用于寡核苷酸微阵列的定量方法

专利名称：：用于寡核苷酸微阵列的定量方法用于寡核苷酸微阵列的定量方法
技术领域：
：本发明涉及核酸定量测量的系统和方法，尤其是涉及实时、同时定量分析来自一种或多种病原体的多种核酸的系统和方法。
背景技术：
：核酸的定量分析在基础生物学研究和诸如临床微生物领域中非常重要。定量分析典型地在两个阶段完成。首先将样品中的耙核酸扩增以产生可检测量的核酸供定量工具应用。将检测到的耙核酸的量用于计算最初存在于样品中的核聚合酶链式反应(PCR)是扩增核酸，尤其是脱氧核糖核酸(DNA)的有力方法。实践PCR的关键是应用耐热的DNA聚合酶，即旨,催化DNA复制且在用于将DNA螺旋分离为两条核酸单链的升高^Tf不会变性的蛋白。ffiM将耙标双链DNA置于提供有与耙标DNA互补的小序列单链DNA(称为引物)和耐热DNA聚合酶的核苷酸缓冲液中启动PCR。fflil将混合物的温度循环M3个阶段，能够指数地扩增革巴标DNA。第一阶段是高温(94°C)变性阶段，其中将双链DNA分离为两条单链。第二阶段是低温(60°C)退火阶段，其中弓I物结合至单链DNA。最后，延伸阶段发生在中间温度(72-78°C)。在延伸阶段，DNA聚合酶催化退^S耙标DNA的引物地延伸，添加合适的核苷酸直到形成完整的双链DNA螺旋。在每一个PCR循环中，耙标DNA的拷贝数大约翻番了，使得耙标DNA快速积累。原则上，在PCR循环系列终点所产生的耙标DNA的量(也称为"终产物')与在最初样品中耙标DNA的拷贝f^比例。然而，实际上，扩增附旨数性质、启始扩增的弓胸退火的细麟另IJ导致了饱和及其它影响，使得PCR终产物是最初样品中耙标DNA量的非常不可靠的估计。在90年代中期发展了实时聚合,式反应(实时PCR)方法，以舰最初的PCR方法，避免了这些困难，提供了样品中任意耙标DNA拷贝数的可靠、精确的测量。在实时PCR中，将只有当结合至耙标DNA才会有活性的荧光探针加入到PCR缓冲溶液中。这些荧光探针是单链DNA，其中间部分具有与耙标DNA互补的核苷,列。在这一中间部分的任一侧是与彼虹补的延伸核苷酸序列，因此，没有结合的探针将自己折叠为发夹结构。荧光探针在一端具有荧光分子，以及在另一端具有荧光淬灭分子。未结合的，折叠的^^针具有彼此相邻的发荧光和淬灭M,并且因此当照射未结合的探针时不会发射出荧光。然而，当荧光探针结合至期巴标DNA时，其是展开的，发荧光和淬灭舒彼此分离。当用合适波长的光照射结合的探针时，荧光肝鄉出荧光。ffiil为特定耙标DNA提供足够的荧光探针，并且在PCR的每一个阶段测量来自结合探针的荧光，可以测量每一个反应阶段扩增子的数量。这一方法可以用于非常精确地确定最初样品中DNA的拷贝数，因为使扩增子数目达至顾先确定的阈值的部分循环数与最初样本中拷贝数的对数之间是线性关系。这样，可以用实时PCR来确定样品中靶标DNA的量，i^gil9个M:级的范围具有少于2%的误差，即其可以计数最初样本中少至5，以及多达50亿条耙标DNA拷贝。然而，实时PCR技术具有局限性，其最显著的是实时PCR只能在一个反应管中观糧小数量的核酸，因为具有M的相应荧光发射光源的合适的荧光染料数量是有限的。对于许多应用来说，同时量化一种以上种类的核酸是非常期望的。需要的是允许用实时PCR应用小数量的荧光染料，以及只用一种荧光染料同时量化来自不同病原体的数百种不同的核酸的装置和方法。发明本发明提供了同时量化测量来源于样品中一种或多种病原体的多种核酸的方法和设备。.在一个示范性实施方案中，用聚合,式反应(PCR)、逆转录PCR、滚动循环复制或T7转录线性扩增在单个反应孔中扩增所有的样品中的核酸和一种或多种内部核W"照，其中扩增缓冲溶液附加含有荧光标记的核苷酸或，，±也荧光标记的引物，因此耙核酸和内部核酸对照的扩增子本身是荧光标记的。典型地，一种或多种内部核酸对照以不同的拷贝数量和不同的浓度存在，例如，内部核酸对照A以低浓度存在，以及内部核酸对照B以高浓度存在。低浓度的内部核W"照和高浓度的另一个内部核酸对照的存在扩大了方法的检测范围。此外，从低至中等至高的不同浓度的两个以上(例如，三、四、五笱内部核,照的存在可以允许在很宽的浓度范围中糊瞎精确的检测。在扩增程序的退火或延伸P介段过程中，通过与已以预先确定的二维模式排列并束缚在基质表面的靶核酸探针和内部核酸对照探针杂交将耙核酸或内部核酸对照的荧光标记的扩增子定位到基质表面。革巴核酸探针和内部核酸对照探针分别具有与靶核酸和内部核酸对照相同的互补的核苷酸序列，并且可以通过应用商业可获得的微阵列技术的自动印刷排列。当它们的荧光标签通过合适波长光的衰逝波激发时，可以通过发射的荧光检测杂交的荧光标记的耙扩增子。由于当其iSA反应孔中时衰逝波指数衰退，具有大约腦-300nm的有效范围，其只能穿皿够^aA反应孔中以激活非常靠近基质表面的荧光标签，艮卩与束缚至表面的靶核酸探针和内部核酸对照探针杂交的荧光标记的耙扩增子。因此，衰ifi波不会激活在反应孔剩余物中的荧光硫的核苷酸。通體测在基质表面不同位置上的荧光纟贩，可以确定每一个耙核酸禾呐部核酸对照的杂交扩增子的当前丰度。这可以在PCR反应过程中实时完成，并且可以用实时PCR分析技术得到在最初样品中每一个耙核酸和内部核酸对照丰度的精确量化测量。在一个实施方案中，用于分析靶核酸的定量方法包括将一种或多种荧光标记的革巴扩增子退火至两种或多种靶核酸探针；将一种或多种荧光标记的内部对照扩增子退火至一种或多种内部核酸对照探针；激活来自杂交至两种或多种靶核酸探针的一种或多种荧光标记的耙扩增子的第一荧光应答；溜。活来自杂交至一种或多种内部核酸对照探针的一种或多种荧光禾斜己的内部对照扩增子的第二荧光应答；检测第一和第二荧光应答，用于定量分析一种或多种靶核酸和一种或多种内部核酸对照，其中两种或多种耙核酸探针和一种或多种内部核酸对照探针非常接ifi:S质的上表面，以及其中通过应用预先确定波长的衰逝波激活第一和第二荧光应答。在另一实施方案中，退火发生在聚合,式反应过程中。在再另一个实施方案中，第一和第二荧光应答的检测发生在聚合,式反应的退火步骤或延伸步骤过程中。在一个实施方案中，应用微阵列印刷机将两种或多种耙核酸探针和一种或斜中内部核酸对照探针印在基质上，并将其固定在基质的表面。在另一个实施方案中，用选自硅烷、抗生物素蛋白、恭L-赖氨酸、抗生蛋白链菌素、多糖、硫醇或其组合的试剂化学修饰基质。在再另一个实施方案中，聚合^l连式反应是实时聚合式反应。在一个实施方案中，一种或多种内部核酸对照是线性双链脱氧核糖核酸、环状双链脱氧核糖核酸或其组合。在另一实施方案中，一种或多种内部核照具有与两个或多个耙核酸相同的弓l物结合区域。在再另一个实施方案中，退火至一种或多种内部核酸对照探针的荧光标记的扩增子的序列长度小于退火至雨中或多种靶核酸的荧光标记的扩增子序列长度的约百分之一千、tm小于约百分之五百，以及更有选小于约百分之两百。在一个实施方案中，一种或多种内部核照序列具有约百分之二十以下，tt^约百分之十以下，以及最约百分之五以下的交叉反应。在另一个实施方案中，如果存在两种或多种内部核酸对照，两种或多种内部核酸对照以不同的浓度存在。在再另一个实案中，如果存在两种或多种内部核自照探针，两种或多种内部核IW照探针以与两种或多种耙核酸探针相同的浓度存在。在一个实施方案中，两种或多种内部核酸对照具有约百分之二十以下，优选约百分之十以下，以及最约百分之五以下的与两种或多种耙核酸的交叉反应。在另一个实施方案中，在达到杂交平顶之前检测第一和第二荧光应答。