨基月桂酸甲酯形成情况。附图17下方示出参比i式样。D将12-氧代月桂酸甲酯与来自假单胞菌属的PPTA5和PSTA进行胺化反应Dl.克隆PPTA5和PSTA使用大肠杆菌BL21(DE3)/PPTA5和大肠杆菌BL21(DE3)/PSTA菌株进行12-氧代月桂酸甲酯的胺化反应。按照如下所述构建这些菌株。选择表达载体pET-21a(+〉(Novagen)来克隆两个转氨酶基因。针对ppta5基因(SEQ.-ID.-No.40〉构建引物，这些引物应可在末端将限制性切位点Ndel和Xhol添加到基因上；引物PPTA5—Ndel;GGAATTCCATATGAGCGTCAACAACCCGCAAACCCG(SEQ,-ID.-No.44)和引物PPTA5—Xhol:CCGCTCGAGTTATCGAATCGCCTCAAGGGTCAGGTCC(SEQ,-ID.-No.45)。对于psta基因(SEQ.-ID.-No.41)，在末端添加含有Ndel和BamHI的引物；引物PSTA一NdeI:GGAATTCCATATGAGCGATTCGCAAACCCTGCACTGGC(SEQ,—ID.-No,46)禾口引物PSTA—B柳HI:CGCGGATCCTCAGCCCAGCACATCCTTGGCTGTCG(SEQ,-ID.-No.47)在PCR过程中使用这些引物。然后使用限制性酶Ndel和Xhol或者Ndel和B柳HI限律腿纯后的PCR产物以及载体pET-21a(+)。使用虾的碱性磷酸酶对剪切的载体进行去磷酸化处理。使用T4DNA连接酶与感受态表达菌株大肠杆菌XL1-Blue迸4瑰接之后，使用Ndel和Xhol剪切的载体和ppta5基因以及使用Ndel和BamHI剪切的载体和psta基因进行转化。培育一些克隆之后，利用下列限制酶切分析法与凝胶电泳分析法分离出质粒。通31序列分析确认所获得的克隆物(pPPTA5或pPSTA)的转氮酶序列。附图18示出表达载体的质粒卡(Plasmidkarte)。D2.表达PPTA5和PSTA将载体pPPTA5和pPSTA转化成感受态大肠杆菌BL21(DE3)细M行表达。将每一个单菌落在5mlLB-Amp-培养基(氨比西林浓度为100pg/ml)中进行接种，并且在37'C割牛下振摇一夜。接着在1%的200mlLB-Amp-培养基中进行接种，在37°C刹牛下振摇，在0D鄉达到0,5之后，使用0.5mMIPTG诱导基因表达。在30'C制牛下振摇20小时之后，收获细胞，并且在-20°C条件下存放。为了，大肠杆菌BL21(DE3)/pPPTA5和大肠杆菌BL21(DE3)/pPSTA菌株，使用pH值为7.2的100mMTris-HC1缓冲液分别将0.4g细胞处理成25%的细胞悬浮液，同时f顿超声波(BandelinSonoplusHD2070:探针MS73;3550%强度)将其处理90秒钟各两次。经过离心分离之后抽取上清液。将所获得的提取物用于12-氧代月桂酸甲酯的转化反应。400pi-批次含有5mM12-氧代月桂酸甲酯，溶于N,N-二甲基甲駒安、500mMDL-丙氨酸、1mM吡哆醛-5'-磷酸盐以及80提取物溶于pH值为7,0的10mMKpi-缓冲液之中。在25'C温度下振摇。经过一定时间之后，分别取样20pl，使用ipl1%的NaOH溶液将一部分调整到碱性pH范围，然后加入100pl醋酸乙酯充分振摇。对有机相进行气相色谱分析(PerkinElmer公司的气相色谱仪，配有火焰离子探测器的Clarus500)。为此j糊Optima5-色谱柱(0.25,,30m，0.25,,Macherey-Nagel〉与下歹诉§)%8(TC25。C/辦中180。C5。C漲中215。C20匸/併中280'C12-氧代月桂酸甲酯和12-氨基月桂酸甲酯的保留时间为7.2或7.7分钟。附图20和21示出转化结果。为了评估，由中性和酸性提取物的色谱图，将12-氧代月桂酸曱酯和12-氨基月桂酸利旨的峰面积相加，然后计算进料物或产物的百分比含量。36序列表<110〉EvonikDegiissaGmbH<120〉生产co-氨基羧酸或其内酰胺的，重组细胞<130>200700667<160〉47<170〉Pat.entln版本3.4<210〉1<211>1380<212>DNA<213>紫色色杆菌"00〉Iat.gcagaagcaacgtacgaccagccaa.tggcgcgaact.ggatgccgcccat.cacctgcat60ccgt.t.caccgat.accgcat,cgct.ga.accaggcgggcgcgcgcgt,gatgacgcgcgga.gag120ggcgt,ctacctgtgggattcggaaggcaacaagatcat.cgacggcat,ggccggact,gtgg180tgcgt.gaa.cgtcggct.acggccgcaaggactttgccgaagcggcgcgccggcagatggaa240gagct.gccgt.tct.acaa.caccttct,tcaagaccacccatccggcggtggt.cgagctgtcc300agcctgctggctgaagtgacgccggccggt.Ucga.ccgcgt.gt.tcta.taccaattccggt.360tccgaatcggtggacac('.aigatccgcatggt.gcgccgctactgggacgt.gcagggcaag420cc;ggagaagaagacgctgatcggc;cgctggaacggctatcacggctccaccatxggcggc480gccagcctgggcggcatgaagtacatgcacgagcagggcgacttgccgattccgggcatg￡|40gcccacatcgagcagcctt.ggtggtacaagcacggcaaggacatgacgccggacgagttc600ggcgtggtggccgcgcgctggctggaagagaagaU,ctggaaatcggcgccgacaaggt,g660gccgcct,tcgtcggcgaacccatccagggcgccggcggcgtgatcgt,cccgccggccacc720tactggccggaaat,cgagcgcatUgccgcaagtacgacgtgct,gctggtggccgacgaa780gtgat.crgcggcttcgggcgtaccggcgaatggtt.cggccatcagcattt.cggcttccag840ccc;gacct,gt,tcaccgccgccaagggcctgt.cctccggctatctgccgataggcgcggtc900tttgtcggcaagcgcgtggccgaaggcctgatcgccggcggcgacttcaaccacggcttc960acctactccggccacccggtct.gcgccgccgtcgcccacgccaacgtggcggcgctgcgc1020gacgagggcatcgtccagcgcgt,caaggacgacat,cggcccgtacatgcaaaagcgctgg1080cgrgaaacctt.cagccgm.cgagcafgtggacgacgt,gcgcggcgtcggcat.ggt,gcag140gcgtt,caccctggtgaagaacaaggcgaagcgcgagct.gttccccga"tcggcgagatc1200ggcacgctgtgccgcgacatcttcUccgcaacaacctgatcatgcgggcatgcggcgac1260cacatcgtgtcggcgccgccgctggtgatgacgcgggcggaagtggacgagatgctggcg1320gt,ggcggaacgctgtctggaggaattcgagcagacgctgaaggcgcgcgggctggcttag1380<210〉2<211〉"37<212〉DNA<213〉枯草芽孢杆菌<化0>2atgat,cat,aggggt.tcctaaagagataaaaaacaatgaaaaccgtgtcgcattaacaccc60gggggcgUtGtcagct,catttcaaacggccaccgggtgctggttgaaacaggcgcgggc120cUggaagcggam,gaaaat.gaagcct,atgagtcagcaggagcggaaatcattgct.gat80ccgaagcaggtctgggacgccgaaatggt.cat.gaaagt.aaaaga'a.ccgct.gccggaagaa240fat,gtttattttcgcaaaggacttgtgctgU,tacgtaccUcatttagcagct.gagcct.300gagcttgcacaggccttgaaggataaaggagtaactgccat.cgcatatgaaacggtcagt360gaaggccggacaUgcctcttctgacgccaatgtcagaggttgcgggcagaatggcagcg420caaatcggcgctcaattcttagaaaagcctaaaggcggaaaaggcattct,gcttgccggg480gt,gcct.ggcgtUcccgcggaaaagtaacaattatcggaggaggcgU'gtcgggacaaac540gcggcgaaaatggctgtcggcct,cggtgcagatgt,gacgatcattgactta貼cgcagac600cgcttgcgccagcttgat.gacatc"cggccat.cagattaaaacgttaatttctaatccg660gtcaat,attgct,gatgctgtggcggaagcggatctcct,catttgcgcggtattaat,tccg720ggt.gctaaagctccgactcttgtcactgaggaaat.ggtaaaacaaatgaaacccggU.ca780gttattgttgatgtagcgatcgaccaaggcggcatcgtcgaaactgtcgaccatatcaca840acacatgatcagccaacatatgaaaaacacggggttgtgcattatgctgtagcgaacatg900ccaggcgcagtccctcgt'acatcaacaatcgccctgactaacgttactgttccatacgcg%0ctgcaaatcgcgaacaaaggggc,agtaaaagcgctcgcagacaatacggcactgagagcg020ggtt,taaacaccgcaaacggacacgtgacct,atgaagctgtagcaagagatctaggcta,t1080gagtatgttcctgccgagaaagctttacaggatgaatcat.cf.gtggcgggtgcttaa137<210〉3<21〉1206<22〉腿〈213〉恶臭假单胞菌<400〉3atgcttgagaaacacagagftctggatt('c:gct,:cagagtargtagataaaaagaaatat60ctctggaractat('.aacUtgtggccggctactccgatgatcggaatctggctt,gcaaat120gaaactgg"gggggatutUatgggctggtattgctcgtatggtacggcgcacttcca180Ugcttgatgcgatgtttggtgaggactttaataatccgcctgaagaagtggtgccgaaa240ct,agagaaggagcggtactatcgagt.tugacat,atctaacagttcctatgcatt,acgct300gcat,t.aatt,gtgtc,agcatggtgggt.cggaactcagccaatgtcft.ggcttgaaattggt360gcgc"gcct.tgtcactgggtat.cgtgaacggactagcgctcaat'acaggacacgaactc420ggtcacaagaaggagacUttgatcgUggat.ggccaaaattgt,gUggct,gtcgtaggg480t,acggtcacttcUtattgagcataataagggtcat,caccgf.gatgtcgctacaccgatg540gat.cctgcaacatcccggatgggagaaagcatttat.aagttttcaatccgt,ga.gatccca600ggagcaUtaUcgt.gcltgggggc"gaggaacaacgcctttcgcgccgtggccaaagc660gtttggagt,t,tcgataatgaaatcctccaaccaatgatcatcacagttattct,ttacgcc7201206gUctccUgccUgtt,tggacct.aagat'gct.ggtgttcctgccgattcaaatggctttc780ggUggtggcagctgaccagtgcgaactatattgaacattacggctt,gctccgtcaaaaa840a言ggaggacggtcgatatgagcatcaaaagccgcaccat.tc"ggaatagtaMcacatc900gt.ctctaatct,agtgctgttccaccttcagcggcactcggat.caccacgcgcatccaaca960cgttcttatcagtcacr.tcgggaUUcccggcctgccggctcttccgacgggttaccct1020ggtgcaUtttgatggcgatgattcct.cagtggtttagatcagttatggatcccaaggta1080gtagattgggctggtggtgacc"朋taa'gat,ccaaattgatgattcgat.gcgagaaacc1140tatUgaaaaaat11ggcactagt.agtgctggtcatagtt.cgagtacc.t,ctgcggtagca1200<210>4<211>519<212>DNA<213>恶臭假单胞菌<400〉4at,ggctagctataaatgcccggaUgfaattatgUtat.gatgagagt.gcgggt.aatgt.g60catgaggggtfftf:tccaggtacgccttggcacc"attcctgaggattggtgctgcccc120gat,tgcgccgrtcgagacaagcttgacttcatgttaattgagagcggcgtaggtgaaaag180ggcgtcac"caancgaacUcgccaaatt,tatccgaggt.tagt,ggcacaagtt,taact,240gctgaagcagt'gg"gcgccgacaagct.tagagaaattgcct.agt,gccgacgttaaaggc300caagatctatataaaactcaacctccaaggtctgatgcccaaggcgggaaagcat,acUg360aagt,ggatatgt,attacttgtggccatatatat'gatgaggegttgggcgatgaggccgag420ggttttactccaggtactcgct"gaggatattcctgatgactggtgct,gtccggattgc480ggggctacgaaagaagaetatgtgctct.acgaggaaaag519<210〉5<21〗〉〗677<212〉DNA<213〉恶臭假单胞菌<400〉53tgtacgactatataatcgt,fggtgctggatct.gcaggatgtgtgcU.gcta&tcgtcU60tcggccgacccctctaaaagagtttgU.tacttgaagctgggccgcgagatacgaatccg120ct,aatt,catatgccgttaggta"gctttgctttcaaatagtaeiaetagttgaattgggct180tttcaaactgcgccacagcaaaatctcaacggccggagcctt.ttctggccacgaggaaaa240acgttaggtggttcaagct,caatcaacgcaatggtctatatccgagggcatgaagacgat300taccacgcatgggagcaggcggccggccgct.actggggttggtaccgggct,cttgagUg360tt.caaaaggcttgaatgcaaccagcga"cgat.aagtccgagcaccatggggttgacgga420gaat,tagctgttagtgatttaaaatatatcaa丄ccgcttagcaaagcattcgt,gcaagcc480ggcatggaggccaatatt.aatttcaacggagatttcaacggcgagtaccaggacggcgta540gggttct.atcaagteiacccaaaaaaatggacaacgctggagctcggcgcgtgcattcttg600cacggtgt:.act.tt,ccagaccaaatctagacat.cat,tactgatgcgcatgcat'caaaaatt660ctttUgaagaccgtaaggcggtt.ggt.gtt,tctt,atataaagaaaaat,atgcaccat,caa720gtcaagacaacgagtggtggtgaagtacU,cUagtcUggcgcagtcggcacgcctcac780cttctaat.gctt'tctggtgt,tggggctgcagccgagctt.aaggaacat,ggtgt,U.ctcta840gtccat,gat.cttcctgaggtggggaaaa"cU,c犯gatcatttggacatcacattgatg900t.gcgcagcaaattcgagagagccgataggtgUgctctttctttcatccctcgtggtgtc960tcgggtttgtt"catat'gtgUtaagcgcgaggggtttct.cactagtaacgtggcagag020tcgggtggttttgt.aaaaagtt.ctcctgat.cgtgatcggcccaaU,tgcagtttcatttc1080cU.ccaacUatcttaaagat.cacggtcgaaaaatagcgggtggttat,ggttatacgcta1140catatatgtgarcttttgGctaagagccgaggcagaattggcctaaaaagcgccaatcca1200ttacagccgc"t.taattgacccgaactatcttagcgat,catgaagatat.taaaaccatg1260attgcgggt.attaagatagggcgcgctat,tttgcaggccccat,cgatggcgaagcatm1320aagcatgaagtagtaccgggccaggctgttaaaactgatgatgaaataatcgaagatatt1380cgt'aggcgagctgagactat.ataccat'ccggtaggtacttgtaggatgggtaaagat,cca1440gcgtcagttgU,gat.ccgt,gcctgaagatccgt.gggtt.ggcaaatattagagtcgtt,gat1500gcgtcaattatgccgcacttggtcgcgggtaacmcaaacgctccaactat.tatgattgca1560gaaaatgcggcagaaataattatgcggaat,cU,gat.gtgga.a.gcat,tagaggct寧gct1620gagtUgctcgcgagggtgcagagct,agagt,tggccat,gatagctgtctgcatgtaa1677<210〉6<211>2649<212>隨<213〉恶臭假单胞菌<400>6atgaaaataataataaataaf.gatUcccggtcgctaaggtcggagcggat,caaat,tacg60act.ctagtaagtgccaaagtt.catagtt,gcatatatcggccaagattgagtatcgcggat,120ggagccgct,cccagagtatgcctU,acagagccccetcctggatatgggaaaaccgttgct180ctt,gcgt.tcgagtggct.acgccacaga.acagccggacgtcctgcagtgtggcUt'ct.tta240agagccagUcU,acagtgaat"gatatctgcgcagagatta"gagcagcttgaaact300Ucgaaatggtaaaa"cagccgtgtgagagagggtgt.gagcaagcct,gcgct'cttgcga360gaccttgcatcfagtctttggcagagcacctcgaataacgagatagaaacgctagtttgt420UggataataUaatcat.gac"agacUgccgUgtt.gcacgcact,tatggagtt,tatg480Uaaatacacca肌aaatatcaggtttgcag"gcaggcaat.ac组a肌agggttct,cg540cagct,t.aaacttgcaggcgctatgcgggagtacaccgagaaagacttggcctt,tagcgca600gaagaggcggtggcg"agcggaggcagagtctgttcttggagttcctgaagaacagata660gagacc"ggtgcaaga.agttgaggggtggcctgct,cUgtagtt.ttt.tt.gttaaagcgt720gagttgcGggocaagc,atatUcagcagtagU.ga.a.gta.gacaattactt.t.agggatgaa.7fi()44atatttgaggcgattcccgagcgctatcgtgtttttcttgcaaattcttcattgctcgat840ttcgtgacgcct,gatcaatacaattatgtattcaaatgcgtcaatggggtctcatgtatt900aagt.att.t,aagcactaat.tacatgttgcttcgccatgtgagcggt,gagccagcgcagUt960acact.gcat.ccagt.actgcgtaat,tt't,ct,acgagaaaU.acttggactgaaaatcctgct,1020aaaagatcctacctgcttaagcgtgcagct.t,tct.ggca.Uggcgtagaggtgaata.ccag1080aHisTrpMet.ProPheSerAlaAsnArgAsnPheGinLys202530AspProArgUelieValAlaAlaGluGlySerTrpLeuThrAspAsp354045LysGlyArgLysValTyrAspSerLeuSerGlyUuTrpThrCysGly505560AlaGlyHisSerArgLy'sGlulieGinGluAlaValAlaArgGinLeu65707580GlyThrLeuAspTyrSerProGlyPheGinTyrGlyHisProLeuSer61859095PheGinLeuAlaGluLyslieAlaGlyLeuLeuProGlyGluLeuAsn100105110HisValPhePheThrGlySerGlySerGluCysAlaAspThrSerlie115120125LysMet,AlaArgAlaTyrTrpArgLeuLysGlyGinProGinLysThr130135140LysLeulieGlyArgAlaArgGlyTyrHisGlyValAsnValAlaGly145150155160ThrSerLeuGlyGlylieGlyGlyAsnArgLysMetPheGlyGinLeu165170175Met.AspValAspHisLeuProHisThrLe"GinProGlyMet.AlaPhe180185190ThrArgGlyMetAlaGinThrGlyGlyValGluLeuAlaAsnGluLeu195200205LeuLysLeulieGluLeuHisAspAlaSerAsnlieAlaAlaVallie210215220ValGluProMetSerGlySerAlaGlyValLeuValProProValGly225230235240TyrLeuGinArgLeuArgGlulieCysAspGinHisAsnlieLeuLeu245250255liePheAspGl"VallieThrAlaPheGlyArgLeuGlyThrTyrSer260265270GlyAlaGluTyrPheGlyValThrProAspLeuMetAsnValAlaLys275280285GinValThrAsnGlyAlaValProMetGlyAlaVallieAlaSerSer290295300GlulieTyrAspThrPheMetAsnGinAlaLeuProGluHisAlaVal305310315320GliiPheSerHis(;lyTyrThrTyrSerAlaHisProValMaCysAla.325330335AlaGlyLeuAlaAlaLeuAsplieLeuAlaArgAspAsnLeuValGin340345350GinSerAlaGluLeuAlaProHisPheGluLysGlyLeuHisGlyLeu355360365GinGlyAlaLysAsnVallieAsplieArgAsnCysGlyLeuAlaGly370375380AlalieGinlieAlaProArgAspGlyAspProThrValArgProPhe385390395400GluAlaGlyLysLeuTrpGinGinGlyPheTyrValArgPheGly405410415GlyAspThrLeuGinPheGlyProThrPheAsnAlaArgProGluGlu420425430LeuAspArgLeuPheAspAlaValGlyGluAlaLeuAsnGlylieAla435440445<210〉22<211〉444<212>PRT<213>铜绿假单胞菌PA01<400〉22Met.ThrMet.AsnAspGluProGnSerSerSerLeuAspAsnPheTrp151015Met.ProPheThrAlaAsnArgGinPheLysAlaArgProArgLeuLeu20253064GluSerAlaGluGlylieHisTyrlieAlaGinGlyGlyArgArglie354045LeuAspGlyThrAlaGlyLeuTrpCysCysAsnAlaGlyHisGlyArg505560ArgGlulieSerGluAlaValAlaArgGinlieAlaThrLeuAspTyr65707580AlaProProPheGinMetGlyHisProLeuProPheGluLeuAlaAla.859095ArgLeuThrGlulieAlaProProSerLeuAsnLysValPhePheThr100105110AsnSerGlySerGliiSerAlaAspThrAlaLeuLyslieAlaLeuAla115120125TyrGinArgAlalie(;lyGinGlyThrArgThrArgLeulieGlyArg130135140GhiLeiiGlyTyrHisGlyVal(;lyPheGlyGlyLeuSerValGlyGly145150155160Met.ValAsnAsnArgLysAlaPheSerAlaAsnLeuLeuProGlyVal165170175AspHisLeuProHisThrLeuAspValAlaArgAsnAlaPheThrVal180185190GlyUiProGluHisGlyValGluLysAlaGluGluLeuGluArgLeu195200205ValThrLeuHisGlyAlaGluAsnlieAlaAlaValieValGluPro210215220MetSerGlySerAlaGlyValValLeuProProLysGlyTyrLeuGin225230235240ArgUuArgGli'lieThrArgLysHisGlylieUuUuliePheAsp245250255GluVallieThrGlyPheGlyArgValGlyGluAlaPheAlaAlaGin260265270ArgTrpGlyValValProAspLeuLeuThrCy,sAlaLysGlyUuThr275280285AsnGlySerlieProMetGlyAlaValPheValAspGluLyslieHis290295300AlaAlaPheMet.GinGlyProGinGlyAlalieGluPhePheHisGly305310315320TyrThrTyrSerGlyHisProValAlaCysAlaAla.AlaLeuAlaThr325330335LeuAsplieTyrArgArgAspAspLeuPheGinArgAlaValGluLeu340345350GluGlyTyrTrpGinAspAlaLeuP〖、eSerLeuArgAspLeuProAsn355360365ValValAsplieArgAlaValGlyLeuValGlyGlyValGinLeuAla370375380ProHisAlaAspGlyProGlyLysArgGlyTyrAspValPheGluArg385390395400CysPheTrpGluHisAspLeuMet.ValArgValThrGlyAsplielie405410415AlaMetSerProProLeulielieAspLysProHislieAspGinlie420425430ValGuArgUuAlaGinAlalieArgAlaSerVal43544067<210>23<211>468<212〉PRT<213〉铜绿假单胞菌PA01<400>23Met.AsnAlaArgUiiHisAlaThrSerProLeuGlyAspAlaAspLeu151015ValArgAlaAspGinAlaHisTyrMetHisGlyTyrHisValPheAsp202530AspHisArgValAsnGlySerLeuAsnlieAla,Ala.GlyAspGlyAla354045TyrlieTyrAspThrAlaGlyAsnArgTyrLeuAspAlaValGlyGly505560Met,Tr'pCysThrAsnlieGlyLeuGlyArgGluGluMet.Ala.ArgThr65707580ValAlaGluGinThrArgLeuLeuAlaTyrSerAsnProPheCysAsp859095Met.AlaAsnProArgAlalieGluLe'iCysArgLysUuAlaGluLeu100105110AlaProGlyAspLeuAspHisValPheLeuThrThrGlyGlySerThr115120125AlaValAspThrAlalieArgLeuMetHisTyrTyrGinAsnCysArg130135140GlyLysArgAlaLysLysHisVallieThrArglieAsnAlaTyrHis145150155160GlySerThrPheLeuGlyMetSerLeuGlyGlyLysSerAlaAspArg165170175ProAla(;luPheAspPheLeuAspGluArglieHisHisLeuAlaCys180185190ProTyrTyrTyrArgAlaProGluGlyUuGlyGluAlaGluPheLeu195200205AspGlyUuValAspGluPheGluArgLyslieLeuGluLeuGlyAla210215220AspArgValGlyAlaPhelieSerGluProValPheGlySerGlyGly225230235240VallieValProProAlaGlyTyrHisArgArgMetTrpGluLeuCys245250255GinArgTyrAspValLeuTyrlieSerAspGluValValThrSerPhe260265270GlyArgLeuGlyHisPhePheAlaSerGinAlaValPheGlyValGin275280285ProAsplieIeU，jThrAlaLysGlyLeuThrSerGlyTyrGinPro290295300LeuGlyAlaCysliePheSerArgArglieTrpGluVallieAlaGlu305310315320ProAspLysGlyArgCysPheSerHisGlyPheThrTyrSerGlyHis325330335ProValAlaCysAlaAlaAlaLeuLysAsnlieGlulielieGluArg340345350GluGlyLeuLeuAlaHisAlaAspGluValGlyArgTyrPheGluGlu355360365ArgLeuGinSerLeuArgAspLeuProlieValGlyAspValArgGly370375380MetArgPheMetAlaCysValGluPheValAlaAspLysAlaSerLys385390395400AlaLeuPheProGluSerLeuAsnlieGlyGluTrpValHisLeuArg405410415Ala.GinLysArgGlyUuLeuValArgProlieVa.lHisLeuAsnVal420425430Met.SerProProLeulieLeuThrArgGl"GinValAspThrValVal435440445ArgValLeuArgGluSerlieGluGluThrVa.lGluAspUuValArg450455460AlaGlyHisArg465<210〉24<2U>460<212〉PRT<213>恶臭假单胞菌W619<400>24Met,AsnAlaProPheGinProGinArgAspThrArgAspTyrGinAla151015SerAspAlaAlaHisHisIeHisAlaPheLeuAspGinLysAlaLeu202530Asn"a.GluGlyProArgVallieThrArgGlyGluArgLeuTyrLeu354045TrpAspAsnAspGlyArgArgTyrLeuAspGlyMetSerGlyUuTrp505560CysThrGinLeuGlyTyrGlyArgLysAspLeuThrAlaAlaAlaAla65707580AlaGinMetAspfilnLeuAlaTyrTyrAsnMetPhePheHisThrThr859095HisProAlaVallieGluLeuSerGluLeuLeuPheSerLeuLeuPro100105110GlyHisTyrSerHisAlalieTyrThrAsnSerGySerGluAlaAsn115120125GluValLeulieArgThrValArgArgTyrTrpGinValValGlyGin130135140ProAsnLysLysValMetlieGlyArgTrpAsnGlyTyrHisGlySer145150155160AlaAlaThrAlaUuGlyGlyMetLysPheMetHisGluMet165170175GlyGlyLeulieProAspValAla.HislieAspGluProTyrTrpTyr180185190AlaGluGlyGlyGluLeuThrProAlaGluPheGlyArgArgCysAla195200205LeuGinLeuGluGluLyslieLeuGluLeuGlyAlaGluAsnValAla210215220GlyPheValAlaGluProPheGinGlyAlaGlyGlyMet.liePhePro225230235240ProGluSerTyrTrpProGlulieGinArglieCysArgGinTyrAsp245250255ValLeuLeuCysAlaAspGluVallieGlyGlyPheGlyArgThrGly260265270GluTrpPheAlaHisGluTyrPheGlyPheGluProAspThrLeuSer275280285lieAlaLysGlyLeu"irSerGlyTyrValProMetGlyGlyLeuVa290295300LeuSerLysArglieAlaGluAlaLeuVa.lGluArgGlyGlyValPhe305310315320AlaHisGlyLeuThrTyrSerGlyHisProValAlaAlaAlaVa〗Ala325330335lieAlaAsnUuLysAiaLeuArgAspGluGlylieValArgGinVal340345350LysAspAspThrGlyProTyrLeuGinArglieLeuArgGluValPhe355360365AlaAsnHisProLeiilieGlyGinValGinGlyAlaGlyLeuValAla:370375380AlaLeuGinPheAlaGluAspLysGlySerArgLysArgTyrAlaAsn385390395400GluAsnAspLeuAlaTrpGinCysArgThrTyrGlyPheGluGluGly405410415VallielieArgSerThrLeuGlyArgMetlieMetAlaProAlaLeu420425430ValAlaThrHisGlyGluLeuAspGluLeuValAspLysThrArglie435440445AlaValAspArgThrAlaArgGlyLeuGlylieLeu450455460<210〉25<211〉459<212〉PRT<213>恶臭假单胞菌KT2440<400>25MetSerThrHisSerSerThrValGinAsnAspLeuAlaAlaLeulie151015HisProAsnThrAsnLeuAlaGinHisArgGluValGlyProLeuVal202530lieAlaArgGlyAspGlyValArgValPheAspGluGinGlyAsnAla354045TyrlieGluAlaMet.SerGlyLeuTrpSerAlaAlaUuGlyPheSer505560GluGinArgLeuValAspAlaAlaValGluGinPheLysGinLeuPro65707580TyrTyrHisSerPheSerHisLysThrAsnAlaProAlaAla.AlaLeu859095AlaAlaLysLeuAlaAlaLeuAlaProGlyAspLeuAsnHisValPhe100105110PheThrAsnSerGlySerGluAlaAsnAspSerValValLysMetVal115120125TrpTyrValAsnAsnAlaLeuGlyArgProAlaLysLysLysPhelie130135140SerArgGinGinAlaTyrHisGlyAlaThrValAlaAlaAlaSerLeu145150155160ThrGlylieProSerMetHisArgAspPheAspUuProAlaliePro165170175ValHisHisLeuThrCy,sProAsnPheTyrArgPheAlaArgProGly180185190GluSerGinGluAlaPheThrValArgLeuAlaAsnGluLeuGluArg195200205TyrlieLeuAlaGluGlyProGluThrlieAlaAlaPhelieGlyGlu20215220ProVallieAlaAlaGlyGlyVallieProProProThrGlyTyrTrp225230235240AlaAlalieGinAlaValCysLysArgTyrAsplieLeuValVallie245250255AspGlulielieThrGlyPheGlyArgUuGlyThrMetPheGlySer260265270GinLeuTyrGlylieGinProAsplieMetValLeuSerLysGinLeu275280285ThrSerSerTyrGinProLeuAlaAlaValValValSerAspAlaMet290295300AsnAspValLeuValSerGinSerGinArgLeuGlyAlaPheAlaHis305310315320GlyLe"Thr(:ysThr(;lyHisProValAlaThrAlaValAlaLeuGlu325330335AsnlieArglielieGluGluArgAspLeuVaGlyHisValGinHis340345350LeuAlaProValPheGinArgHisUuArgAlaPheGluAspHisPro355360365LeuValGlyAsnValArgGlyValGlyLeuMetGlyGlylieGluLeu370375380ValAlaAspLysAlaThrArgGinProPheAlaGinProGlyThrLeu385390395400GlyGlyTyrValPheLysGinAlaHisLysHisGlyLeulielieArg405410415AlalieTyrAspThrlieAlaPheCysProProLeulieThrThrGin420425430AspAsplieGluAlaliePheSerAlaPheGluArgThrLeuAlaAsp435440445AlaThrAspTrpAlaArgSerGinHisLeuLeu450455<210>26<211>490<212〉PRT<213〉恶臭假单胞菌W619<400〉26Met.ArglieSerSerValSerSerAlaProGlySerValSerSerCys151015CysLeuLeuCysAspGinProLeuArgProProAla(;lyGlyLeuTrp202530ThrLeuGluLysHisMetSerValLysAsnProGinThrArgAspTrp354045GinThrLeuSerGlyGluHisHisLeuAlaProPheSerAspTyrLys505560GinLeuLysGluLysGlyProArglielieThrLysAlaGinGlyVal65707580HisTrpAspSerGluGlyHisLyslieAspGlyMetAlaGly859095LeuTrpCysValAlaValGlyTyrGlyArgGluGluLeuValGinAla100105110AlaGluLysGliMetArgGluLeuProTyrTyrAsnLeuPhePheGin115120125ThrAlaHisProProAlaLeuGluLeuAlaLysAlalieThrAspVal130135140AlaProGluGlyMet.ThrHisValPhePheThrGlySerGlySerGlu145150155160GlyAsnAspThrValLeuArgMet.ValArgHisTyrTrpAlaLeuLys165170175GlyLysProGinLysGinThrlielieGlyArglieAsnGlyTyrHis180185190GlySerThrValAlaGlyAlaSerUuGlyGlyMetSerGlyMetHis195200205GluGinGlyGlyLeuProlieProGlylieValHislieProGinPro210215220TyrTrpPheGlyGluGlyGlyAspMet.SerProAspAspPheGlyVal225230235240TrpAlaAlaGluGinLeuGluLysLyslieUuGluValGlyGluAsp245250255AsnValAlaAlaPhelieAlaGluProlieGinGlyAlaGlyGlyVal260265270lielieProProGluThrTyrTrpProLysValLysGlulieLe"Ala275280285LysTyrAsplieLeuPheValAlaAspGluVallieCysGlyPheGly290295300ArgThrGlyGluTrpPheGlySerAspTyrTyrAspLeuLysProAsp305310315320LeuMetThrlieAlaLysGlyLeuThrSerGlyTyrlieProMetGly:)25330335GlyVallieValArgAspLysValAlaLysValLeuSerGluGlyGly340345350AspPheAsnHisGlyPheThi'TyrSei'GlyHisProValAlaAlaAla355360365ValGlyLeufiluAsr>LeuArglieUuArgGluGluLyslieValGlu370375'扁LysValArgThrGluValAlaProTyrLeuGinLysArgLeuArgGlu385390395400LeuGinAspHisProLeuValGlyGluValArgGlyLeuGlyUuLeu405410415GlyAlalieGluLeijValLysAspLysAlaSerArgSerArgTyrGlu420425430GlyLysGlyValGlyMet,ValCysArgAsnPheCysPheAspAsnGly435440445LeulieMetArgAlaValGlyAspThrMetlielieAlaProProLeu450455460VallieSerHisAlaGluValAspGluLeuValGluLysAlaArgLys465470475480CysLeuAspLeuThrLeuGluAlalieArg485柳<20>27<211〉457<212〉PRT<213〉天蓝色链霉菌A3(2)<400〉27MMSerThrAsp'SerProLysAspSerArgThrAlaTyrAspHis151015UuTrpMetHisPheThrArgMet.SerSerTyrGluAsnAlaProVal202530ProThrlieValArgGlyGluGlyThrHislieTyrAspAspLysGly354045ArgArgTyrLeuAspGlyLeuAlaGlyLeuPheValValGinAlaGly505560HisGlyArgGinGluLeuAlaGluThrAlaSerLysGinAlaGinGlu65707580UuAlaHiePheProValTrpSerTyrAlaHisProLysAlaValGlu859095LeuAlaGluArgLeuAlaAsnGluAlaProGlyAspLeuAsnLysVal10010510PhePheThrThrGlyGlyGlyGluAlaValGluThrAlaTrpLysLeu115120125AlaLysGinTyrPheLysUuThrGlyLysProThrLysTyrLysVal135140lieSerArgAlaValAlaTyrHisGlyThrProGinGlyAlaLeuSer145150155160lieThrGlyLeuProAlaLeuLysAlaProPheGluProLeuValPro165170175GlyAlaHisLysValProAsnThrAsnlieTyrArgAlaProlieHis180185190GlyAspAspProGluAlaTyrGlyArgTrpAlaAlaAspGinlieGlu195200205GinGinlieUuPheGluGlyProGluThrValAlaAlaValPheUu210215220GuProValGinAsnAlaGlyGyCysPheProProProProGlyTyr225230235240PheGinArgValArgGlulieCysAspGinTyrAspValUuLeuVal245250255SerAspGluVallieCysAlaPheGlyArgLeuGlyThrThrPheAla260265270CysAspLysPheGlyTyrValProAspMetlieThrCysAlaLysGly275280285MetThrSerGlyTyrSerProlie(;lyAlaCysVallieSerAspArg290295300UuAlaGluProPheTyrLysGlyAspAsnThrPheLeuHisGlyTyr305310315320ThrPheGlyGlyHisProValSerAlaAlaValGlylieAlaAsnLeu325330335AspLeuPheGluArgGluGlyUuAsnGinHisValLeuAspAsnGlu340345:歸GlyAlaPfieArgAlaThrUuGluLysUuHisAspLeuProlieVal355360365GlyAspValArgGlyAsnGlyPhePheTyrGlylieGluLeuVa.lLys370375:则AspLysAlaThrLysGluSerPheAspGluGluGluThrGluArgVal:,390395柳LeuTyrGlyPheLeuSerLysLysLeuPheGluAsnGlyLeuTyrCys405410415ArgAlaAspAspArgGlyAspProVailieGinLeuAlaProProLeu420425430lieSerAsnGinGluThrPheAspGlulieGluGinlieLeuArgAla435440445ThrUuThr.G]uAlaTrpThrLysUu450455<21()〉28<211〉459<212〉PRT<213>阿维链霉菌MA4680<400>28Met