专利名称：：兼具几丁质酶和溶菌酶活力的萝卜双功能酶工业制备方法
技术领域：
：本发明涉及兼具几丁质酶和溶菌酶活力的萝卜双功能酶，尤其涉及兼具几丁质酶和溶菌酶活力的萝卜双功能酶工业制备方法。
背景技术：
：几丁质(Chitin)是一种以|3-1，4糖苷键连接的N-乙酰葡萄糖胺(N-actylglucosamine，GlcNAc)，为生物多糖，是真菌细l包壁、非脊推动物如昆虫、线虫的外骨骼的重要结构成份。几丁质结合蛋白(Chitin-bindingproteins,CBPs)是一类能与几丁质(Chitin)特异结合的蛋白质，广泛存在于动、植物中，是动、植物防御细菌和真菌感染的天然防卫体系的的组要成员，在动、植物受到伤害时、病虫害侵染时大量表达。溶菌酶能催化水解构成细胞壁的N-乙酰葡萄糖胺(和N-乙酰胞壁酸(N-acetylmuramicacid,NAM)之间的|3-1，4糖苷4建，也能水解几丁质N-乙酰胞壁酸之间的|3-1,4糖苷键，生成粘多糖、粘多肽、N-乙酰葡萄糖胺等生物小分子。在动、植物、微生物中都有存在。其用途广泛，在食品工业上，溶菌酶是双歧杆菌的增值因子，用于乳制品中，可防止肠炎和变态反应，对婴、幼儿的肠道菌群有平衡作用；在干酪中添加溶菌酶可抑制丁酸菌的污染；在海鲜、肉制品中，溶菌酶与氯化钠和亚硝酸盐一起应用可延长肉制品的保质期，增强其防腐效果；在医药上，溶菌酶参与人体的多糖代谢，加速粘膜组织的修复，并具有抗感染、抗细菌、抗病毒的作用；溶菌酶还能分解粘膜蛋白，降解脓液或痰液的粘度，使之变稀而排出；还能与血液中的抗凝因子结合，具有止血作用等。萝卜双功能酶兼具几丁质酶和溶菌酶活力，酶稳定性高，酶活力在0~60°C,pH3.410.0稳定;抑菌谱广，对革兰氏阴性细菌(G—)、革兰氏阳性细菌(G+)、真菌、昆虫等都由一定的杀灭作用。(萝卜CBPs的分离及部分酶学特性研究。赖晓芳，深善瑞，王炜军。淮海工业院学报，第12巻第四期，47~50页；中国专利CN02115151.2)。其作用机理是直接作用于靶标的细胞壁，使细胞壁降解、破裂，进而杀死靶标，对动、植物无毒副作用，也不会产生耐药性；而目前使用的抗生素类药物主要是通过阻断细菌的复制繁殖，动、植物会产生严重的耐药性，对动、植物危害很大。目前，这类酶制剂(如鸡蛋清溶菌酶)的生产制备多用等电点沉淀法即原料(蛋清)稀释，加入"/。NaCl，调节pH值至等电点(pl),加入晶种，离心收集。此工艺的缺陷是等电点时，酶沉淀不完全，还有部分酶处于溶解状态，产率低，二是等电点时，酶变性失活，损伤了酶的活力。也可采用离子交换树脂吸附法，但是，由于树脂的疏水性，易引起蛋白变性，而且，杂蛋白多，酶的纯度不高。兼具几丁质酶和溶菌酶活力的萝卜双功能酶的性质为其在生产、生活中应用提供了基础。目前，可用于防治动、植物真菌感染的植物来源的工业产酶极少，如何实现兼具几丁质酶和溶菌酶活力的萝卜双功能酶的工业化生产是限制兼具几丁质酶和溶菌酶活力的萝卜双功能酶推广应用和产品开发的瓶颈。