在再另一个实施方案中，两种或多种靶核酸衍生自一种或多种病原体，其中一种或多种病原体是病毒、细菌、古细菌、真菌、原生动物、支原体、朊病^(prion)、寄生生物或其组合。在一个实施方案中，一种或多种病原体是立克次氏体(历cfe/to'a)、衣原体(C似am;^fcf)、枝原^(A^co;/as附a)、《ffi^^7/rac/2ete」、链球菌(S^/tococa^、葡萄球菌(Sto;/^/oco(X^)、单核细胞增多性李司戎菌(丄.wo"oc声o织"CT)、脑膜炎奈瑟氏菌(A^e"/"g,fefe)、大肠杆菌(Eco/0、流感嗜血杆菌(/^"/we"z"e)、伯氏鹏旋鄉Z^一一n)、钩端螺旋鄉w鄉,ra)、郷杆菌——、厌氧杆菌(/4"aera6acter)、沙门氏菌(Sa/mo"e/to)、结核分支杆菌(Mft/6e簡/a^)、肠球菌(淑eracoc—、#1§^^炎病寧尸0/她'層)、肠病寧五"ter謂'層)、柯萨基病寧Coxradbev/丽)、//SF-/、HSF-2或其组合。在另一实lfe^案中，两种或多种革巴核酸探针选自SEQIDNO:13-52。在再另一实施方案中，革巴核酸是大肠杆菌8co/Z)和沙门氏菌(&7/,"e/納，以及两种或多种耙核酸探针选自SEQIDNO:14-17和22-26。在另一个实案中，一种或多种病原体包含在组织、细胞、血液、血清、脑彌液、尿、细M^解物、血浆、排泄物、唾液、血细胞、细针活检样品、液、胸膜液或其组合中。在一个实施方案中，方法还包括为两种或多种靶核酸的每一种和为一种或多种内部核酸对照的每一种建立系列标准品扩增曲线，其中每一标准品扩增曲线是剂量效应曲线，其中剂量是扩增循环的数量，效应是杂交信号。在另一个实施方案中，方法还包括通过减去一种或多种内部核酸对照的检测浓度和一种或多种内部核酸对照的预先确定浓度的差异校正两种或多种靶核酸的每一种的检测浓度。本发明提供了分析靶核酸的定量方法，包括将一种或多种荧光标记的耙扩增子退火至两种或多种耙核酸探针；将一种或多种荧光标记的内部对照扩增子退火至一种或多种内部核酸对照探针；激活来自杂，两种或多种靶核酸探针的一种或多种荧光标记的耙扩增子的第一荧光应答；激活来自杂交至一种或多种内部核酸对照探针的一种或多种荧光标记的内部对照扩增子的第二荧光应答；以及检测第一和第二荧光应答，用于定量分析一种或多种耙核酸和一种或多种内部核酸对照，其中两种或多种耙核酸探针和一种或多种内部核酸对照探针非常接近基质的上表面，以及其中通过应用预先确定波长的魏波激活第一和第二荧光应答；为两种或多种耙核酸的每一种和为一种或多种内部核酸对照的每一种建立系列标准品扩增曲线，其中每一标准品扩增曲线是剂量效应曲线，其中剂量是扩增循环的数量，效应是杂交信号；通过减去一种或多种内部核酸对照的检测浓度和一种或多种内部核酸对照的预先确定浓度的差异校正两种或多种耙核酸的每一种的检测浓度。本发明也提供了用于定量分析耙核酸的装置，包括具有上和底表的^M，且其折射率大于水的折射率；基本上与基质上表面接触的缓冲溶液，缓冲溶液能够维持扩增反应和核苷酸杂交反应并含有一种或多种荧光标记的弓l物、一种或多种任选地荧光标记的dNTPs、两种或多种耙核酸、以及一种或多种内部核IM照；非常接近于基质上表面并在缓冲液溶液内部的两种或多种耙核酸探针，该两种或多种耙核酸探针具有与两种或多种耙核酸的核苷酸序列对应或互补的9核苷酸序列；非常接近于基质上表面并在缓冲液溶液内部的一种或多种内部核,照探针，该一种或多种内部核,照探针具有与一种或多种内部核酸的核苷酸序列对应或互补的核苷,列；光线，其具有选择以激活一种或多种荧光标记的耙扩增子以及一种或多种荧光标记的内对照扩增子的波长，以所选择的角度在基质和缓冲溶液的界面入射，从而使魏波传播駄缓冲溶液；能够检测由一种或多种荧光标记的耙扩增子和一种或多种荧光标记的耙内部对照扩增子鄉的荧光的检测器。在另一实施方案中，设备还包含能够循环缓冲溶液温度的加热元件，因此能够进行扩增反应。在再另一个实施方案中，扩增反应是实时聚合物链式反应。Mil参考以下附图将能更完全地JW这些和其它特征。附图简述通过以下的说明书和解释实施方案的附图将更好的理解发明的实施方案。在附图中-图1阐明了肯,在PCR过禾歸初阶段魏波检测微阵列PCR反应中荧光禾斜己的扩增子的示范性设备的横面图2阐明了育嫩在PCR过程退火和延伸阶段的终点^fi波检测微阵列PCR反应中荧光^H己的扩增子的示范性设备的横面图3阐明了肖辦在PCR过程变性阶段魏波检测微阵列PCR反应中荧光禾斜己的扩增子的示范性设备的横面图4阐明了显示在PCR过程检测阶段^M波检湖微阵列PCR反应中荧光标记扩增子的示范性设备的横面图5阐明了荧光密颇PCR循环的示范性标绘图6是在最初样品中耙核M拷贝数的对数(log[N])对耙核酸阈循环(CT)的示范性标绘图7是循环数(X轴)对内部扩增子数(Y轴)的示范性标绘图。图8显示含有5，端用荧光M标记的弓,的扩增子。图9显示含有5，端用荧光舒断己的弓嫩的扩增子。定义本文所使用的某些术语具有以下含义。所有在本说明书中使用的其它术语或短语具有本领域技术人员所理解的它们的通常含义。此类通常含义可以M参考禾射支词典，诸如Hawley，sCondensedChemicalDictionary第11版，Sax和Lewis,VanNostrandReinho14NewYori^N.Y，1987,以及TheMerckIndex,第11版，Merck&Co.RahwayN丄1989而获得。本文所使用的术语"和/或'是指与这一术语相联系的项目的任一项、项目的任意组合，^^f有项目。本文所《糊的单数形式"一"("a"、"an，邻他e"泡括魏絲，除非上下文另外明确指出。因此，例如，提及"一种制剂"繊此类制齐啲复数，因此化，X的制剂包括化合物X制剂的魏形式。本文所<顿的术语"约"是^#定值百分之十的偏差，例如，约50%包含从45%至55%的变化。对于整数范围，术语约可以包括比戶^大和小的一个或两个微。本文所使用的术语"周围条件"是指周围环境的条辨例如，实验在其中发生的室内或室外环境的^m。本文所4顿的术语"扩增子"慰旨聚，链式反应(PCR)的产物。扩增子是用扩增技术合成的DNA片段(例如，带有两条弓I物的双链DNA)。扩增子例如可以含有5，端用荧光M新己的弓l物，如图9的方案1所示。本文所i顿的术语"水性的"慰旨在其它成分以夕卜含有水的液体混合物。本文所使用盼'阵列(amy)"和"组成图案的阵歹iJ"是指元辨即实体)在材料或装置上的排列。在另一意义上，术语"阵列"是指在基质上的两个或多个检测区域的整剂咧(例如，行和列)。本文所使用的术语"细衝，(bacteria)和"细甯，(bacterium)是指所有的原核生物，包括在原核生物界中所有门之内的那些。该术语意图包含所有被认为是细菌的微生物，包括支原体、衣原体、放线菌、链霉菌和立克次氏体。所有的细菌形式都包括在这一定义之内，包括球菌、杆菌、螺旋体、球形体、原生质体等。这一术语也包括革兰氏阴性和革兰氏阳性的原核生物。"革兰氏阴性"和"革兰氏阳性"是指用本领域公知的革兰氏染色方法的染色样式。"革兰氏阳性细衝'是保留了在革兰氏染色中所使用的初级染料，使得染色的细胞在显微镜下显示出暗蓝色至紫色的细菌。"革兰氏阴性细窗'不保留在革兰氏染色中所^顿的初级染料，而过复染染色。因此，革兰氏阴性细菌显示出红色。本文所4顿的术语"生物学隋性的"尉旨材料的性质，该材料不会与生物材料发生化学反应。本文所使用的术语"互补的"或'互补"是指通过碱基配对规则相关联的多核苷酸(即，核齢列)。例如，序列"A-G-T"与序列"T《-A"互补。