.GyAsnProlieAlaValSerLysAspLeuSerArgThrAlaTyr151015AspHisLeuTrpMet,HisPheThrArgMetSerSerTyrGluAsnAla202530ProValProThrlieVaArgGlyGluGlyThrTyrlieTyrAspAsp:〗54045LysGlyLysArgTyrUuAspGlyLeuSerGlyLeuPheValVaiGin505560AlaGlyHisGlyArgThrGluLeuAlaGluThrAlaPheLysGinAla65707580GinGluLeuAlaPhePheProValTrpSerTyrAlaHisProLysAla859095ValGluLeuAlaGluArgLeuAlaAsnTyrAlaProGlyAspUuAsn100105110LysValPhePheThrThrGlyGlyGlyGluAlaValGluThrAlaTrp115120125LysLeu/UaLysGlt、TyrPheLysUuGinGlyLysProThrLysTyr130135140LysVa.llieSerArgAlaValAlaTyrHisGly.ThrProGinGlyAlaM5150155160LeuSerlieThrGlyLeuProAlaLeuLysAlaProPheGluProLeu165170175ValProGlyAlaHisLysValProAsnThrAsnlieTyrArgAlaPro180185190Phe(;lyAspAspPro(;luMaP、ie"yArgTrpAlaAlaAsp(Un195200205lieGluGinGinlieLeuPheGluGlyProGluThrValAlaAlaVal210215220PheLeuGluProValGinAsnAlaGlyGlyCysPheProProProPro225230235240(UyTyrPheGluArgValArg(;lulieCysAspGinTyrAspValLeu24525025587LeuValSerAspGluVallieCysAlaPheGlyArgLeuGlyThrMet260265270Pl)eAlaCysAspLysPheGlyTyrValProAspMet,lieThrCysAla275280285Lys(;lyM".ThrSerGlyTyrSerProlieGlyAlaCyslieValSer290295300AspArglieAlaGluProPheTyrLysGlyAspAsnThrPheLeuHis305310315320GlyTyrThrPheGlyGlyHisProValSerAlaAlaValGlyValAla325330335AsnUuAspLeuPheGluArgGluGlyLeuAsnGinHisValLeuAsp340345350AsnG_luSerAlaPheLeuThrThrLeuGinLysUuHisAspLeuPro355360365lieValGlyAspValArgGlyAsnGlyPhePheTyrGlylieGluLeu370375380ValLysAspLysAlaThrLysGluThrPheThrAspGluGluSerGlu385390395400ArgValLeuTyrGlyPheValSerLysLysLeuPheGluTyrGlyLeu405410415TyrCysArgAlaAspAspArgGlyAspProVallieGinLeuSerPro420425430ProLeulieSerAsnGinSerThrPheAspGlulieGluSerlielie435440445ArgGinValLeuThrGluAlaTrpThrLysLeu450455<210>29<211〉450<212>PRT<213>阿维链霉菌MA4680<400〉29Met.ThrProGinProAsnProGinValGlyAlaAlaValLysAlaAla151015AspArgAlaHisValPheHisSerTrpSerAlaGinGluUulieAsp202530ProLeuAlaValAlaGlyAlaGluGlySerTyrPheTrpAspTyrAsp354045GlyArgArgTyrLeuAspPheThrSet'GlyLeuValPheThrAsnlie505560GlyTyrGl,iHisProLysValValAlaAlalieGinGluGinAlaAla65707580SerLeuThrThrPheAlaProAlaPheAlaValGluAlaArgSerGlu859095AlaAlaAr'gLeulieAlaGluArgThrProGlyAspL^uAspLyslie彻105110PhePheTlirAsnGlyGlyAlaAspAlalieGluHisAlaValArgMet115120125AlaArgUeHisThrGlyArgProLysValLeuSerAlaTyrArgSer130135140TyrHisGlyGlyThrGinGinAlaValAsnlieThrGlyAspProArgM515055160ArgTrp/UaSerAspSerAlaSerAlaGlyValValHisPheTrpAla.16517017590ProTyrLeuTyrArgSerArgPheTyrAlaGluThrGluGinGinGlu180185190CysGluArgAlaUuGluHisLeuGluThrThrlieAlaPheGluGly195200205ProGlyThrlieAlaAlalieValLeuGluThrValProGlyThrAla210215220GlylieMet.ValProProProGlyTyrLeuAlaGlyValArgGluLeu225230235240CysAspLysTyrGlylieValPheValUuAspGluValMet.AlaGly245250255PheGlyArgThrGlyGluTrpPheAlaAlaAspUuPheAspValThr260265270ProAspMet.ThrPheAlaLysGlyValAsnSerGlyTyrValPro275280285LeuGlyGlyValAlalieSerGlyLyslieAlaGluThrPheGlyLys290295300ArgAlaTyrProGlyGlyLeuThrTyrSerGlyHisProLeuAlaCys305310315320AlaAlaAlaValAlaThrlieAsnValMetAlaGluGluGlyValVal325330335(UuAsnAlaAlaAsnLeu(;lyAlaArgVa.llieGluProGlyLeuArg340345350GluLeuAlaGluArgHisProSerValGlyGluValArgGlyValGly355360365MetPheTrpAlaLeuGhiUuValLysAspArgGluThrArgGluPro370375380LeuValProTyrAsnAlaAlaGlyGluAlaAsnAaProMetAlaAla.385390395400卩heGlyAlaAlaAla.LysAlaAsnGlyLeuTrpProPhelieAsnMet,405410415AsnArgTlu'HisValValProProCysValThrGluAlaGluAla420425430LysGluGlyLeuAlaAlaLeuAspAlaAlaLeuSerValAlaAspGlu435440445TyrThr450<210>30<211〉446<212>PRT<213>紫色色杆菌ATCC12472<400〉")MetAsnHisProLeuThrThrArgSerGluPheAspHisLeuAspLeu151015ArgAlaHisTrpMet.ProPheSerAlaAsnArgAsnPheGinArgAsp202530ProArgUulieVa.lSerGlyGluGlyAsnTyrLeuThrAspAla.Asp354045GlyArgArgliePl化AspSerUuSer(;lyLeuTrpCysCysGlyAla,505560GlyHisSerArgLysGlulieAlaGluAlaAlaTyrArgGinLeuSer65707580ThrLeuAspTyrSerProGlyPheGinPheGlyHisProUjuSerPhe859095ArgUuAlaGluArgValAlaAlaMetAlaProGlyAlaUuAsnHis100105110ValPhePheThrAsnSerGlySerGluCysAlaAspThrAlaValLys115120125Met.AlaArgAlaTyrTrpArgLeuLysGlyGinAlaSerLysThrLys130135140LeulieGlyArgAlaArgGlyTyrHisGlyValAsnlieAlaGlyThr145150版160SerUuGlyGlyMetAsnGlyAsnArgLysLeuPheGlyProLeuMet.165170175AspAlaAspHisLeuProHisThrLeuLeuProAlaAsnAlaPheSer180185190ArgGlyUuProGluGinGlyAlaGluLeuAlaAspAspLeuLeuArg195200205HeGluLeuHisAspAlaSerAsnlieAlaAlaVallieValGlu210215220ProMetAlaGlySerAlaGlyVallieValProProGinGlyTyrLeu225230235240GinArgUuArgGlulieCysThrGinHisGlylieLeuLeuliePhe245250255AspGluVallieThrGlyPheGlyArgThrGlySerLeuPheGlyAla260265270AspHisPheGlyValThrProAsplieMetAsnLeuAlaLysGinLeu275280285ThrAstiGyAaVaProMetGlyAlaValValAlaSerSerGlulie290295300TyrAspAlaPheMet.AlaGinAlaThrProGluTyrAlaValGluPhe305310315320AlaHisGlyTyrThrTyrSerAlaHisProValAlaCysAlaAlaAla325330335LeuAlaAlaLeuAspValLeuGluGinGluAsnLeuValAlaArgAla340345350Ala.(;luLeuAlaPr()HisPheGluArgGlylieHisGlyLeuLys(;ly355360365LeuProHisVallieAsplieArgAsnCysGlyUuAlaGlyAlaVal370375380GinlieAlaProSerGlyGlyAspAlalieValArgProTyrGluAla385390395400AlaMetAlaLeuTrpArgLysGlyPheTyrValArgTyrGlyGlyAsp405410415AlaLeuGinPheGlyProProPheThrAlaThrProGinGluUuAsp420425430SerLeuPheAspAlaValGlyGluThrLeuAlaLysLeuAla435柳445<210〉31<211〉U539<212>DNA<213〉人工<220〉<223〉载体<400〉31gaaaaccgccactgcgccgttaccaccgctgcgttcggtcaagg"ctggaccagttgcg60t.gagcgcat.acgct.actt.gcat.tacagUtacgaaccgaacaggctt.at.gtcaatt.cgcc120tct,caggcgccgct.ggt.gccg(:tggt.t.ggacgccaagggt.gaatccgcct.cgat.accctg180a.Uactcgct.tcctgcgccctct.caggcggcgat.a.ggggact.ggt.aaaacgggga,t.t.gcc240cagacgcctcccccgcccctt.caggggcacaaat,gcggccccaacggggccacgtagtgg300tgcgttttt,tgcgt,ttccaccctttt,ct.tcctt,ttcccttt,taaaccttttaggacgtct360acaggccacgtaat.ccgtggcctgtagagtttaaaaagggacggatttgttgccaU.aag420ggacggautgU'gttaagaagggacggat,U.gttgt.tgt.aaagggacggatt.t,gUgU480ttgtgggacgcagatacagtgtccccttat,acacaaggaatgtcgaacgtggcctcaccc540ccaatggtttacaaaagcaat,gccctggtcgaggccgcgt.atcgcct,cagtgttcaggaa600cagcggatcgttctggcctgtattagccaggtgaagaggagcgagcctgtcaccgatgaa660gtgatgt'at.t.cagtgacggcggaggacatagcgacgat'ggcgggtgtccctatcgaatct720tcctacaaccagctcaaagaagcggccctgcgcctgaaacggcgggaagtccggttaacc780caagagcccaatggcaaggggaaaagaccgagtgtgatgat.t,accggctgggtgcaaaca840at.catctaccgggagggtgagggccgtgtagaactcaggttcaccaaagacat,gct,gccg900tacct.gacggaactcar丄aaacagttcaccaaatacgccttggctgacgt.ggccaagatg960gacagcacccacgcgatcaggctttacgagctgctcatgcaatgggacagcatcggccag1020cgcgaaatagaaattgaccagctgcgaaagtggtt,tcaactggaaggccggtatccctcg1080atcaaggacttcaagttgcgagt.gcttgatccagccgtgacgcagat.caacgagcacagc1140ccgctacaggtggagtgggcgcagcgaaagaccgggcgcaaggtcacacatctgttgttc1200agttttggaccgaagaagcccgccaaggcggtgggtaaggccccagcgaagcgcaaggcc1260gggaa.ga"fc'agatgagatcgcgaaacaggc'rcgccct,ggtgagacatgggaagcg1320gcccgcgctcgactaacccagatgccgctggat.ctggcct.agaggccgtggccaccacggK则cccggcctgcctttcaggctgcatt.attgaagcatttatcagggttattgtctcatgagc1440ggatacat-atttgaa.tgt,attt,agaaaaat誠acaaaagagt,t,tgtagaaacgcaaaaag1500gccatccgtcaggatggccttcT.gcttaatttgat.gcct.ggcagtt,tatggcgggcgtcc1560tgcccgccaccct,ccgggrr,gttg〔,ttcgcaacgttcaaatccgctcccggcggatttgt1620cc〖,act,caggagagcgttcaccgacaaacaacagataaaacgaaaggcccagtct,ttcga1680ctgagcct.ttcgttttatttga.t.gcct.ggcagtt,ccctactctcgcatggggagacccca1740cact,accatcggcgct.acggcgtttcact.tctgagttcggcatggggtcaggtgggacca1800ccgcgctact,gccgccaggcaaaU.ct.gttttatcagaccgcttctgcgttctgat,t,taa1860t,ctgtatcaggctgaaaatcUctctcatccgccaaaacagaagcttggctgcaggtcga1920caagcgctgaatgggtatcggcactagagtUaacUggct.aggct,aatt.ggtat,ggtca198Q"t.ttattU,gtcctgaattacctagaat.gacU,gaagttttaatct,tcacttttcctcg2040tagagcacat,agtcU,cUt.cgtagccccgcaatccggacagcaccagt.catcaggaata2100toct.caaagcgagt,acctggagtaaaaccct.cggcctcatcgcccaacgcctcatcatat2160atat,ggccacaagtaatacatatccactt,caagtatgctttcccgcct.tgggcatxagac2220ct,tggaggtt.gagtt,Uatatagatct.tggcctttaacgtcggcactaggcaatttctct2280aagcTtgt.cggcgcaaccactgcttcagcagtt,aaact,t.gtgccactaacctcggataaa2340tt.tggcgaagtatgggugaggtgacgcM,tToacctacgccgctctc'aat,t,aacatg2400aagtcaagctt,gtctcgaacggcgcaatcggggcagcaccaatcctcaggaataaggtgc2460caaggcgtacct.ggagaaaacccctcat.gcacattacccgcactct,catcataaacataa2520tt,acaatccgggcattt'atagctagccatactcatcaccatgtcaaattgttattttgcg2580ttgcggcaaattt,gcgttatt'tatttctcat.cttctt,cct,tgtggaagattttcttacaa2640cctgtggggtgctcgcctgat"caagaacttcagtcttagccgcacagccct,catttttat-2700tttctt.gattaagtgggat,cactaattctgcggceaaaactgccattccag"ggagt.a.g2760catctgaaataccactttccgagttggcaagctgactattcacccctagctgtgtttctt2820tcgagggagaatccgcgagaaagataaagtccaccttgtctcgaactgcgcagtccgggc2880atgcccaatctttggggatatcattccagctggtgttcgggtggaaaccttcgtgcggct2940cccccttattttcatcatagatatactga(:aatct.ggacactggt,accttgacat.tctcc3000cact.ctcctaUaacrc'agcgtt,agtcgctgctccgacaacHcatcagagtgtaactat3060cggagcaggtcgcctt,caaagcaattaeagagaggcaatcaaccctcagcact.ttagoga3120agtgcactct'tt,gtgagagct,tt.caacgccgcacataaaattgaagcactt,attgtaaat3180atcgaccgccgggctctgcgtgct.cacataactacgatgctaccgcagaggtact.cgaac3240t.at,gaccagcactactagtgccaaattttttcaaat,aggtttctcgcatcgaatcatcaa3300t,t,tggatct.t'attaaggtcaccaccagcccaatctactaccttgggatccataactgatc3360taaaccactgaggaatcatcgccatcaaaaatgcaccagggtaacccgtcggaagagccg3420gcaggccgggaaaat.cccgaagtgactgataagaacgtgttggatgcgcgtggtgatccg3480agtgccgctgaaggtggaacagcactagattagagacgatgtgattactattccaagaat3540ggtgcggcttttgatgctcatatcgaccgt,cctccattttt,t,gacggagcaagccgtaat3600g"caatatagttcgcactggtcagctgccaccaaccgaaagccatttgaatcggcagga3660acaccagcat.ct,taggtccaaacaaggcaaggagaacggcgtaaagaa.taactgtgat,ga3720tcatt.ggttggaggat.tt,catratcgaaactccaaacgct"ggccacggcgcgaaaggc3780gt,tgttcctcaagcccccaagcacgaat'aaatgctcct.gggat,ctcacggattgaaaact3840tataaatgctUct(、-c:('atccgggatgttgcaggat.ccatcggtgtagcgacatcacggt:柳Ogat,gacccttaUat,gctcaataaagaagtgaccgtaccctacgacagccaacacaat-tt-3960t,ggccatccaacgatcaaaagtctccttcttgtgaccgagttcgtgtcctgtattgagcg4020ctagt,ccgt.tcacgatacccagtgacaaggcaagcgcaccaatttcaagccaagacattg4080gctgagUccgacccar.catgctgacacaattaat,gcagcgtaatgcata.ggaactgtt.a4140gatatgtcaaaactcgatagtaccgc:t,cct.t.ctctagUtcggcaccact,t,c"caggcg4200gatt.attaaagtcct.caccaaacatcgcatcaagcaatggaagtgcgccgt,accatacga4260gcaataccagcccataaaaaat,cccccaaccagtt,t,catttgcaagccagatt,ccgatca4320tcggagt,agccggccacaaagttgatagtatccagagatatttctttttatctacgtact4380ctggagcggaatccagaactctgtgtttctcaagcat.at.ggaat,tct.ccaatt,tttatta4440aaUagtcgctacgagatt,t.aagacgtaattttatgcctaactgagaaagttaagccgcc4500cactct.cactct,cgacatcttaaacct.gagct.aatcggacgct,tgcgccaactacacct.a4560cgggtagtttUgctccgt'cgtctgctggaaaaacacgagctggccgcaagcatgccagg4620t,accgcgagctactcgcgacggctgaaagcaccgaaatgagcgagctatctggtcgattt4680t,gacccggt,gcccgtctfcaaaatcggcgaaggccgaagf.cggccagaaat.agcggccta4740c:tt.cagaccttcr'ctagt.aaatattttgcaccaccgatcatgccgact,acacttaagtgt4800agt"taafatt〖aacaccgfaacctatggtgaaaatttccagt.cagctggcgcgagaat4860agcataatgaaaataataat,aaataatgat"cccggtcgctaaggt,cggagcggatcaa4920ar.f.acgactctagtaagtgccaaagUcatagttgcat.atatcggccaagat.tgagtatc4980gcggatggagccgct.cccagagt.atgectttacagagccccacctggatatgggaaaacc5040gttgct,cttgcgttcgagtggctacgccacagaacagccggacgtcctgcagtgtggct.t5100tct"aagagccagttcttacagtgaatttgatatctgcgcagagattattgagcagctt5160gaaacUtcgaaatggt,aaaattcagccgtgtgagagagggtgtgagcaagcctgcgctc5220ttgcgagaccttgcatctagt.ct,tfggcagagca.cctcgaat.aacgagatagaaacgcta5280gt.ttgm.ggataataHaatcatga〔'-"agacttgccgttgt.t.gcacgcactta.tgga.g5340tUatgttaaatacaccaaaaaat.at.caggtttgcagttgcaggcaatacaataaaaggg5400",ct,cgcagcttaaact.t,gcaggcgct,atgcgggagtacaccgagaaagacttggcct.tt5460agcgcagaagaggcggtggcgttagcggaggcagagtctgttcttggagttcctgaagaa5520101cagatagagacctt,ggtgcaagaagttgaggggtggcct,gctcttgtagtttttttgtta5580aagcgtgagtt,gccggccaagr,at.a"tcagcagt.agttgaagtagacaattactU,agg5640gatgaaatatttgaggcgattcccgagcgctatcgt,gUtttcttgcaaatt.ct,t.cat,tg5700ctcgatt.tcgtgacgcctgat.caatacaattatgtattcaaatgcgtcaatggggtctca5760tgtattaagtatttaagcactaattacatgttgcUcgccatgtgagcggtgagccagcg5820cagtttacactgcatccagt.act.gcgt,aatt,ttctacgeigaaattact.t.ggact.gaaaat5880cctgctaaaagatcctacctgcttaagcgtgcagcttt.ctggcattggcgtagaggtgaa5940taccagtatgcaat.acgaatat.ccctacgggcgaatgactgtcgctgggcagtcagcatg6000t.ctgagagaataatt,ttagatttgtcatttcgtcagggcgaaatagatgcgct,gagacag6060tggct,gtt,agagctgcegaagcaggcctggcaccaaaaacccatagtgcttat,tagttac6120gcgt.gggtat.tgtatttcagt.cagcaaggcgcgcgagcagagaagttaattaaagacct.a.6180t.cttcacaat.ccgat.aaaaaaaat,aaatggcaagaaaaggaatggctgcagctt,gtgctt,6240gcaataggtaaagcaaccaaagatgaaatgctttcgagtgaggagctct.gtaataagt.gg6300att,agtttatttggggattcaaacgcagttggaaaaggggccgcgctaacctgtttggct6360tt.tattt.tt.gccagtgagtatagatttgcagagttggagaaggtgctggctcaggcccaa6420gccgtgaataaatttgcaaaacaaaatrttgcttttggt.t,ggct.gtatgtcgcgaggtt.t6480caacaagccctagcaagcggaaaaat.gggct,gggcgaggcagattataactcaagcacgc6540acagacagtcgcgcgcagatgatggaatccgagtttacttcgaaaatgtttgacgctcta6600gagctt.gagttacatt,atgaattgcgctgct,t,ggacacctcagaagaaaagctctccaaa6660atutagagttcat"ccaatcacggggtgacagacgtgttt.tUtccgtat,gccgt,gct,6720gtgtca.gcUggcgg("tggaaggagtgacctaaatggctccat,tgagatattggagtgg6780gcgaaggcgcatgcggtt,gaaaaaaatctaccaagattggaagttatgagccaaattgag6840atctatcagcgcttagtctgtcaaggcataacgggcataaataatttaaaaactcttgaa6900gat,cataagatt.t.tctccggacagcactcagcccccctaaaagcacgcctgctgcttgt,t6960c'dat,cac:tagt,gctttcccgagatcggaact,ttcatagtgccgcgcacagagcgttattg7020gctartcagcaaUaacgcgggccagctggaagtccgtggat.t.at.tgtgt7080ttggccggagcgcaggcaggtgccggtgatt.taaaaaaggct.cagcUaacattgt.t,tat7140gcagtggagatagcaaaacagcttcaatgctttcaaacagUcttgatgaagtat,gttta7200attgagcgaataataccggcUcatgtgaagccttcacagcagttaat,ttagat,caagcg7260attggggcUUagtct,tccgcgaatagUgagatt.ggaaagtccgcagagaata.aagct7320gacgcU,tattgacacggaagcagat,tgctgtctt.gaggcUgtaaaagaggggtgctca7380aacaaacaaatagcaacaaatatgcatgtcaccgaagatgctat,aaagtggcatatgagg7440aaaat,atttgccaccttgaatgtagtgaatcgcacgcaagcaacaattgaagctgagcgt7500caaggaattatctaaaataatcggca"aagt.gatatagtgaa能gtat3ccggagagag7560aattatggcaatcgttgttgttggcgctggfaca.gct,ggagt.aaatgcf'gcgtt.ctggcr.7620103tcgtcaatatggtt.ataaaggggaaatt.aggatttt.t,agcagggagt.ct,gtggcgcctta7680tcagcggcctcctct.atccaaggcUUctgacaagt,gagattgcagaatccgcagtgcc7740attaaagccagaaggtttttatacgaataacaataUaccatttcgtt.aaatacaccgat7800t'gtatcaat.cgacgtggggcgtaagatagt"cttctaaagatgg站aagaat.acgcgta7860tgaaaaattgattcttgcaacacctgctagcgcacgt.aggttaacctgcgaggggtctga7920actgtctggggtct,gcta"tacgcagtatggaagacgccaaaaa"t'acgtaggaaact7980tgtggagagtgcgtctgt,tgtt.gtgUgggcggcggagt,aatcgggctt.gaagtcgcctc8040agctgcggt.gggctt.agggaagagggtcacagtgatagaagccaccccgcgtgtaatggc8100gcgcgtggttacgccggcagcagcaaact,tagtcagagcccgcctggaggctgaaggaat8160tgagttcaagctgaatgcgaaattaacgtctataaagggcaggaat.ggccat,gt.t,ga.aca,8220atgcgtacTtgaaagtggagaagaaa"caggcggatctga"gtagUggaat.cggt.gc8280tatcGcagagctagagctggcaact.gaggcggcccttgaagtgagtaatggt.gt,tgtggt8340cgatgatcagatgtgtacatcggatacaagtatatatgcaatcggcgactgcgcaatggc8400tagaaatccttt,ttggggaacgatggtacgtttagagacaattcataatgcggttacaca8460cgct,caaa",gtcgcaagtagcat."gtggcacatcaacaccagcaccaaccccaccacg8520gttct.ggt'c，gatcttaaagggatggcgct.gcaaggactt.ggtgct,ctaaaggact,acga8580taaactcgftgttgcaattaar,aacgaaactcttgaactagaagtcctt,gcgtacaagca8640ggagcgactgattgcaactgagacaataaatttgcctaaacgtcaiaggtgcgcttgcagg8700gagtataaaat.tacctgattagcaatgatgctcagccactcgaaccaacggtcgcgatag8760ggacggcagt.tacctgccgccccccgcact,ccgtacgtgcggaact,accgcgtaaaatgt8820ggcccaggctgUatgtggcgcUgggcggggaagtatt,gccatatttggt,gatgaccgt8880ttt,ctacgccacat,aaatcggtggtggctatggtgggattt.cccttgctgaaatgggaga8940tccgatcat,gtt,cgagctcttattcaaatacactgctgtg"ggcggtaagcgtt.ctcga9000gct.catagtccacgacgcccgtgattt,tgtagccctggccgacggccagcaggtaggccg9060acaggctcat.gccggccgccgccgccttttcctcaatcgctcttcgttegtctggaaggc9120agtacaccttgataggtgggctgcccttcctggttggcttggtttcatcagccatccgct9180tgccct.catctgUacgccggcggtagccggccagcctcgcagagcaggattcccgttga9240gcaccgccaggtgcgaataagggacagt.gaagaaggaacacccgct,cgcgggtgggccta9300ct.tcacctatcct,gcccggct,gacgccgUggatacaccaaggaaagtct.a.ca.cgaa.ccG9360Utggc.aaaatc〔、.tgtatatcgtgcgaaaaaggatggat.ataccgaaaaaatcgcta.taa9420t,gaccccgaagcagggUatgeageggaaaagcgct,gcttccctgctgttUgt'ggaata9480tctaccgactggaaacaggcaaatgcaggaaattactgaactgaggggacaggegagaga9540ggat.caatggct,atctgggggaccgagggctgtcgctgcgccaaggcacgattggagatc9600ccct"gcggt.gt.gaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaat,accgcatcaggcgctc9660Uccgcttcctcgctcactgact,cgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggt,atc9720agctcactcaaaggcggtaatacggt-tatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaa9780catgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtt9840tt.tccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtg9900gcga雄，ccgacaggactataaagataccaggcgtUccccctggaagctccct.cgtgcg9960ct,ctcctgttccgac:cctgccgcttaccggat,acctgt,ccgccU.t.ctccctt,cgggaag10020cgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctc10080caagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaa10140ctatcgtc"gagtccaacccggt.aagacacgact.tatcgccactggcagcagccactgg0200t.aacagga"agcagagcgaggtat.gtaggcggtgct.acagag".cUgaagtggtggcc10260t.aactacggct.acac个agaaggacagtaUtggtatctgcgctctgcr,gaagccagttac10320cttcggaaaaagagttggt.agctcttgat.ccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtgg10380HtUttgttt.gcaagcagcagat.tacgcgcagaaaaaaaggatct.caagaagat,ccttt10440gatcttftctaoggggTctgaogctcagtggaacgaaaactcacguaagggat'ttt,ggt10500catgaga"atcaaaaaggatcttcacct.agatccttttaaattaaaaatgaagttt.t,aa10560atcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatcgattggtcggtc10620atttcgaaccccagagt.cccgctcagaagaactcgtcaagaaggcgatagaaggcgatgc10680gct.gcgaatxgggagcggcgataccgt.aaagcacgaggaagcggtcagcccattcgccgc10740caagctcUcagcaatatcacgggtagccaacgct,atgtcctgatagcggtccgccacac10800ccagccggccacagtcgatgaatccagaaaagcggccattt,t.ccaccat,gat.a.tt,cggca〗0860agcaggcatcgccatgggtcacgacgagatcctcgccgtcgggcatgcgcgcctt,gagcc10920tggcgaacagttcggctggcgcgagcccctgatgctcttcgtccagatcatcctgatcga10980caagaccggcttccatccgagtacgt.gctcgctcgatgcgatgtttcgcttggtggtcga11040at.gggcaggtagccggatcaagcgtatgcagccgccgcattgcatcagccatga.tgga,ta.〗1100ctttctcggcaggagcaaggt.gagatgacaggagatcctgecccggcacttcgcccaata11160gcagccagtcccttcccgcttcagtgacaacgtcgagcacagctgcgcaaggaacgcccg11220t,cgtggccagccacgatagccgcgctgcctcgtcctgcagttcattcagggcaccggaca11280ggtcggtcttgacaaaaagaaccgggcgcccctgcgctgacagccggaacacggcggcat1340cagagcagccgattgtctgtt,gtgcccagtcatagccgaat'agcctctccacccaagcgg11400ccggagaacctgcgtgcaatccatcttgt,t.caatcat.gcgaaacgat,cctcafcctgtct11460cttgat.cagat.cU.gatcccctgcgccatcagatccttggcggcaagaaagccatccagt11520t,tacttt.gcagggcttccc11539<210〉32<211>35<212〉隨<213>人工<220〉<223〉引物<400〉32aagggaattccatatgcttgagaaacacagagttc35<210〉33<211〉35<212>隨<213〉人工<220〉<223〉引物<400〉33aaaattcgcgfcgacaagc;gct.gaat.gggtatcgg35<210〉34<211>20<212>隨<213〉人工<22()><223〉引物<400〉34tgagacagtggctgttagag20<210〉35<211〉35<212〉腿<213>人工<220><22:0引物<400〉35taat.aaccgctcgagaacgct.taccgccaacacag<210〉36<211〉47<212〉瞧<213>人工<220〉<223〉引物<400〉36gccggcgagaacctgtaotttcagatggcaagtaagt.atgccacttg<210>37<211〉28<212〉隱<213>人工<220〉<223>引物<400>:nggatcctcacttcttgtgctgagccttg28〈210〉38<211>446<212〉P叮〈213〉拟南芥<400>38MetValVallieAsnSerLeuArgArgLeuAlaArgThrThrGinVal151015HisLeuHisSerLysTyrAlaThrCysMetSerGlyAsnSerThrSer202530ArgArgliePheThrThrGluAlaAlaProGluLysGlyAsnGluPro354045ArgLeuValSerAlaAlaValGluGinUuAsnThrUuProPheTyr505560HisSerPheTrpAsnArgThrThrLysProSerLeuAspLeuAlaLys65707580ValLeuLeuGluMet.PheThrAlaAsnLysMetAlaLysAlaPhePhe859095ThrSerGlyGlySerAspAlaAsnAspThrGinValLysUuValTrp001050TyrTyrAsnAsnAlaLeuGlyArgProGluLysLysLysPhelieAla115120125ArgLysLysSerTyrHisGlySerThrLeulieSerAlaSerLeuSer130135140GlyLeuProProLeuHisGinAsnPheAspLeuProAlaProPheVal145150155160LeuHisThrAspCysProHisTyrTrpArgPheHisLeuProGlyGlu165170175ThrGluGluGluPheSerThrArgLeuAlaLysAsnUuGluAspUu180185190lielieLysGluGlyProGluThrUeGlyAlaPhelieAlaGluPro195200205ValMetGlyAlaGlyGlyVallieProProProAlaThrTyrPheGlu210215220LysValGinAlaValValLysLysTyrAsplieUuPhelieAaAsp225230235240GluVallieCysAlaPheGlyArgLeuGlyThrMet.PheGlyCysAsp245250255LysTyrAsnlieLysProAspLeuValThrLeuAlaLysAlaLeuSer260265270SerAlaTyrMetProIeGlyAlalieLeuMetSerGinGluValAla275280285AspVallieAsnSerHisSerSerLysLeuGyValPheSerHisGly290295300PheThrTyrSerGlyHisProValSerCysAlaValAlalieGluAla305310315320LeuLyslieTyrLysGluArgAsnlieProGluTyrValAlaLysVal325330335AaProArgPheGinAspfilyValLysAlaPheAlaSerGlySefPro340:)45350lielieGlyGluThrArgGlyThrGlyLeulieLeuGlyThrGluPhe355360365ValAspAsnLysSerProAsnGluProPheProProGluTrpGlyVal370375380GlyAlaPhePheGlyAlaGluCysGinLysHisGlyMet.LeuValArg385390395400ValAlaGlyAspGlylieLeuMetSerProProleulielieSerPro405410415GluGlulieAspGluLeulieSerlieTyrGlyLysAlaLeuLysAla420425430ThrGluGluLysValLysGluLeuLysAlaGinHisLysLys435440445<210>39<211〉1515<212〉隨<213>拟南芥<400〉39atggtcgttatcaacagtctccgacgcUggcgcgtaccactcaggttcatttgcacagt60aagta—tgccactt.gcatgtctgggaactccacttccaggaggattttcactactgaggca120gcacct.gagaagaaaaacact.gt.t.gggtctaa.agggcat.gat.atgct.t.gcaccUt,t.a.ct.180gctggat^gcagagt.gctgam.agatccc.U.ggt.cat.tgcaaagtctga.gggaagU.a.t240gtgtat.gat.gat.actgggaaaaaatat.ct.t.gactctctcgct.ggtttatggt.gtactgcc300Uaggaggaaatgagccaaggctt.gtttctgccgctgttgaacagt,tgaacaccttgccg360Ut.tatcactccttttggaaccgtactactaaaccttctctggatcttgctaaggttctt420t.t.agagat.gtt.cacggccaacaaaatggccaaagcatttt.ttacaagcggtggatcagat,480gf:caac'gatarccaggtcaag〔tggtttggtattacaataargcac"ggaaggcccgag540aagaaaaagtttatcgcgagaaagaaatcgtaccat'ggctccactctaat,atcagcaagt,600ttgt,ccggcct,tcccccgctacaccaaaatt,ttgatttacctgcaccatttgtgttgcac660acagattgccctcattattggcgttttcatcttccaggcgaaacggaagaggagttctca720accagattagccaagaattt.agaggat.ct.aatcat.caaagaaggaccaga.aactatt'ggt'780gettttatagct.gaaccagtcatgggtgctgggggtgt,gata.eetccacctgctacct.a.c840tt,tgaaaaggUcaagctgttgttaagaaaTatgat,at.ct,tgUcat.tgctgatgaggtg900atatgtgcatttggaaggcitegggacaatgUtggct,gt,gacaaatacaa'cat,ta.agcca960gat.cttgtgaccUagctaaggcactgtcttcagcatatatgccgattggagccat.t,ctt1020atgagccaagaagtggcagatgt,cataaattctcatagcagcaagctaggcgt,t,ttctcc1080catggaUtacttaU,ctggt,catccagtt,tcgtgtgctgtagcaattgaagcgttaaag1140at.atacaaggagaggaacat.accagagtatgtcgccaaagt,tgccccaaggt,ttcaagat1200ggagttaaagcgtUg〔:ctc',tggtagt.cct,attal,tggagagacaagaggaacaggtttg1260at,t("tggga(:tgagtMgtagacaata.aat.ctccgaacgaaccatttcca.ccaga.atgg1320ggtgt.tggcgcattct,Uggagccgagtgccagaagcacgggat,gttagt.ccgtgtt,gca1380ggtgatggcat,tttgatgt,ctccac〔:gctcat,t,a,tct.cacctgaagagattgatgagttg1440aUt,ctatctatgggaaagcattgaaggcaaeggaagagaaggtaaaagaactcaaggct1500cagcacaagaagtga1515<210>40<2U>1362<212>隠<213〉假单胞菌属<400>40atgagcgtcaacaacccgcaaacccgtgaatggcaaaccctgagcggggagcaccatctc60gcacct.ttcagtgactacaagcagct.gaaggagaaggggccgcgcatcatcaccaaggcc120cagggggtgcatttgtgggacagcgaggggcacaagatcctcgacggcatggcgggcct,g180tggtgcgtggcggtgggttacggccgtgaagagctggttcaggeagcagaaa.agcaga,tg240cgcgagctgccgtacUcaacctgttc",ccagac:ggcccacxcgcctgcactggaact.g300gccaaggccat,taccgatgtggcgcccgagggcatgacccatgtgttcttcaccggctcc360ggct.ccgaaggcaacgacaccgtgctgcgcatggt,gcgccactactgggcgttgaagggc420aagccgcacaagcagaccat,catcggccgtatcaacggct.accacggct,ccacc"cgcc480ggt.gcUgcctgggcggcat-gagcggcat,gcacgagcagggcggcct,gccgatcccgggc540afcgtgcacat,cccgcagccgtHgg"cggcgaaggcggtgacatgaccccggatgcg600"cggtat.ctgggcggccgaacagct,ggagaagaaaat,cctcgaagtcggcgaagacaac660gtcigccgctttcatcgccgagcctat.ccagggcgcaggcggcgtgatcatcccgccggaa720acct,act,ggccgaaggtgaaggagattct.cgccaagtacgacatcct,gttcgt.tgccgac780gaagtcatctgtggtt.t,cggccgt,accggcgagtggt.t,cggctctgat,tactacgacct.c840aagcccgacctgatgaccat.cgccaagggcct,gacctccggttacat,ccccatgggcggt900gtgatcgtgcgtgac,aaagtggccaaggtgatcagcgaaggcggt,gact.t'caaccacggc960ttcacctat'tcgggccacccggt.agcggcggcggtgggcctggaaaacctgcgcatcctg1020cgcgacga.gcaaattgt,cgagaaggcgcgtact.gaagcggcaccgtat,Ugcaaaagcgt.1080"gcgtgagctgcaggaccacccgctggtgggtgaagtgcgcggccttggcatgct.tggc1140gcgatcgagct.ggtgaaagacaaggccacccgcagccgttacgagggcaagggcgtgggc1200atgat,ctgccgcaccttctgctt.cgaaaacggcctgatcat.gcgtgcggtgggtgacacc1260at.gat.cat,cgcgccgccgctggtcat.cagccatgcggaaat.cgacgaactggtggaaaag1320gcacgcaaat.gcctcgacctgacccttga乂gcgattcga.taa1362<210>41<211〉1359<212〉,<213〉假单胞菌属<400〉41atgagcgat.tcgcaaac:cctgcactggcaagcgct.gagccgcgaccatcatctgccgccg60tt.caccgattacaaggcgctgaacgccaaaggcacgcgcatcatcaccaaggcgtcaggc120gtctacctgt.gggacagcgaaggccacaagatcct.cgacgccatggccgggctctggtgc180gtcaacctgggctatggccgcgaggagctggtcgaggccgcgaccaggcagat,gcgcgag240ctgccgt,actacaacctgttctt,ccagaccgcccacccgccggccgtggcgctggccaag300gcgatt.gccgacatcgcgccggccgggatgaaccatgtgttct.t,caccggctccggct.cg360gaggccaacgacaccgtgc'tgcgcatggtgcgccattactgggcgatcaagggccagccg420gcgaagaaggt,ggtcatcggccgctggaatggctat.cacggctcgaccatcgctggcgca480agcctcggtggcatgaaggccatgcacgagcagggcgacggcccgalccccggcatcgag540catatcgaccagccct,actgg"cggcgagggtggcgacatgagcccggaagag"cggc600gtgcgcatcgccgaccagct.ggagcagaagatccttgaggtcggcgaggacaaggtcgcc660gccttcatcgccgaacctatccagggcgccggcggcgtgatcatcccgcccgagagctac720tggccgcgggtcaaggaaatcctcgcgcgctacgacattctcttcatcgccgacgaggtc780atctgcggctt,cggccgt,accggtgagt,ggtt.cggcagcgactactacggcctcgagccg840gacct.gatgccgatcgc(:aagggcctga〔!crctggct,acatccccatgggcggcgtagtg900gtgcgcgacgaagtggt^acacgctcaacgagggcggcgagt,t,ctaccacggctt.cacc960tactcggggcaccccgtggccgccgcggtggcgct.ggagaacatccgcat.cctgcgcgag1020gagaagatcgtcgagcgggt,gaagacgaagacggcaccctatUgcagtcccgttggcag1080gaactgctcgagcatccgctggtaggcgaggcgcgcggcgtcggcctgct.tggt.gcgctg1140gagttggtgaagaacaagaagacccgcgaacgctttgccgatcccggt.gtgggcatgctc1200tgt,cgcgagcactgcUccgcaaeggcctggtgatgcgt.gcggttggcgacaccatgat,c1260atUcgccgccgctggtgatcagcgaagagcagatcgacgagctggttggcaaggtgcgg1320Ugtgcctcgacgccacggccaaggatgtgctgggctga1359<210〉42<2U>1380<212〉画<213>人工<220><223〉在大肠杆菌中用于表达的密码子优化基因<400>42at.gcagaaacagcgt.accacct.ctcagtggcgtgaactggat,gcggcgcatcatct,gcat'60ccgtttaccgataccgcgagcct,gaatcaggcgggtgcgcgtgtgatgacccgtggcgaa20ggcgtgtatctgtgggat.agcgaaggcaacaaaat,Uttgatggcatggcgggcctgtgg180tgcgt.gaacgt,gggctatggccgt.aaagat,utgcggaagcggcgcgt,cgtcagatggaa240gaactgccgttt,tataacaccttctttaaaaccacccatccggcggtggtggaactgagc300agc.ctgctggccgaagUaccecggcaggttttgatcgtgtgttu.at'accaacagcggc360agcgaaagcgtggataccatgaUcgtatggt.gcgt.cgttattgggat.gt.gcagggcaaa420ccggaaaaaaaaaccctgattggccgttggaacggctatcacggcagcaccattggcggt480gcgagcct,gggcggcatgaaatatatgcatgaacagggcgatctgccgattccgggcatg540gcgcatattgaacagccgtggtggtataaacatggcaaagatatgaccccggatgaatt,t600ggcgtggt,tgcggcgcgttggct.ggaagaaaaa.aUctggaaatcggcgcggataaagtg660gcggcgtttgtgggcgaaccgattcagggtgcgggcggtgtgattgttccgccggca織720tattggccggaaat,tgaacgtatttgccgcaaat,atgatgtgct,gctggt.tgcggatgaa780gt.gat,U,gcggctt,t.ggccgtaccggcgaat.ggt-ttggccatcagcat-tttggctttcag840ccggacctgtttaccgcggcgaaaggcctgagcagcggctatctgccgattggcgcggtg900mgtgggcaaacgtgttgcggaaggtctgattgcgggcggtgattttaaccat.ggcttt960a(:(:tatag(、,gg(:cat(wgtgtgtg，cggtggcgcatgcgaettgUgr:ggcgctgcgtH)20gatgaaggcattgtg('agcgtgtgaaagatgatattggcccgtat.atgcagaaacgt.tgg1080cgtgaaac:ctt.tagccgt.tttgaacatgtggatgatgtgcgtggcgtgggcatggtgcag1140gcgt.ttaccctggt.gaaaaacaaagcgaaacgtgaactgtttccggat11tggcgaaat,t1200ggcaccctgtgccgcg3t.at,ttt,Uttcgcaacaacctgattatgcgtgcgtgcggcgat1260cacatt.gtgtctgcaccgccgctggUafgacccgtgcggaagt,ggat,gaaat.gctggcc1320gtggc,acgtrgcctggaagaatttgaacagaccctgaaagcgcgtggcctggcctaa1380<210〉43<211〉5143<212〉DNA<213〉人工<220〉<223〉载体<400〉43119tttaagaaggagatatacccatgacacagagggcccaccatcaccatcaccattccatgg60cct,cctccgaggacgtcatcaaggagtt,catgcgcttcaaggt,gcgcat.ggagggct,ccg120tgaacggccacgagtt.cgagatcga.gggcgagggcgagggccgcccctacgagggcaccc180agaccgccaagctgaaggtgaccaagggcggccccctgcccttcgcctgggacatcctgt240cccctcagt,tccagt,acggctccaaggcctacgtgaagcaccccgccgacatccccgact300acttgaagctgtcct.tccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacg360gcggcgt.ggt.gaccgtgacccaggactcctccct,gcaggacggcgagttcatctacaagg420tgaagctgcgcggcac。-aacUcccctccgacggccccgtaaTgcagaagaagact.atgg480gt.tgggaggcctccaccgagcggatgtaccccgaggacggcgccctgaagggcgagatca540agatgaggctgaagct.gaaggacggcggccact.acgacgccgaggtcaagaccacctaca600tggccaagaagcccgt.gcagctgcccggcgcct,acaagaccgacatcaagctggacatca660cctcccacaacgaggactacaccat.cgtggaacagtacgagcgcgccgagggccgccact720ccaccggc:gccggcgagaacctgt.actt,tcagatggcaagt,aagtat,gccactt,gcatgt.780ctgggaactccacttccaggaggattttcactactgaggcagcacctgagaagaaaaaca840ctgttgggtctaaagggcat-gatatgcftgcaccr,t,ttactgctggatggcagagtgct'g900atttagatccc"ggtcattgcaaagtctgagggaagttat,gtgtatgatgatactggga960aaaaatatcttgact.ct,ctcgctggtttatggtgtactgccttaggaggaaatgagccaa1020ggcttgtttctgccgctgrtgaacagttgaacaccttgccgttttatcact,ccttttgga1080accgtactact,aaacctt,ctctggatcttgct,aaggttctttt,agagat,gt,tcacggcca1140acaaaatggccaaagcat.t,t,t,ttacaagcggtggatcagatgccaacgatacccaggtca1200agctggtt,tggt-attacaataacgcact.tggaaggcccgagaagaaaaagtt,tatcgcga1260gaaagaaatcgtaccatggct,ccactctaatatcagcaagtttgtccggccttcccccgc1320tacaccaaaattt,tgattt.acctgcaccatttgtgttgcacacagattgccctcattatt1380ggcgtttt,catctt.ccaggcgaaacggaagaggagt.tctcaaccagattagccaagaat.t1440tagaggatctaatcatcaaagaaggaccagaaactattggtgcttt,tatagctgaaccag1500tcatgggtgcrgggggt.gtgatacctccacctgctacct,actt,tgaaaaggttcaagctg1560t.t,gtt呵aaatatgatatct,t.gttcaUgctgatgaggtgat.at.gt,gcaUtggaaggc1620tcgggacaatgttt.ggctgtgacaaatacaacat,taagccagatct,tgtgacctt,agcta1680aggcact,gtcttcagcatatatgccgatt,ggagccat,tcttatgagccaagaagtggcag1740atgtcat.aaaUctcatagcagcaagct,aggcgttttctcccatggatttacttattctg1800gtcatccagtUcgtgtgctgt'agcaattgaagcgttaaagat.atacaaggagaggaaca1860taccagagtatgtcgccaaagttgccccaaggtt.t.caagatggagtt.aaagcgtt.tgcct,1920ctggtagtcctattattggagagac呵aggaacaggtttgattct.tgggactgagtt,t,g1980tagacaataaat,ct.ccgaacgaaccatttccaccagaatggggtgt.tggcgcattctttg2040gagccgagtgccagaagcacgggatgttagtccgtgttgcaggtgatggcattttgatgt200ctccaccgctcaUat.ctcacctgaagagaUgatgagttgatttctatctatgggaaag2160cattgaaggcaacggaagagaaggtaaaagaactcaaggcrcagcacaagaagtgaggat,2220ccggc.tgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggct.gcT,gccaccgctgagcaataa2280c:t,agcafaaccccr.Cggggcc:tctaaacgggt'cUgaggggttt.tttgctgaaaggagga2340actatatccggccggatatccacaggacgggtgtggt,cgccatgatcgcgtagtcgatag2400tggctccaagtagcgaagcgagcaggactgggcggcggccaaagcggtcggacagtgctc2460cgagaacgggtgcgcat,agaaattgcatcaacgcat,atagcgct,agcagcacgccat,agt2520gacrggcgafgc',tgk'ggaatggacgata丄cccgcaagaggcccggcagtaccggcataa2580ccaagcctatgcct.acagcatccagggtgacggtgccgaggatgacgat.gagcgcattgt,2640tagat"catacacggtgcctgactgcgttagcaaUt,aact.gtgataaactaccgcatt.2700aaagct,tatcgat.gataagctgtcaaacatgagaattcftgaagacgaa,agggcctcgtg2760atacgcct.altt"ataggttaaTgtcatgcat.ga.gac;aataaccctgataaatgc"ca2820ataat.attgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattccctt2880t'tttgcggcattttgccttcctgtttUgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaaga2940tgct.gaagat.cagttgggt,gcacgagtgggtt,acat.cgaactggat,ctcaaca.gcggt.aa3000gatccttgagagttt.tcgcc.ccgaagaacgt,tttccaat,gatgagcacttttaaag"ct.:賜()gct.atgtggcgcggtatta〖cccg言gttgacgc;cgggcaagagcaactcggtcgccgcat,3120acact,a"ct.c'agaatgacttggttgacgcgtcaccagt,cacagaaaagcat,ct.t,acgga3180tggcatgacagtaagagaat.tatgcagt.gctgccataaccatgagtgataacactgcggc3240caacttactt,ctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacat3300gggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaa3360cgacgagcgtgacaccacgatgcctgcagcaat.ggcaacaacgt,tgcgcaaactattaac3420r.ggcgaactac"actctagcftcccggcaacaaUaatagactggat.ggaggcggataa,3480agtt'gcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatc3540tggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatca"gcagcactggggccagatggtaagcc3600ct.cccgtat,cgt.agttatctacacgacggggagtcaggcaact.atggat.gaacgaaat.ag3660acagatcgctgagataggt,gcctcactgattaagcat.tggtaactgtcagaccaagttt,a3720ctcal"atatactUagat,tgat[t,aaaacttcatttu.aatttaaaaggatctaggtgaa3780gatcctttttgataatctcatgcat.gaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccact3840gagcgfcagaccccgtagaaaagatcaaaggatct,tctt.gagatccttt,t,tttctgcgcg3900t.aatctgctgctt.geaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtU.gtttgccggat.c3960aagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaata4020ct-gtcctt,ctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgccta4080catacctcgctctgctaat,cct,gtt,accagtggct.gct,gccagtggcgataagtcgtgtc4140t,t,accgggnggactcaagacgatagtt.accggat,aaggcgcagcggtcgggctgaacgg4200ggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctac4260agcgtgagct.atgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggt,a.tccgg4320t.aagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggt機OatctUatagtcctgt,cgggtt.tcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgct4440cgt,caggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggccttutacggttcctgg4500cct.tttgctggccUftgcfcacatgttctt.fccfgcgttatcccclgattctgtggata4560accgtattaccgcctttgagtgagct.gataccgctcgccg(:agccgaacgaccgagcgca4620gcgagt.cagtgagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcggtattttctccttacgcatc4680tgtgcggtatttcacaccgcatatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgc4740at,agtt.aagccagtatacactccgctatcgctacgt,gact.gggtcatggctgcgccccga4800cacccgcc.aacacccgctgacgcgccct.gacgggcUgt,ctgct.cccggcat.ccgcttac4860agacaagct,gtgaccgt(:t,ccgggagctgcat,gtgt.cagaggUUcaccgtcatcaccg4920aaacgcgcgaggcagct.ggcacgacaggUtcccgact.ggaaagcgggcagt,gagcgcaa.4980cgcaattaatgtgagttagctcact.cattaggcaccccaggcitttacactt[atgcttcc5040ggct.cgt,atgttgtgtggaattgtgagcggataacaat.ttcacacaggaaacagctatga5100ccat,gattacgccaagctctagct,agaaataattttgtttaac5143<20>M<211>36<212〉歸<213〉人工<220〉<223〉引物<400〉44ggaat.tccatatgagcgt.caacaacccgcaaacccg36<210〉45<211〉37<212〉隨<213〉人工<220〉<223〉引物<400>45ccgctcgagttatcgaatcgcctcaagggtcaggtcc37<210>46<211〉38<212>麵<21:！〉人工<220><223>引物<400〉46ggaa"ccat"atgagcgatt.cgcaaaccctgcactggc38<210〉47125<2U〉35<212〉DNA<213〉人工<220〉<223>引物<400〉47cgcggatcctcagcccagcacatccttggct.gtcg3权利要求1.一种细胞，该细胞相对于其野生型以如下方式进行基因工程修饰使得其能够比其野生型由羧酸或羧酸酯生产更多的ω-氨基羧酸、更多的ω-氨基羧酸酯或者更多的从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺。2.根据权利要求1所述的细胞，该细胞与其野生型相比具有至少一种下列酶的增强活性i)酶E,，，羧酸或者羧酸酯催化转换成相应的co-羟基羧酸或者co-羟基羧酸酯；ii)酶E,期每co-羟基羧酸或者o)-羟基羧酸酯催化转换成相应的co-氧代羧酸或者0)-氧代羧酸酯；iii)酶E川，期每co-氧代羧酸或者co-氧代羧酸酯催化转换成相应的o)-氨基羧酸或者o)-氮基羧酸酯。3.根据权利要求2所述的细胞，该细胞具有所有酶E,、E和E,,,的增强活性。4.根据权利要求2或3所述的细胞，其中-酶E,是烷烃单加氧酶，或者-酶E是烷烃单加氧酶、醇脱氢酶或醇氧化酶，或者-酶E,是co-转氨酶。5.根据权利要求24中任一项所述的细胞，其中酶E,是经过alkBGT编码的来自恶臭假单胞菌GPol的烷经单加氧酶。6.根据权利要求25中任一项所述的细胞，其中酶En经来自恶臭假单胞菌GPol的alkj基因编码。7.根据权利要求26中任一项所述的细胞，其中酶E,是来自紫色色杆菌DSM30191的co-转氨酶CV2025。8.根据，权利要求中任一项所述的细胞，在细胞中增强了酶Ew的表达，该酶^co-氨基羧酸酯催化转化成相应的co-氨基羧酸。9.根据权利要求8所述的细胞，其中酶EIV是来自荧光假单胞菌的脂肪酶LipA(Q76D26)，所述脂肪酶LipA(Q76D26)是由所述细胞分泌的。10.根据上述权利要求中任一项所述的细胞，在细胞中增强了酶Ev的表达，该酶％0-氨基羧酸催化转化成相应的内酰胺。11.根据权利要求10所述的细胞，其中酶Ev是由所述细胞分泌的。12.根据上述权利要求中任一项所述的细胞，该细胞是转基因大肠杆菌细胞、转基因谷氨酸棒状杆菌细胞或者转基因恶臭假单胞菌细胞。13.—种转基因细胞的制备方法，包括在细胞中增强至少一种下列酶活性的方法步骤i)酶E,，其将羧酸或者羧酸酯催化转换成相应的co-羟基羧酸或者co-羟基羧酸酯；ii)酶E，，co-羟基羧酸或者co-羟基羧酸酯催化转换成相应的C0-氧代羧酸或者C0-氧代羧酸酯；iv)酶E,，^!%o-氧代羧酸或者co-氧代羧酸酯催化转换成相应的co-氨基羧酸或者co-氨基羧酸酯。14.根据权利要求13所述的方法，除了增强酶E,、E或E,的活性之外，也增强酶E^的活性，该酶E,v^)-氨基羧酸酯催化转化成相应的CO-氨基羧酸；禾口/鹏强酶Ev的活性，该酶M^D-氨基羧酸催化转化成相应的内，过增强这些酶的表达来增强，和酶Erv和/或者Ev是由所述细胞分泌的。15.—种可通过权利要求13或14获得的转基因细胞。16.—种用于制备co-氨基羧酸、co-氨基羧酸酯或者从co-氨基羧酸衍生而来的内酰胺的方法，包括下列方法步骤I)在使得细胞肖滩从羧酸或者从羧酸酯形fc-,羧酸、co-氨基羧酸酯或者从co-氨基羧酸衍生而来的内,安的条件下，使权利要求1至12或15之一的细胞与含有羧酸或者羧酸酯的培养基接触，或者与邻接含有羧酸或羧酸酯的有机相的培养基接触；II)视需要分离出所形成的co-氨基羧酸、所形成的co-氨基羧酸酯或者从CO-氨基羧酸衍生而来的内酰胺。17.根据权利要求16所述的方法，在额外的方法步骤中使用常规化学方法将方法步骤I)中形成的o)-氨基羧酸酉鹏化^co-氨基羧酸。18.根据权利要求16或17所述的方法，所述细胞是转基因大肠杆菌细胞、转基因谷氨,状杆菌细胞或者转基因恶臭假单胞菌细胞。19.根据权利要求1618中任一项所述的方法，在方法步骤I)中使用的培养基含有氨基酸，这些氨基酸在通过转氨酶％)-氧代羧酸或者0)-氧代羧酸酯催化转化成相应co-氨基羧酸或co-氨基羧酸酯的过程中起到氨基供体的作用。20.根据权利要求1619中任一项所述的方法，所述方法在两相系统中进行，包括A〉水相，以及B)有机相，在方法步骤I)中在水相中通过细胞形^co-氨基羧酸、co-氨基羧酸酯或者从co-氨基羧酸衍生而来的内,安，并在有机相中使得所形成的co-氨基羧酸、所形成的co-氨基羧酸酯或者所形成的从co-氨基羧酸衍生而来的内,安富集。21.根据权利要求1620中任一项所述的方法，通过至少两个步骤的提纯方法来分离所形成的co-氨基羧酸、所形成的(o-氨基羧酸酯或者从co-氨基羧酸衍生而来的内糊安，包括a)提取步骤其中从培养基中提取O)-氨基羧酸、co-氮基羧酸酯或者从(o-氨基羧酸衍生而来的内酰胺，以及b)提纯步骤采用蒸馏法或者其它提取方法，对方法步骤a)中获得的提取物进行进一步提纯，获得纯度至少为99.8%的。-氨基羧酸相、co-氨基羧酸酯相或者内細安相。22.根据权利要求21所述的方法，方法步骤a)中的提取是反应萃取。23.根据权利要求1622中任一项所述的方法，所述羧酸是月桂酸，或者所述羧酸酯是月桂酸酯，且在方法步骤II)中将月桂酸或月桂酸酯转化成月桂内,安。24,co-氨基羧酸、(0-氨基羧酸酯或者从co-錢羧酸衍生而来的内醐安，可Mil权利要求1623中任一项所述的方法获得。25.可fflil权利要求23所述方法获得的月桂内,安。26.—种基于co-氨基羧酸制备聚酰胺的方法，包括下列方法步骤(od)ilil权利要求1623中任一项所述的方法制备co-氨基羧酸，(a2)聚合该co-氨基羧酸而获得聚鹏安。27.—种基于内翻安制备聚酰胺的方法，包括下列方法步骤((31)ilil权利要求1623中任一项所述的方法制备内,安；((32)开环聚合或者缩聚月桂内酰胺而获得聚酰胺。28.可3IM权利要求26或27所述方法获得的聚TO。全文摘要本发明涉及产生ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或其内酰胺的重组细胞。具体地，本发明涉及一种细胞，该细胞与其野生型相比通过如下方式进行基因工程修饰使得该细胞能够比其野生型从羧酸或羧酸酯产生更多的ω-氨基羧酸、更多的ω-氨基羧酸酯或者更多的从ω-氨基羧酸衍生而来的内酰胺。此外，本发明还涉及一种转基因细胞的制备方法，可通过该方法获得的细胞；ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生的内酰胺的制备方法，可通过该方法获得的ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或者从ω-氨基羧酸衍生的内酰胺；基于ω-氨基羧酸或者基于内酰胺的聚酰胺的制备方法，以及可通过该方法获得的聚酰胺。文档编号C12N15/09GK101580815SQ20081019105公开日2009年11月18日申请日期2008年12月17日优先权日2007年12月17日发明者A·卡劳,A·施米德,B·巴勒,H·哈格,K·格拉曼,L·布兰克,T·哈斯,V·西伯申请人:赢创德固赛有限责任公司