发明内容本发明的目的是提供一种兼具几丁质酶和溶菌酶活力的萝卜双功能酶工业提取方法。该法操作工艺简单，陈本低廉，所得萝卜双功能酶酶活力高，抗菌谱广，稳定性好，半衰期长，可用于医药，卫生保健、农药等领域。本发明是通过如下技术方案实现的一种兼具几丁质酶活力和溶菌酶活力的萝卜双功能酶工业制备方法，其特征在于，先将原料洗净，切碎，用匀浆液搅拌匀浆，通过离心，过滤，超过滤等步骤获得萝卜双功能酶浓缩液，浓缩液分别加入保护剂，喷雾干燥后制得干粉萝卜双功能酶，包含以下步骤(1)原料处理取新鲜萝卜叶或块根洗净；(2)勻浆提取取(1)所得原料，加入原料体积1~2倍的4。C预冷的匀浆液搅拌匀浆；(3)离心将(2)所述匀浆过滤，保存滤渣，取滤液，在室温下，12000r/min离心，收集上清液I;(4)过滤取上述上清液I,用200目二层尼龙布过滤，收集滤液；(5)再离心取(5)所得滤液，常温下，14000r/min离心，收集上清液III;(6)超过滤排阻相对分子量10000和60000的蛋白质，截留相对分子量10000~60000的蛋白质，得浓缩液；(7-l)萝卜双功能酶I:取(7)所得浓缩液，加入保护剂，喷雾干燥，进风温度185°C~195°C，出口温度80。C~85°C，获得喷雾干燥粉即为萝卜双功能酶I。较佳地，所述的兼具几丁质酶活力和溶菌酶活力的萝卜双功能酶工业制备方法，还包括如下任意步骤(1)萝卜双功能酶II:取(7-l)所得萝卜双功能酶I,加入稳定剂，即得液体萝卜双功能酶II;(2)液体萝卜双功能酶III:取(7-l)所得萝卜双功能酶I，加入pH6.2，0.1M磷酸钠緩冲液溶解后，亲和层析，收集含酶洗脱液，再经超滤浓缩，截留分子量10000以上的蛋白质，得浓缩液加入稳定剂，即得液体萝卜双功能酶III;(3)固体粉末萝卜双功能酶III:取(7-l)所得萝卜双功能酶I，加入pH6.2,0.1M磷酸緩冲液溶解，常温下，14000r/min离心，收集上清液，超滤浓缩，截留分子量10000以上的蛋白质，得浓缩液加入稳定剂，冷冻干燥，所得干燥粉即为固体粉末萝卜双功能酶ni。较佳地，步骤(1)所得原料经如下诱导条件诱导后再匀浆原料切碎，在10。C20。C，3000~50001ux光照条件下，i秀导5~10天；较佳地，所述诱导条件为14°C~18°C,3500~45001ux光照条件下，诱导6~8天。所述诱导条件为15。C，40001ux光照条件下，诱导7天。较佳地，所述的兼具几丁质酶活力和溶菌酶活力的萝卜双功能酶工业制备方法，还包括如下步骤，取步骤(3)所得滤渣，加入滤渣体积1~2倍的4'C预冷的匀浆液搅拌匀浆，将匀浆过滤，丢弃滤渣，取滤液，在室温下，12000r/min离心，收集上清液II,上清液II与所述上清液I合并后，进行步骤(4)过滤；步骤(2)所述匀浆液选自但不限于5mM醋酸缓冲液，5mM磷酸緩沖液，5mM碳酸氢钠緩冲液。步骤(7-l)所述保护剂为质量/体积为5%的变性淀粉。所述稳定剂为体积/体积为3%~6%甘油，质量/体积为6%~12%葡萄糖。所述亲和层析介质为脱氨再生几丁质凝胶。本发明的有益效果为l.采用低温光照诱导技术，使原料酶含量提高23倍；2.研制了特定的萝卜双功能酶活性稳定剂和保护剂，在室温下，萝卜双功能酶在2年内活力基本不变，为原有酶活力的97%以上；3.原料来源广、价格便宜，不受季节、气候等因素影响，一年四季均可种植；4.工艺简单，价格低廉。具体实施例方式以下将结合具体实施例对本发明有关细节做进一步的说明。实施例1取新鲜萝卜叶或块根1000公斤，洗净，切碎；在15。