互补可以是'部分地"，其中只有一部分核酸的是根据配对规则匹配的。或者，在核酸之间可以存在'完全或'全部的"互补。核i^t间的互补度对核iifEt间的杂交效率和强度有显著的影响。本文所^顿的术语"临界角"是指入射角，高于这一角度时发生完全的内反射。本文所使用的术语"诊断的"是指S31其信号和症状(例如，对常规治疗的耐銜、或基因分析、病例分析、组织分析等对繊的识别。本文所4柳的术语"鄉"是指病理学或有害状态，诸如感染、炎症反应、癌、自身免疫以及基因,。本文所使用的术语"衰逝(evanescent)"是指表现出随距离指数衰减的近场驻波。在光学中使用时，当正弦波以大于临界角的角度在界面进行内部目并因此发生完全内部g时，即形成了衰iS波。本文所〗顿的术语"真窗，是t歸如霉菌和酵母的對亥生物。本文所4顿的术语"同源'是指互补度。可以有部分同源或完全同源(即同一的)。部分互补序列是指至少部分地抑制完全互补序歹i」与耙序列杂交的序列，用功能术语"基本同源"描述。对完全互补序列与耙序列杂交的抑制可以应用招氐严格度条件下的杂交分析(DNA或RNA印迹，溶麟交^)来检验。基本同源序列或探针在低严格度条件下会竞争或抑制完全同源序歹ij与耙序歹啲结合(即，杂幻。这不是说低严格度斜牛是允许非特性结合的；低严格度剝牛需要两条序列相互的结合是特辨即，选择性的)相互作用。可以用甚至缺乏部分互补度(即30X同一性以T)的第二耙来测试没有非特异性结合;没有非特异性结合盼瞎况下，探针将不会与第二非互补耙杂交。本领域技术人员公知可以应用许多等效的条件以包含低严格度条件；诸如探针长度和性质PNA、RNA、碱基组成)和靶的性质PNA、RNA、鹏组成、存在于溶液或固定的寧以鹏浓度和其它成浙存在或不存在甲,安、硫酸葡聚糖、聚乙二酉D等因素是要考虑的，并且杂交溶液可以不同以产生与上面所列条件将不同但等效的低严格杂交条件。此外，本领域技术人员已知在高严格劍牛下(例如，增加杂交和/或洗涤步骤的纟驢，在杂交溶液中应用甲醐安^)(参见以下"严格度"的定义)鹏杂交的剝牛。当駄双链核,列，诸如cDNA或基因组克隆时4顿的术语"基本上同源的"是指能在如上面所述的低严格条件下与双链核酸序列的任意链或两条链杂交的任意探针。当提及单链核酸序列时用的术语"基本上同源的"是指能在如上面所述的低严格条件下与单链链核酸序列杂交的任意探针(即，它是单链核,列的互补)。本文所使用的术语"杂交'是指互补核酸的配对。杂交和杂交的强與即，核酸之间联系的^^)数IJ此类因素的影响如核酸之间的互补度、所涉及劍牛的严格度、形成的杂交体的解lil，(Tm)、以及核酸中的G:C比值。在其结构内含有互补核酸配对的单链M称为"自杂交的"。本文所〗顿的术语"固定"是指材料与另一实辨例如，固相支持物)的化学或其^i接織留，其限制了材料的运动。本文所所用的术语"抑制剂"是指妨碍或阻止化学反应的物质、样品鹏物。本文所使用的术语"反应工具(means)抑制剂"是指能够妨碍或阻止给定反应工具(例如，,的作用或活性的抑审跻U。本文所使用的术语"内部核酸对照"是指以已知浓度加入到样品中的多核苷酸。本文所使用的术语"内部核酸对照探针"是指与内部核酸对照互补的多核苷、本文所4顿的术语"体外"是指AX环境，以及指在人工环境中发生的过程或反应。体外环境包括但不限于试管和细胞培养物。本文所f顿的术语"体内"是指自然环境(例如，动物和细卿，以及指发生在自然环境中的过程或反应。本文所使用的术语"分离物"是指从含所述核酸与至少一种其他成分的核酸自然来源中分离出来的核酸。在一个实施方案中，核酸在只有竊U、缓冲液、离子或正常存在于溶液中的其它组分存在(如果有的话)的情况下存在。术语"分离的"和"纯化的"不包含在它们自然来源中存在的核酸。本文所4OT的术语"材料"(material)禾口"材料"(materials)在最广泛的意义上是指物质的任何成分。本文所使用的术语"硫酵'是指硫醇幾即RSH)化合物。本文所使用的术语"微阵列"是指在固相支持物表面上形成的离散区域的线性或二维微阵列，每一个离散区域都具有清晰的区域。将与靶核酸序列或其子序列互补的寡核苷酸探针用下述的展示策略固定在固相支持物上。本发明的方法应用了包含显示出与一种或多种耙核酸序列互补的耙核酸探针的寡核苷酸微阵列。典型地，这些耙核酸探针是DNA并以高密度微阵列(即，"DNA芯片")固定在固相表面。本文所使用的术语"微生物"是指微生物的任何物种或数U，包括但不限于细菌、古细菌、真菌、原生动物、支原体和寄生生物。本发明认为其中所包括的大量微生物也是对受试者ft病的。本文所使用的术语"核酸分子"是指任何含有核酸的分子，包括但不限于DNA或RNA。术语包含例如包括DNA或RNA的任何己知iES类似物的序列，所述类似物包括但不限于4-乙,嘧啶、8-羟蟇N6-甲基腺苷、乙烯亚氨基胞嘧啶、假异胞嘧啶(pseudoisocytosine)、5-(羧基羟基甲萄尿嘧啶、5-嘧啶、5々繊嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2^f[尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基尿嘧咬、二羟基尿嘧啶、次黄嘌呤核苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基作观嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基次黄嘌呤核苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2^尿嘧啶、P-D-甘露糖基Q核苷(queos迈e)、5'-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲S^-N6-异lfe);希基腺嘌呤、尿嘧使-5-羟乙酸甲酉旨、尿嘧啶-5-羟乙酸、oxybutoxosine、〈跟嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2箭L尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4者L尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿14嘧啶-5-羟乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羟乙酸、作观嘧啶、Q核苷、2^胞嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。本文所4顿的术语"寡核苷酸"尉旨短长度的单链多核苷,。寡核苷酸典型地是100个残基长度以下(例如，15至50)，然而，在本文中^[顿时，该术语也包括更长的多核苷^l连。寡核苷^M常M它们的长度iK。例如，24个残基的寡核苷酸称为"24-基体"。寡核苷酸可以通过自杂交或:与其它多核苷交形成二级或三级结构。此类结构可以包括但不限于双螺旋、发夹、十字形、弯曲或三体。本文所fOT的术语"有机，f是指育,溶解其它物质的任何有机分子。示例包括但不限于氯仿、醇、酚、醚或其组合。本文所〗顿的术语"病原体，是指在宿主中引起疾病状銜例如，感染、癌钩的生物剂。病原体例如包括病毒、细菌、古细菌、真菌、原生动物、支原体、朊病毒和寄生生物。特定的病原体可以包括例如立克次氏体(^^//^)、衣原体(C似,jAi/a)、枝原晰A^cqp/aw2a)、j^^浙浙rac/2—、链球菌(St，tocoam」、葡萄球菌(5to;^必coam)、单核细胞增多性李司汰菌(丄.w朋oc;^ge"e力、脑膜炎^氏菌(W附ew/"g/^fey)、大肠杆菌(5.co//)、流感嗜血杆菌(HZ"yw^zae)、伯氏疏螺旋鄉.6w一o一)、钩端螺旋辨丄6)、郷杆菌——、厌氧杆菌(^4"aferaZ)acfer)、结核分支杆菌(M励m^/as7iy)、肠球菌(淑eracoccMy)、WM灰质炎病审尸o/,.謂.醋)、肠病毒(淑e勝/潛)、柯萨基病寧Coxracfe'm'—、本文所使用的术语"聚合酶链式反应"(PCR)是指K.B.Mullis美国专利号4,683,195、4,683,202和4,695，188中的方法，其描述了在没有克隆或纯化的基因组DNA混合物中增加革E^列片段浓度的方法。这一用于扩增E序歹,方法包括将大量过量的两条寡核苷酸弓l物加入至U含有期望革醉列的DNA混合物中，随后在有DNA聚合酶存在的情况下进行精确的序列热循环反应。两条弓卿与双链革巴序列分另啲链互补。为产生扩增，将混合物变性，并将引物退火至在靶分子中的它们的互补序列。退火后，用聚合酶延伸引物，因此形成了新的一对互补链。变性、弓l物退火和聚合酶延伸步骤可以重复很多次(即，变性、弓卿退火和延伸组成一个"循环"，可剤艮多"循环")以得到高浓度的期望耙序列的扩增片段。期望革巴序列扩增片段的长度由引物相互之间的相对位置确定，并且因此这一长度是可控制的参数。由于这一方法的重复方面的有点，这一方法被称为"聚合^l连式反应"(此后称为"PCR")。由于耙序列的期望扩增片段变成为混合物中的主要序列(就浓度而W)，因此将它们称为"PCR扩增的"。用PCR可以将基因组DNA中单拷贝的特定耙序列扩增至可以通过数种不同方銜例如，与标记的探针杂交；掺入生物素标记的引物，随后Mit抗生物素蛋白-酶缀合检测；将32P标记的脱氧核苷酸三磷酸，诸如dCTP或dATP掺入到扩增片段中)检测得到的水平。除了基因组DNA之外，用合适的引物^T组还可以扩增任意的寡核苷酸或多核苷酸序列。特别地，通过PCR过程产生的扩增片段本身是随后PCR扩增的高效模板。本文洲柳的术语"PCR产物"、"PCR片段"和"扩增产物'是指在完成两个或多个变性、退火和延伸步骤的PCR循环后化合物的结果混合物。这一术雜括这样的情况，即扩增了两个或多个耙序列的一个或多个片段。本文所f顿的术语"多糖"是指能通过7]C解分解为两个或多个单糖分子的碳水化合物。本文所使用的术语""和"地"是指在某些情况下可以产生某些益处的本发明的实施方案。然而，其它实施方案在相同的或其它情况下也可以是优选的。此外，一个或多个,实施方案的详述不是暗示其它的实施方案没有用处，也并非意图将其它实"案从本发明的范围内排除。本文所使用的术语"纯化的"或'基本上纯化的"意思是所述材料基本上没有其它生物大^T(例如，多核苷酸、蛋白、碳7jC化合物苟存在。本文{細的术语"反应"是指其中物厕例如，肝、膜和好集合)与其它物质结合、与其它物质交换组成、懒军、重排或其它化学改变的任何变化或转变。本文所〗顿的术语"室温"在技术上是指约20至25。C的纟鹏。然而，通常它是指在其中进行实验的一般区域内的周围纟乱度。本文所i柳的术语"样品"以其最广的意义l顿。怀疑指^#征是凋亡功能失调的病症的样品可以包括细胞、组织、或液体、从细胞中分离的染色俠例如，延伸的分裂中期染色体)、基因组DNA(在溶液中，或结合至固相支持物上诸如用于DNA印迹分析)、RNA(在溶液中，或结合至固相支持物上诸如用于RNA印迹分析)、cDNA(在溶液中或结合至固相支持物上)等。怀疑含有蛋白的样品可以包括细胞、部分组织、含有一种或多种蛋白的提取物等。本文所f柳的术语"抗生蛋白链菌素'是指从细菌OV/函//中纯化的60，OOO道尔顿的四聚体蛋白。本文所f顿的术语"固相支持物或'固体支微'以它们最广的意义f顿，是指本领域技术人员可获得并公知的许多支持物。固相支持物包括但不限于硅胶、树脂、衍生的塑料膜、玻璃珠、棉、塑料珠、铝胶等。本文所使用的术语"光谱"是指以波长的顺序排歹啲光能量的分布。本文所4顿的术语"稳定性"尉旨材料抵抗z顿或移位以及提供可靠性禾呵性的能力。本文所使用的术语"严格度"是指在其中进行核,交的温度、离子强度和其它化合物(诸如有机鋭O)存在的条件。在"高严格度"斜牛下，核酸ltt配对将只发生在具有高频率互补MS序列的核斷段之间。因此，"弱"或'低"严格度通常用于衍生自遗传上不同的生物的核酸，因为互补序列的频率通常很小。本文所使用的术语"受试者"是指待用本发明的方法处理的生物。此类生物优选包括但不限于哺乳动物(诸如，鼠科、猿、马、牛、猪、猫#)，以及最有逝也包括人类。本文所f顿的术语"基质"是指能够支持相关分析成浙例如，分析区域、细胞、测试化合物钩的材料。例如，在一些实船案中，基质包括平面(即，二维)玻璃、金属、复合材料、塑料、硅土或其它生物相容性或生物不反应(或生物反匈性组合物。可以应用许多基质。基质可以是生物的、非生物的、有机的、无机的或其组合，以颗粒、链、沉淀物、；鹏、薄片、管、球形、容器、毛细管、衬垫、切片、软片、盘、载波片等存在。基质可以具有任意的常规形状，诸如盘、方形、球形、圆形等。基质一般是平的，但也可以呈现不同的其它表面结构。例如，基质可以含有在其中发生合成的升高的或压低的区域。基质和其表面可以形成刚性支持，在其上进行本文描述的反应。基质及其表面也可以选择以提供合适的光吸收性质。例如，基质可以是聚合的LangmuirBlogett胶片、机能化玻璃、Si、Ge、GAAs、GaP、Si02、SiN4、改良的硅，或各种;鹏或聚合物之一，例如(聚)四氟乙烯、(熟亚乙烯基二氟化物、聚苯乙烯、聚碳酸酯或其组合。在阅读了本发明后，其他基M^才料对于本领域技术人员是显而易见的。在一个实施方案中，基质是平面玻璃。本文所使用的术语"基本上相同的"或鬼本上對以的"是指M—个或多个替换、缺失、或添加而与参照序列不同的核苷,列，其总的交媒没有导致参照和对象序列之间的相反功能。典型地，该基本上相同的序列的变化不超过35%(即，与相应的参照序列序列相比在基本相同的序列中单个核苷酸替换、增加和/或缺失的数目除以基本相同的序列中总核苷酸数目是约0.35#少)。该序列被称为与所列的序列有65%的序列同一性。在一个实施方案中，基本上相同的序列与参照序歹啲不同不超^:30%(70%序列同一銜；在这一实施方案的郷中，不舰25%(75%序列同一性)；在这一实施方案的其它中，不M20%(80%序列同一性)；在这一实施方案的其它变形中，不舰10%(90%序列同一性)；以及在这一实施方案的其它娜中，不超过5%(95%序列同一銜。在一个实施方案中，核酸序列具有至少约65%同一性。在其它实,案中，核酸序列具有至少约75%、80%、85%、90%、95%、98%、或99%的同一性。本文所f顿的术语"耙核酸"是指待检测病原体固有的多核苷酸。多核苷酸是遗传材料，例如包括DNA/RNA、线粒体DNA、rRNA、tRNA、mRNA、病毒RNA以及质粒DNA。通51检测病原体特有的耙核酸的存在，可以推断病原体的存在。类似地，对于病原体属特异的耙核酸的存在表明该属成员的存在。应用标准技术将靶核酸从生物样品和测试样品中分离。该技术将由待分离的多核苷酸，(例如DNA或RNA)确定。可以根据进行研究的病原体类型和生物或测i^f品的量对分离技术进行修改。本文所使用的术语"耙核酸探针"是指与靶核酸互补的多核苷酸。本文所iOT的术语"Tm"是揩'解链^S"。