C,40001ux光照条件下，诱导7天；加入原料体积1.5倍的4'C预冷的5mM碳酸氢钠(NaHC(V)搅拌匀浆；所述匀浆过滤，保存滤渣，取滤液，在室温下，12000r/min离心，收集上清液I;滤渣加入1倍滤渣体积的4。C预冷的5mM碳酸氢钠搅拌勻浆；所述匀浆过滤，丢弃滤渣，取滤液，在室温下，12000r/min离心，收集上清液II;合并上述上清液I和上清液II，用200目二层尼龙布过滤，收集滤液；常温下，1400Qr/min离心，收集上清液III;上清液III经超过滤浓缩，排阻相对分子量10000和60000的蛋白质，截留相对分子量10000-60000的蛋白质，得浓缩液；取浓缩液，加入保护剂，喷雾干燥，进风温度190°C，出口温度83°C,获得喷雾干燥粉即为萝卜双功能酶I。萝卜双功能酶I的得率为15~20公斤酶干粉/吨原料，酶活力为12~15万单位/克。实施例2取实施例1所得浓缩液，加入4%(体积/体积)甘油，9%(质量/体积)葡萄糖，即得液体萝卜双功能酶II。萝卜双功能酶II的得率为180~22(^>斤/吨原^",酶活力为180~250万单位/克。实施例3取1所得萝卜双功能酶I，加入pH6.2，0.1MNa3P04緩冲液溶解，离心取上清液，上清液以壳聚糖制备脱氨再生几丁质凝胶为介质，进行亲和层析，收集含酶洗脱液，洗脱液经超滤浓缩，截留分子量在10000以上的蛋白质，加入6%(体积/体积)甘油，12%(质量/体积)葡萄糖，即得液体萝卜双功能酶in。液体萝卜双功能酶III的得率为45-55升/吨原^K酶活力为6.8~7.2万单位/毫升。实施例4取l所得萝卜双功能酶I,加入pH6.2，O.IM磷酸緩沖液溶解，离心取上清液，上清液经超滤浓缩，截留分子量在10000以上的蛋白质，加入3%(体积/体积)甘油，9%(质量/体积)葡萄糖，冷冻干燥即得干粉萝卜双功能酶III。干粉萝卜双功能酶III的得率为0.9~0.12%/吨原料，酶活力为2.5~3.0万单位/毫克蛋白质。实施例5分别取新鲜萝卜叶或块根100公斤，洗净；称取50公斤，切碎，在10。C,3000LUX光照条件下，诱导5天；和另50公斤原料一起，分别进行如下步骤加入原料体积1倍的4。C预冷的5mM磷酸緩冲液搅拌匀浆；所述匀浆过滤，保存滤渣，取滤液，在室温下，12000r/min离心，收集上清液I;滤渣加入1倍滤渣体积的4'C预冷的5mM磷酸緩冲液搅拌勻浆；所述匀浆过滤，丢弃滤渣，取滤液，在室温下，12000r/min离心，收集上清液II;合并上述上清液I和上清液II，用200目二层尼龙布过滤，收集滤液；常温下，14000r/min离心，收集上清液III;上清液III经超过滤浓缩，排阻相对分子量10000和60000的蛋白，截留相对分子量10000-50000的蛋白，得浓缩液；取浓缩液，加入4%(体积/体积)甘油，9%(质量/体积)葡萄糖，即得液体萝卜双功能酶II。