解撤，是这样的^M，在这^S下一群双链核酸分子的半数解离成单链。计算核酸Tm的公式是本领域公知的。如ffiil标准参考所指出的夷P样，当核酸在lMNaCl7JC溶液中时，可以M公式Tn^81.5+0.41(o/oG+C)来计算简单估计的Tm值(例如，参见，Anderson和Young,QuanlitativeFilterHybridization^NuclericAcidHybridization(l985))。其它参考例如包括考虑结构和序歹鹏fBt行Tm计算的复^i十算法。本文所i顿的术语"病韋'是指微小的感染剂，除了某些例外之外，其不能被光学显微镜观察到，缺乏独立的代谢，并且只有在活宿主细胞内才能复制。单个的颗粒(即病毒粒子)典型地由核酸和蛋白外壳或包膜组成，一些病毒粒子还具有含有脂类的膜。术语"病毒"包括所有类型的病毒，包括动物、植物、噬菌体18和其它病毒。本文所使用的术语"可见光谱"是指含有从约360nm至约800nm波长的光辐射。发明详述本发明提供了能够实时、同时量化测量来源于样品中一种或多种病原体的多种核酸的方法和设备。在一个示范性实施方案中，用聚合,式反应(PCR)扩增样品中的E核酸和内部核酸对照。PCR是公知的扩增一条或多条脱氧核糖核酸(DNA)链方法。通过将靶核酸和内部核酸对照置于含核苷酸腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶O)、胞嘧啶(C)和鸟嘌Rf(G)(总称为dNTPs)、DNA聚合物和引物的缓冲液中启始PCR。弓卿是短链DNA，其序列与待扩增的耙核酸和内部核,照互补。引物起始耙核酸和内部核酸对照的复制。在一个实施方案中，用荧光分子在靶核酸弓l物和内部核酸对照弓l物两者的5'端进行荧光标己。在另一个实敲案中，用荧光分子在耙核酸引物或内部核酸对照弓卿之一的5'端进行荧光标记。在再另一个实施方案中，dNTPs是荧光标记的。PCR过程具有三个主要步骤变性、退火和延伸。在变性阶段，将混合物加热至约94。C，在这一点将耙和内部对照DNA分离为单链。将混合物快速冷却。当纟驢降至6(TC时，退火步骤发生，其中引物(雌荧光标记的)杂交或结合至它们在耙核酸和内部核酸对照上的互补序列。延伸步骤可以在约6(TC或可以升高至72-78'C进行。在这一步骤中，DNA聚合酶利用溶液中的dNTPs延伸退火的引物"t^荧光标记的)并形成被称为扩增子的DNA,。简而言之，将混合物再加热至约94。C以将新产生的)M旋链分离为核酸单链，其开始另一个PCR循环。在PCR过程的每一个循环中，最初革巴核酸和最初内部核酸对照的拷贝数大体上翻倍。在一个实驗案中，PCR缓冲、舰含有荧光标记的引物，艮P弓卿具有与它们连接的荧光染料M，因此在完成每一个PCR循环后，产生的扩增子是荧光标记的。分别用称为耙核酸探针和内部核M照探针的探针DNA链将耙核酸和内部核酸对照的扩增子定位。靶核酸探针和内部核酸对照探针具有与靶核酸和内部核酸对照相同的互补核苷酸序列。以已知的、两维模式将耙核酸探针和内部核照探针束纟賊基质表面，并且基质表面形成含有PCR组分的反应孔部分。在PCR过程的退火和延伸过程中，耙扩增子杂，它们相应的核酸探针以及内部核酸对照探针上。用合适波长光的衰逝波激活荧光标记的弓l物或荧光标记的dNTPs的荧光染料M可以^[吏杂交的荧光染半斗标记的扩增子发光。在ffiil靶核酸探针和内部核酸对照探针束缚至其上的基质表面iSA反应孔后，这一衰逝波在能量上指数魏，具有约300nm的有效穿透范围。这意歸魏波穿透得足够远至反应孔中以激活杂交至那些耙核酸探针和内部核M照探针的荧光标记的扩增子，但是其不会激活在反应L主体中的溶液中的荧光标记的分子(例如，荧光标记的引物或荧光标记的dNTP)。舰监测在基质表面不同錢上的荧光强度，可以确定相应靶核酸和内部核酸对照扩增子的当前丰度。这可以在PCR过程中实时完成。结果可以用于以类似于实时PCR计算的方法得到在最初样品中特定耙丰度的量化观懂。在一个实案中，PCR利用包括选自SEQIDNO:1-12演l)的多核苷酸的引物。一些引物的组合例如包括SEQIDNO:l和2、SEQIDNO:l禾n4、SEQIDN0:l禾tl6、SEQEDNO:3和2、SEQIDNO:3和4、SEQIDNO:3和6、SEQIDNO:5禾H2、SEQIDNO:5和4、SEQK)NO:5和6、SEQIDNO:7和8、SEQIDNO:9和10、和/或SEQIDNO:ll和12。表lgBOtt)NO细菌ttctcctac鹏敏狄goag(革兰氏+).细菌.t)加ccgcggot伊t欲cac2(革兰氏-)细菌柳gactcctacgg;aggcagpag(3")(革兰氏+)细菌gMt柳gcgg邻ctggcac($53》4(革兰氏-).细菌cc他otccta，鹏agscagoag(353)(革兰氏+)细菌tattsccgcggctgo敏cac(553)6.肠病毒ctce欲ccctgfta敏gg(372)肠病毒鹏c加gtagtcggttocg(478).8HSVsggaactcctccaccgccca(74869)HSVsgta卿鹏c;tc。tgggc(75086〉10真菌11真菌，2在另一个实施方案中，将耙核酸探针设计为与分离自病原体的多核苷酸互补，所述病原体选自细菌、病毒、真菌、原生动物。在再另一个实施方案中，耙核酸探针设计为与分离自立克次氏体(舟cfe版a)、衣原辨CMw^fe)、枝原体(A^co//oswa)、^^^Sp/rac/^te」、链球菌(5^/tocoom)、沙门氏菌(&r/wo"e/Za)、葡萄球菌(Sto/^/ococa^)、单核细胞增多性李司戎菌(丄.wo"oc声o伊"CT)、脑膜炎奈瑟氏菌(A^e"/"g故cfe)、大肠杆菌(五.co//)、流感嗜血杆菌(//^/認服尼)、伯氏疏螺旋鄉.一鄉力、钩端螺旋俠"、娜杆菌——、厌氧杆菌(血aew/acter)、结核分支杆菌(M励ercw/0—、肠球菌(五"詢coc—、人类Wli，炎病毒1(//.尸o^v,層1)、人，病毒71(/7.e"feraw)w71)、人，病毒70(7/.e"terav/my70)、人类伊科病毒2(Hec/jcw'my2)、人类伊科病毒4(Hec/20v,'ntf4)、人类伊科病毒6(Hec/wv/my6)、人类伊禾骗毒9(Hec/jov,my9)、21人类伊科病毒u(//ec/j謂'，11)、人类伊科病毒12(//ec/ov/m12)、人类伊科病毒26(Hec/cw，26)、人类柯萨鶴毒A13(HcoxracA:/eWmA13)、人类柯萨^fi毒A15(Hcoxsacfe'ev/msA15)、人类柯萨基病毒A18(Hcoxsacfeev/myA18)、人类柯萨基病毒A20(Hcm似db'ev/，A20)、人类柯萨基病毒A21(Hcoxradfew，A21)、人类柯萨翻毒B3-A(HcoxracA^v/，B3-A)、人类柯萨基病毒B3-C(//coxradbev/myB3-C)、//SW、//5"r-2的多核苷IE补。在另一个实施方案中，革巴核酸探针选自SEQIDNO:13-52(表2)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>图1是倉,S^波检测微阵列PCR反应中荧光标记的扩增子的示范性设备的横面图，包括反应盒IO、具有基质表面13的基质12、第一核酸耙探针14、第二核酸耙探针15、第一内部核W"照探针14A、第二内部核酸对照15A、缓冲溶液16、第一耙核酸链18、第二耙核酸链20、第一内部核酸对照18A、第二内部核酸对照20A、dNTPs22、任选地荧光标记的dNTPs24、荧光标记的引物26、热稳定DNA聚合酶28、加热元件30和冷却元件31。在一个实案中，基质12由比缓冲溶液16更稠密的材料组成，因此可以如以下更详细描述地那样应用^^波。基质12例如可以是玻璃，或适当地包被的塑料或聚合物。第一和第二耙核酸探针14和15以及第一和第二内部核酸对照探针14A和15A是DNA链，每一个分别具有耙DNA链18和20以及内部核照18A和20A之一的特异核苷1W列。在一个实施方案中，这些耙核酸^^针和内部核酸对照探针是不口J延伸的。换而言之，不旨巨将核苷酸添加至耙核酸探针和内部核,照探针的任一端。革巴核酸探针14和15以及内部核M照探针14A和15A可以是天然的或合成制造的多核苷酸，应用商业可获得的寡核苷酸合成仪(例如可从GenomicSolutions,Inc.ofAnnArbor,Mich获得的POLYPLEX合成仪)构建的有Ai^碱基和MAit碳水化合物、肽核^(PNAs)、二环核,NAs)、或其它核酸类似物的多核苷酸。或者，探针可以是但不限于选自DNA序列文库，诸如已知具有一些生物学意义的表达序列标，ST)文库的序列。将耙核酸探针14和15以及内部核IW照探针14A和15A排列在基质表面13上。在一个实M案中，ffi31应用商业可获得的微阵列掛lt(例如可从GenomicSolutions,Inc.ofAnnArbor,Mich获得的OMNIGRID微阵列仪)的自动印刷将耙核酸探针14和15以及内部核M照探针14A和15A作为小点排列在基质表面上。可通过公知的技术，诸如但不限于共价缀合活性甲硅烷基与靶核酸探针和内部核酸对照探针，将第一和第二耙核酸探针14和15以及第一和第二内部核IW照探针14A和15A固定在基质表面13上。在手工或自动方爐后，该硅烷化的好立即被固定在玻璃表面上。或者，可通过合适地电学充电该表面，优^M51应用合适的涂层，例如，麟、聚-L-赖氨酸、多糖、硫醇或其组合，固定第一和第二耙核酸探针14和15以及第一和第二内部核1M照探针14A和15A。荧光标记的引物26或任选的荧光标记的dNTPs24是可以用荧光染料标记的核苷酸，所述荧光染料例如是萤光黄或若丹明绿染料，或类似的、具有类似荧光特性的相关化合物，诸如功能化鋼入染料禾拨光的功能化的纳料立刊量子点)。任选荧光标记的dNTPs24可以具有荧光标记的四种1|亥苷酸dGTP、dCTP、dATP和dTTP的一种、两种、三种或四种。加热元件30可以是任何合适的当电流S31它时提供热量的电阻材料，例如碳。加热元件30需要育辦在几併中内将反应盒10加热至94°C。冷却元件31可以是任何^S的固态^4口元件，例如，公知的作为热泵的Peltier固态装置。加热元件30和7賴卩元件31也可以位于反应盒10的外部。图2是會,在PCR过程退火和/舰伸阶段的终点衰逝波检测微阵列PCR反应中荧光标记的扩增子的示范性反应盒10的横面图，还分别包括第一、第二24第三和第四荧光标记的扩增子32、34、32A和34A。第一荧光标记的扩增子32是具有这样的核苷1W列的DNA链，所述核苷辦列是第一耙核醚连18的互补拷贝，也就是说，对于每一个在第一耙核酸链18中的腺嘌呤(A)核苷酸，在第一荧光标记的耙扩增子32中有胸腺嘧啶(T)核苷酸，fe亦然。對以地，对于每一个在第一耙核酸链18中的胞嘧啶(C)核苷酸，在第一荧光标记的耙扩增子32中有鸟嘌呤(G)核苷酸。第二荧光标记的扩增子34是具有这样的核苷歹啲DNA链，所述核苷酸序列是第二耙核酸链20的互补拷贝，也就是说，对于每一个在第一耙核酸链20中的腺嘌呤(A)核苷酸，在第二荧光标记的耙扩增子34中有胸腺嘧P定(T)核苷酸，肚亦然。對跟也，对于每一个在第一耙核20中的胞嘧啶(0)核苷酸，在第二荧光标记的耙扩增子34中有鸟嘌，G)核苷酸。第三荧光标记的扩增子32A是具有这样的核苷酸序列的DNA链，所述核苷酸序列是第三耙核^I连18A的互补拷贝，也就是说，对于每一个在第三耙核酸链18A中的腺嘌呤(A)核苷酸，在第三荧光标记的耙扩增子32A中有胸腺嘧啶(T)核苷酸，肚亦然。类似地，对于每一个在第三耙核,18A中的胞嘧啶(C)核苷酸，在第三荧光标记的耙扩增子32A中有鸟嘌呤(G)核苷酸。第四荧光标记的扩增子34A是具有这样的核苷,列的DNA链，所述核苷鹏列是第四耙核,20A的互补拷贝，也就是说，对于每一个在第四耙核20A中的腺嘌呤(A)核苷酸，在第四荧光标记的耙扩增子34A中有胸腺嘧啶(T)核苷酸，^fet亦然。类鹏也，对于每一个在第四耙核酸链20A中的胞嘧啶(C)核苷酸，在第四荧光标记的耙扩增子34A中有鸟嘌呤(G)核苷酸。在PCR过程的退火和/或延伸阶段的终点，Mii火的荧光标记的引物26延伸产生的第一、第二、第三和第四荧光标记的扩增子32、34、32A和34A保持杂赶它们相应的第一和第二革巴核,18和20以麟一和第二内部核,照18A和20A上。此外，在之前的PCR循环中产生的扩增子杂交至束缚的第一和一二耙核酸探针14和15以及第一和第二内部核照探针14A和15A上。例如，在表面位点36上，第二荧光标记的扩增子34杂交至第二耙核酸探针15上。类似地，在表面位点38上，第一荧光标记的扩增子32杂，第一耙核酸探针15上。例如M由它们的3'端束缚至表面，鄉过具有由双脱氧1針布的3'端或具有添加至3'端的稳定基团，或ffl5i其它公知的使得耙核酸探针和内部对照核酸探针在有特定弓l物存在盼瞎况下不参与PCR反应的方法，将第一和第二革巴核酸探针14和15以及第一和第二内部核照探针14A和15A设计为不在PCR过程中被扩增。图3是能够在PCR过程变性阶段^^波检测微阵列PCR反应中荧光标记的扩增子的示范性反应盒10的横面图。在这一阶段，在反应盒10中的混合物已被加热至接近10(TC，以及最佳至约94。C。在该温芰下，DNA是变性的，也就是说，它分离为制虫的单链。当在PCR过程的下一阶段冷去埘，第一和第二耙核勝连18和20以，一和第二内部核W照链18A和20A的每一条，以及第一、第二、第三和第四荧光标记的扩增子32、34、32A和34A的每一条将与荧光标记的引物26退火。由于热稳定DNA聚合酶28添加合适的碱基，退火的荧光标记的弓l物26会得到延伸，直到第一和第二耙核^f连18和20的每一条，第一和第二内部核,照链18A和20A的每一条，以麟一、第二第三和第四荧光*射己的扩增子32、34、32A和34A的每一条将杂交至新的扩增子，所述新扩增子是最初的第一和第二耙核酸链18和20以，一和第二内部核照链18A和20A的拷贝或互补拷贝。图4是显示在PCR过程检测阶段S3S波检测微阵列PCR反应中荧光标记扩增子的示范性反应盒10的横面图，进一步包括入射光束40，入射角42、湖光束44、衰逝波46、荧光光束48和荧光检测仪50。检测阶段可以与退火和/或延伸阶段同时发生。将入射光速40选择为这样的波长，所述波长飽于用于荧光标记引物16或任^t也荧光标记的dNTPs24的荧光团。在一个实施方案中，入射皿40是488nm的氩离子激光光谱线，其很接近地匹配荧光黄染料的最大激发(494nm)，所述荧光黄染料被用于标签或标记荧光标记的引物16或任i&t也荧光标记的dNTPs24。选择入射40的入射角42大于^^至缓冲、液界面的临界角。入射的临界角是这样的角，即在这个角度发生完全的内部反射并且取决于于形成界面的材料的折射率。从Snell's折射定律，入射的临界角^sin"(n美)，其中n！和n2是在界面任一侧的材料的折射率。在本发明的一个实肺案中，基质12由玻璃.