分别取新鲜萝卜叶或块根500公斤，洗净；称取250公斤，切碎，在1(TC，4000LUX光照条件下，诱导7天；和另250公斤原料一起，分别进行如下步骤加入原料体积2倍的4'C预冷的5mM醋酸緩冲液搅拌匀浆；所述匀浆过滤，保存滤渣，取滤液，在室温下，12000r/min离心，收集上清液I;滤渣加入1倍滤渣体积的4'C预冷的5mM醋酸缓冲液搅拌勻浆；所述匀浆过滤，丢弃滤渣，取滤液，在室温下，12000r/min离心，收集上清液II;合并上述上清液I和上清液II，用200目二层尼龙布过滤，收集滤液；常温下，14000r/min离心，收集上清液III;上清液III经超过滤浓缩，排阻相对分子量10000和60000的蛋白，截留相对分子量10000-50000的蛋白，得浓缩液；取浓缩液，加入3%(体积/体积)甘油，6%(质量/体积)葡萄糖，即得液体萝卜双功能酶II。分别取新鲜萝卜叶或块根300公斤，洗净；称取150公斤，切碎，在20。C，5000LUX光照条件下，诱导10天；和另150公斤原料一起，分别进行如下步骤加入原料体积1.5倍的4'C预冷的5mM碳酸氢钠(NaHCO;)搅拌匀浆；所述匀浆过滤，保存滤渣，取滤液，在室温下，12000r/min离心，收集上清液I;滤漆加入1倍滤渣体积的4。C预冷的5mM碳酸氢钠搅拌匀浆；所述匀浆过滤，丟弃滤渣，取滤液，在室温下，12000r/min离心，收集上清液II;合并上述上清液I和上清液II,用200目二层尼龙布过滤，收集滤液；常温下，14000r/min离心，收集上清液III;上清液III经超过滤浓缩，排阻相对分子量10000和60000的蛋白，截留相对分子量10000-50000的蛋白，得浓缩液；取浓缩液，力口入6%(体积/体积)甘油，12%(质量/体积)葡萄糖，即得液体萝卜双功能酶II。检测上述所得萝卜双功能酶II的酶活力，比较诱导前后酶活的变化，得表1如下表l.诱导前后萝卜双功能酶II的酶活力变化<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>由表中数据可知，诱导前后，萝卜双功能酶n的酶活力提高了2~3倍。实施例6取6所得诱导后萝卜双功能酶II,室温下，保存1年，2年后，分别纟金测酶活力，比较不同保存时间，酶活力的变化，得表2如下表2.萝卜双功能酶II保存1年、2年后的酶活力变化<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>由表2可知，加入稳定剂和保护剂后，萝卜双功能酶n的酶活力，在室温下，2年内活力基本不变，为原有酶活力的97%以上。权利要求1.一种兼具几丁质酶活力和溶菌酶活力的萝卜双功能酶工业制备方法，其特征在于，先将原料洗净，切碎，用匀浆液搅拌匀浆，通过离心，过滤，超过滤等步骤获得萝卜双功能酶浓缩液，浓缩液分别加入保护剂、喷雾干燥后，制得干粉萝卜双功能酶，包含以下步骤(1)原料处理取新鲜萝卜叶或块根洗净；(2)匀浆提取取(1)所得原料，加入原料体积1～2倍的4℃预冷的匀浆液搅拌匀浆；(3)离心将(2)所述匀浆过滤，保存滤渣，取滤液，在室温下，12000r/min离心，收集上清液I；(4)过滤取上述上清液I，用200目二层尼龙布过滤，收集滤液；(5)再离心取(5)所得滤液，常温下，14000r/min离心，收集上清液III；(6)超过滤排阻相对分子量10000和60000的蛋白质，截留相对分子量10000～60000的蛋白质，得浓缩液；(7-1)萝卜双功能酶I取(7)所得浓缩液，加入保护剂，喷雾干燥，进风温度185℃～195℃，出口温度80℃～85℃，获得喷雾干燥粉即为萝卜双功能酶I。2.