组成并且具有约1.5的折射率，而缓冲溶液16主要由具有约1.3的折射率的水组成，因此，入射临界角是大约61度。当光以大于临界角读数的入射角42在基质表面13反射并因此发生完全的内部反射时，形成了衰逝波46并且传播通过基质表面13。从基质表面13的距离每增加130nm，^m波46的^艘M3i"e"(即数学常数)因子陶氏。因此，只有非常接面13的对象才能被衰逝波46照射到。在本发明的一个实施方案中，禾,这一性质来照射分别杂交至第一和第二革巴核酸探针14和15以及第一和第二内部核^t照探针14A和15A的第一、第二第三和第四荧光标记的扩增子32、34、32A和34A。可以舰荧光检测仪50检测并分析由荧光标记的扩增子32、34、32A和34A鄉的荧光48。荧光检测仪50典型地包括会聚光学，诸如显微镜物镜，其能将光聚焦至检测系统，诸如光电倍增管或电荷耦合器件(CCD)照相机^fi电二极管。收集到的荧光的起源和强度可以用于估计发射荧光分子的数量，并且由此ltbM例如应用在实时或动力学PCR分析中采用的公知量化技术估计当前杂交至特定寡探针的荧光标记扩增子的数量。在实时或动力学PCR分析中，反应特征是第一次检测PCR产物扩增的时间点是在循环的过程当中，而不是在固定的循环数后积累的PCR产物的量。在最初样品中耙核酸拷贝数目越大，越快观察到荧光的显示增加。在本发明的其它实施方案中，可以通皿测反射光并确定由荧光标记吸收的光的量来检测荧光信号。图5显示了荧光对三种靶DNA链循环数的示范性标绘图52，54和56，所^H种耙DNA^^最初样品种具有不同的拷贝数。开始或^线背景荧光信号甚至可以在没有进行PCR循环的时fi蘇尤检测到。在PCR的最初的循环中，这一荧光信号几乎没有改变。基线之上荧光的增力卩表明检测至驟集的PCR产物。通过设定在基线之上的固定荧光阈值58，可将阈循环(CT)参数定义为部分循环数目，在这个循环数上，特定寡探针的荧光超过了这一固定的阈值，如通i!H个部分值Crt、Q2、Q所表明的那样。图6是在最初样品中耙核,拷贝数的对数(log[N])对耙核酸阈循环(CT)的示范性标绘图。由于PCR的指数性质，最初耙拷贝数的对数对CT的标绘图是直线60。Mil引入数个在最初样品中具有已知拷贝数的内部核M照，与它们相应的内部核酸对照探针有关的荧光可以用于产生最初拷贝W"数对CT的直线标定线60。ffiil测量已知具有特定耙核酸探针的反应孔位置上的CT，可以从27标定线推导出对应于该耙核酸探针的耙核酸的拷贝数。图7是循环数(X轴)对内部扩增子数(Y鄉的示范性标绘图。等式^1000x(1+乂)"表示扩增反应的指数期函数，其中N是扩增子数目。如果标准^j牛下X=80%，现实条件下X=75%，为计算达到100,000的标准循环数(n)，n=log(100)/lOg(1.8)=7.83。然而，如果降低了扩增效率，现实循环数(n')可能是n'=log(100)/log(l.75>8.23。在理想的测试条件中(不考虑不同杂交反应的不同动力学)，在这一等式中可以用杂交信号代替扩增子数。在这种情况下，校准因子是f=(l+X鹏)/(l+X)。这一校准因子对于每一个内部核自照和每一个耙核酸都是普遍适用的。此外，可以用现实和标准杂交曲线计算这一校准因子。例如，从图7的曲线可以计算f为f二(l+175)/(l+0.8H).92。此外，也可以通舰一校准因子将耙分子的杂交信号校准为它的标准信号。如果将耙核酸标准曲线的函数(1)表示为N尸N^(1+X雜)n，并且现实杂交信号是W，贝版准杂交信号是N尸N!7fn二NK)X(l+X臃)11。因此，N化可以从等式NK)二N!，/[rx(l+X蹄)n]计算得到。如果计算的f超出了对照范围，例如0.9至1.1，可将该测试认为是无效的。本发明也提供了用于检测来自一种或多种病原体的两种或多种耙核酸的试剂盒。试剂盒包括至少一个引物对禾瞎核苷酸微阵列，所述寡核苷酸微阵列包括两种或多种靶核酸探针和一种或多种内部核酸对照探针。尽管之前的讨论利用DNA作为示范性核酸，本领域技术人员应当很清楚可将本文公开的方法用于其它核酸，包括RNA序列或RNA和DNA序列的组合。尽管之前的讨论利用PCR作为示范性反应，本领域技术人员应当很清楚可以禾,任何合适的扩增方法来应用本文公开的方法，所述扩增皿诸如但不限于逆转录PCR、随机引物扩增、滚环扩增或线性扩增"T7"。尽管之前的讨论利用荧光标记的弓嫩来标记靶核酸和内部核M照，本领域技术人员应当明了应用相关结构，诸如但不限于机能化纳米粒子或插入染料来硫耙核酸和内部核舰照。尽管为了简明，之前的讨论就两种核酸和两种内部核酸对照进行了讨论，本领域技术人员应当明了利用该方法和设备用于一种耙核酸，或用于多种核酸和多种内部核酸对照的量化评估。尽管本发明以对结构特征和/或方法行为特定的语言进行了描述，但应当理28解所附权利要求中定义的发明不必要用描述的特定特征或行为来限定。而是，所述特定特征和行为作为实m^f要求保护的发明的示范性形式而公开。应当理解，己经将本发明的某些描述简化为只有那些与清楚理解本发明相关的元素和限制，而为了简要，排除了其它元件。本领域技术人员在考虑了本发明的说明书后，将认识到为了实现本发明，其它元件和/或限制也是可期望的。然而，由于本领域技术人员在考虑了本发明的说明书后，能够很容易地确定此类其它元件和/或限制，并且它们对于完全理解本发明不是必需地，因jt体文没有提供此类元件和限制的讨论。实施例以下的实施例是以上发明的阐述。本领域技术人员将很容易地认识到实施例中描述的技的式剂启发了许多其它在其中可以实践本发明的方法。应当理解，在本发明的范围之内可以进^亍许多变化和修改。除了操作实施例，或除非另外明确地说明，在说明书以下部分的所有数值范围、量、值和百分数，诸如那些材料的量、反应的时间和温度、量的比值以及其它应当读作如同在其前面加有'约"，即使术语"约"没有明确地与值、量或范围一起出现。因此，除非相反的指出，在以下说明书和所附权利要求书中的提出数值参数是近似值，其可以依据本发明所追求得到的期望特性而不同。至少，并非试图限制权利要求范围相等数值的应用。每一个数值参数至少应当具有报道的有效数割立数，其通过普通舍入规则构建。尽管阐述本发明宽范围的数值范围和参数是近似值，但是在特定实施例中提出的数值尽可能精确地报道。然而，任何数值固有地含有某些必然从在它们各自的测试观懂中发现的标准偏差得到的误差。此外，当本文阐述不同范围的数值范围时，预期可以应用包含所列雜的这對直的任意组合。实施例1十二种细菌的量化微阵列革巴组包括十二种不同种类的细胞与两种内部核照。内部核M照A将是已知的低浓度以及内部核酸对照B将是已知的高浓度。弓卿组包括所有的十二种细菌物禾中以及内部核M照A和B的正向弓卿和反向引物。探针細每包括所有的十二种细菌物种以及内部核酸对照A和B的探针。例如，耙探针A对耙核酸A是特异的，以及耙探针B对耙核酸B是特异的。典型地，所有十二种细菌种类的探针和内部核酸对照A和B的探针之间应当没有交叉反应。此外，典型地，内部核酸对照探针A及B和十二种耙核酸之间应当没有交叉反应。特异地设计内部核酸对照A和B以满足与耙核酸相比有相同扩增效率的要求。可将内部核酸对照设计为线性或环状的双链DNA，例如，以质粒的形式。可将与弓l物对互补的序列设计在它的分子中。弓卿结合区域之间的片段将具有合适的序列和长度，以确保适于具有相同PCR效率的最初扩增条件以及适于弓I物设计，与细菌DNA耙和探针没有交叉反应。可以通过針生物学技术，诸如PCR、限制性酶消化、DNA连接、转化等设计并克隆内部核,照。内部核酸对照A和B将与在样品中的其它12种细菌DNA共同扩增。如果在核酸样品中存在PCR抑制剂，扩增反应将被抑制。结果，在帝啶的检测时间(例如，扩增20个循环后)探针A/B的杂交信号将落^t照范围之外。因此，应当认为这一样品的检测结果是无效的。当存在一些因素将影响扩增/杂交系统时，可以用内部核M照来校准最终结果。例如，当样品中所坏疑的细菌浓度很低时，内部核M照A可用于校准。另一方面，当所怀疑的细菌浓度很高时，内部核酸对照B可用于^^准。理想地，可以通过恰当地设计針序列使得细菌核酸耙X和内部核照A和B以相同地扩增和杂交效率共同扩增。虽然它们可以具有相同的扩增效率，但在多数瞎况下不能达到相等的杂^^率。这可能是因为在固定鹏下，不同耙-探针对的杂交动力学是不同的。此外，可以构翻于每一种靶肝的校准曲线系列。例如，如果在杂交之前内部核酸对照的最初拷贝数是10325，应当完成在标准条件下的双份测试，以得到基于每一扩增循环中平均杂交信号的剂量(扩增循环数)-效果(杂交信号)曲线。以类似的方式，可以得到102、1015、103、10"、104拷贝的剂量^媒曲线。典型地，可以得到102、1025、103、1035、104、1045、105、1055、106和1065的每一种均耙分子的剂量-效果曲线。如果内部核照在扩增循环11、n+l、n+2的杂交信号在1(P和103的曲线之间，可以将内部核W"照和所膀f的细菌DNA都向上校准10°5倍。典型地，如果革巴核酸X在扩增循环n、n+l、n+2的杂交信号在1035和104的曲线之间，浓度应该是在104和1045之间。典型地，由于当细菌耙分子具有高浓度，例如108时，靶A的扩增会受到抑制，因此也将使用内部核1M照B(具有大拷贝数)。也就是说，在内部核W"照A将落入检测范围之前，PCR材料将大量的消耗掉。相反，内部核酸对照B(具有高浓度，例如10625)将不会数#谈细菌耙分子的抑制。对于靶核,照B，应当粒105、1055、106、1065和107拷贝的校准曲线组。每一细菌革巴舒的剂量-效果曲线应当建立在1065、107、1075、108、1085、109和101()5上。尽管将检测时间改变为循环m、m+l和m+2(nKn)，但是应当以类似的方式进行校准。ilil在设置不同浓度的内部对照，将能扩展系统的检测范围。所有的出版物、专利、专利文件均在此引入作为参考，就像通过参考单个弓l入那样。M^l不同的特定和雌的实驗案和技术对本发明进行了描述。但是，应当理解在本发明的实质和范围内可以进行许多变化和修改。序列表<110>霍尼韦尔国际公司<120>用于寡核苷酸微阵列的定量方法<210>1<211>20<212>DNA<400>1actcctacgggaggcagcag〈210>2<211>20<212>薩〈400>2attaccgcggctgctggcac<210>3<211>24<212>■<400>3ccagactcctacgggaggcagcag<210>4<211>21<212>■<400>4gattaccgcggctgctggcac<210>5<211>24〈212>靈<400>5ccatactcctacgggaggcagcag<210>6<211>21<212>薩<400>6tattaccgcggctgctggcac<210>7<211>19<212>DNA<400>7ctccggcccctgaatgcgg<210>8<211>20〈212>DNA<400>8acccaaagtagtcggttccg<210>9<211>19<212>薩<400>9ggaactcctccaccgccca<210>10<211>19<212>■<400>10gtaccagggcgtcctgggc<210>11<211>22〈212>DNA<400>11ggccgttcttagttggtggagt<210>12<211〉21<212>DNA<400〉12atgctctatccccagcacgac<210〉13<211>38<212>DNA<400>13ccgagcaacgccgcgtgagtgaagaaggttttcggatc<210>14<211>38<212>DNA<400>14tgcagccatgccgcgtgtatgaagaaggccttcgggtt<210>15<211>34<212>DNA<400>15tttttccccggggaggaaggtgttgtggttaata<210>16<211>34<212>DNA〈400>16tttttccccgtgttgtggttaataaccgcagcaa<210>17<211>40<212>DNA<400>17cccccgtactttcagcggggaggaaggtgttgtggttaat<210>18<211>38<212〉薩<400>18cggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggtc11cggatc<210〉19<211>38〈212>DNA<400>19tgaagcaatgccgcgtgagtgatgacggccttcgggtt<210>20<211>38<212>DNA<400>20cggagcaacgccgcgtgtatgaagaaggttttcggatc<210>21<211>38<212>DNA<400>21tccagccatgccgcgtgtctgaagaaggccttcgggtt<210〉22<211>38<212>DNA<400>22tgcagccatgccgcgtgtatgaagaaggccttcgggtt<210>23<211>35<212>DNA<400>23gaagggagtaaagttaatacctttgctcattgacg〈210>24<211>35<212>DNA<400>2411111cccccggggaggaagggagtaaagttaata<210>25<211>34<212>DNA<400>25cgtcaatgagcaaaggtattaactttactccctt<210>26<211〉39<212>DNA<400>26ccccccgtcaatgagcaaaggtattaactttactccctt<210>27<211>38<212>DNA<400>27cgcagccatgccgcgtgaatgaagaaggccttcgggtt<210>28<211>38<212>DNA<400>28cggagcgacactgcgtgaatgaagaaggtcgaaagatt<210>29<211>38<212>■<400>29agcagcgacgccgcgtgaacgatgaaggtcttcggatt<210>30<211>38<212>DNA<柳>30tgcagccatgccgcgtgtatgaagaaggccttagggtt<210>31<211>38<212>DNA〈揚31tgcagcaacgccgcgtgagtgataaggcttcgggttgt<210>32〈211>38<212>DNA<400>32tgcagcgacgccgcgtgggggatgacggccttcgggtt<210>33<211>38<212>DNA<400>33ccgagcaacgccgcgtgagtgaagaaggttttcggatc<210>34<211>36<212>薩<400>34ccacggagcaagtgccctcaat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