如权利要求1所述的兼具几丁质酶活力和溶菌酶活力的萝卜双功能酶工业制备方法，其特征在于，还包括如下任意步骤(1)萝卜双功能酶II:取(7-l)所得萝卜双功能酶I，加入稳定剂，即得液体萝卜双功能酶II;(2)液体萝卜双功能酶III:取(7-l)所得萝卜双功能酶I，加入pH6.2,0.1M磷酸钠緩冲液溶解后，亲和层析，收集含酶洗脱液，再经超滤浓缩，截留分子量10000以上的蛋白质，得浓缩液加入稳定剂，即得液体萝卜双功能酶ni;(3)固体粉末萝卜双功能酶III:取(7-l)所得萝卜双功能酶I,加入pH6.2，0.1M磷酸緩沖液溶解，常温下，14000r/min离心，收集上清液，超滤浓缩，截留分子量10000以上的蛋白质，得浓缩液加入稳定剂，冷冻干燥，所得干燥粉即为固体粉末萝卜双功能酶III。3.如权利要求1所述的兼具几丁质酶活力和溶菌酶活力的萝卜双功能酶工业制备方法，其特征在于，步骤(1)所得原料经如下诱导条件诱导后再匀浆原料切碎，在10。C2(TC,3000~50001ux光照条件下，诱导510天；4.如权利要求3所述的兼具几丁质酶活力和溶菌酶活力的萝卜双功能酶工业制备方法，其特征在于，所述诱导条件为14°C~18°C，3500~45001ux光照条件下，诱导68天。5.如权利要求3所述的兼具几丁质酶活力和溶菌酶活力的萝卜双功能酶工业制备方法，其特征在于，所述诱导条件为在15°C,40001ux光照条件下，诱导7天。6.如权利要求1所述的兼具几丁质酶活力和溶菌酶活力的萝卜双功能酶工业制备方法，其特征在于，取步骤(3)所得滤渣，加入滤渣体积1~2倍的4。C预冷的匀浆液搅拌匀浆，将匀浆过滤，丢弃滤渣，取滤液，在室温下，12000r/min离心，收集上清液II，上清液II与所述上清液I合并后，进行步骤(4)过滤；7.如权利要求1所述的兼具几丁质酶活力和溶菌酶活力的萝卜双功能酶工业制备方法，其特征在于，步骤(2)所述匀浆液选自但不限于5mM醋酸缓冲液，5mM磷酸緩冲液，5mM碳酸氬钠缓冲液。8.如权利要求1所述的兼具几丁质酶活力和溶菌酶活力的萝卜双功能酶工业制备方法，其特征在于，步骤(7-1)所述保护剂为质量/体积为5%的变性淀粉。9.如权利要求2所述的兼具几丁质酶活力和溶菌酶活力的萝卜双功能酶工业制备方法，其特征在于，所述稳定剂为体积/体积为3%~6%甘油，质量/体积为6%~12%葡萄糖。10.如权利要求2所述的兼具几丁质酶活力和溶菌酶活力的萝卜双功能酶工业制备方法，其特征在于，所述的亲和层析介质为脱氨再生几丁质凝胶。全文摘要兼具几丁质酶活力和溶菌酶活力的萝卜双功能酶工业制备方法，先将原料洗净，切碎，在低温下诱导产酶，用匀浆液搅拌匀浆，通过离心，过滤，超滤等步骤获得萝卜双功能酶浓缩液，浓缩液分别加入保护剂、稳定剂，制得液体萝卜双功能酶或干粉萝卜双功能酶。本发明的有益效果为1.采用低温光照诱导技术，使原料酶含量提高2～3倍；2.研制了特定的萝卜双功能酶活性稳定剂和保护剂，在室温下，萝卜双功能酶在2年内活力基本不变，为原有酶活力的97％以上；3.原料来源广、价格便宜，不受季节、气候等因素影响，一年四季均可种植；4.工艺简单，价格低廉。文档编号C12N9/00GK101434936SQ20081021986公开日2009年5月20日申请日期2008年12月10日优先权日2008年12月10日发明者宋秋兰申请人:宋秋兰