专利名称：一种鸡防御素-1基因真核表达质粒及其使用方法
技术领域：
本发明涉及一种动物医药生物工程领域，特别是一种鸡防御素-1基因 真核表达质粒及其使用方法。
背景技术：
防御素是动物机体先天性内源免疫防御系统产生的一类对抗外源性 病原微生物的阳离子肽类活性物质，是生物机体免疫防卫系统的一个重 要组成部分。除抗菌活性外，防御素还可中和LPS (脂多糖)、促进伤口 愈合，对单核细胞的趋化性，调理作用活性，免疫增强活性。
研究发现人防御素(HNP)能增强老鼠巨噬细胞的吞噬作用功能， 兔子防御素在肺泡巨噬细胞中作为具有调理素作用。兔子、豚鼠a-防 御素，与人HNP2 —样，可以诱导激活肥大细胞脱粒作用，导致组氨与 前列腺素(PGD2)的释放。人HNPl-3能刺激气管上皮细胞增加IL-8基 因的转录与产生，增加单核细胞产生TNF和IL-1，而降低IL-10的产生。 人、兔的a -防御素通过竞争促肾上腺皮质激素的受体结合，具有抑制 免疫抑制物糖皮质类固醇的产生能力。通过与固相或液相补体Clq的结 合，体外人a-防御素能提高或抑制经典补体途径的激活。Tettito等 1989年及Murphy等1993年的研究还证明人HNP-1-3具有对单核细胞 的细胞趋化性与对上皮细胞和培养的成纤维细胞促有丝分裂活性。Yang 等人1999年和2000年研究表明，人上皮防御素(hBD-1和hBD-2)通过与CCR6化学激动受体的结合对未成熟树状突细胞和记忆性T-细胞 具有趋化性；在毫摩尔浓度，hBD-1和hBD-2可以召集未成熟树状突细 胞和记忆性T-细胞到微生物侵入的皮肤或粘膜位点，因此在内源免疫与 获得性免疫反应中起重要作用。Chaly等2000年的研究还表明人中性 粒细胞a防御素通过影响细胞因子和粘附分子的表达来调节炎症反应。 Biragyn et al (2001)对鼠0-防御素多肽-2， 3的研究也发现它们可 以与鼠CCR6化学激动受体的结合，类似于炎症化学激动剂MIP3-d ，可 以化学吸引骨髓来源的未成熟细胞，但对成熟的树突状细胞无用。 Lillard等1999年在进行防御素诱导增强机体获得性免疫力机制研究 时发现，HNPs能显著增加血清中抗原特异性IgG与IgM的水平；增强抗 原特异性CD4+T细胞的增值与IFN-Y、 IL-5、 IL-6、 IL-10的分泌；体 外研究发现CD4+T提高CD3 e刺激的脾脏与Peyer' s结CD4+T细胞的增 值与T辅助细胞因子分泌；调节LPS或CD3 e刺激的脾脏与Peyer， s 结B或T细胞群共刺激分子的表达。Tani et al (2000)体外用人a -防御素刺激鼠脾脏细胞可以促进其增值和细胞因子的产生；体内喂给小 鼠可以提高IgGh IgG2a、 IgG2b抗体水平。
防御素还与内源防御的其他方面作用如急性炎症有关，包括初始 裂解细胞壁释放炎症刺激物，肥大细胞脱粒导致组胺释放及随后的血管 縮张；增加中性粒细胞和T-辅助性细胞的化学趋化作用，导致白细胞聚 集到感染位点；促进非特异性吞噬作用；通过组织纤维蛋白溶原酶激活 剂抑制纤维蛋白溶解作用，这样减少细菌的传播；通过促进成纤维细胞 的趋化和生长使组织、伤口的修复；通过抑制某些蛋白酶如Furin和组织蛋白酶抑制组织的损伤。假如急性炎症反应不足产生细菌的清除，那 么长期炎症和适应性免疫反应就启动。有些防御素就在这个过程起作 用作为单核细胞的趋化因子；通过趋化因子招集T细胞；增强化学趋 化作用产生和T-辅助细胞扩增反应，导致增加免疫球蛋白G，不是A的 产生；抑制细胞因子的产生与其它巨噬细胞对LPS， LTA和细菌CpGDNA 的反应；打开特异性吞噬细胞基因；剌激吞噬细胞凋亡和激活淋巴细胞， 产生潜在的驱除感染细胞。
这些研究都表明防御素能直接调控内源免疫防御体系对抗外源侵 病原微生物，在机体获得性免疫体系与先天性免疫体系中具有重要。椐 研究，鸡防御素-1就具有诱导机体增强特异性与非特异性免疫反应能力 性。
发明内容
本发明的发明目的在于提供一种具有防御素所特有的免疫 增强作用的、适合鸡使用的鸡防御素-l基因真核表达质粒及其使 用方法。
本发明的鸡防御素-1基因真核表达质粒是这样实现的，由 pcDNA3. 1 (+)真核表达载体、连接在pcDNA3. 1 (+)真核表达载体上的鸡防御 素-1基因片段，该鸡防御素-1基因真核表达质粒的获得方法依次包括1、 上游引物、下游引物的设置过程；2、鸡防御素-l基因片段的PCR获取过 程；3、鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3. 1 (+) -Gal-1的构建过程；4、 鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3. 1 (+)-Gal-1的制备过程； 1、上游引物、下游引物的设置过程引物的设计及合成是根据国内外已在GenBank中登录的鸡防御素-1基因序列经多重比较后设计，并在5，端 加入ATG启动子，根据真核表达载体pcDNA3. 1(+)上的酶切位点，上游引 物设计去掉了前导肽处开始，并加上历V^ III酶切位点；下游引物设计 在基因末端，并加上万a^ I酶切位点，所需要的引物序列为 上游引物5， -CGAAGCTT掘dGGGAAGGAAGTCAGATTG-3， 下游引物5， -TTGGATCCTCAGCCCCATATTCTTTTGC-3， 2、鸡防御素-l基因的PCR扩增过程以重组质粒pGEM-T-Gal-l为模板， 加入ExTaqDNA聚合酶、上游引物、下游引物、dNTPs进行扩增反应，PCR 的反应体系为5uL的10XPCR buffer ( 10 X PCR buffer包含有 0.5mmol/L MgC12， 50mmol/LKCl， 10mmol/L Tris HC1， 0.001%明 胶)，2uL的4XdNTPs (4XdNTPs包含有浓度均为2.5mmol/L的dATP, dTTP, dCTP， dGTP), 0. 5uL的上游引物(20umol/L)， 0. 5uL的下游 引物(20ymol/L)， luL的pGEM-T-Gal-1质粒，肌5uL的ddH20 (双 蒸水)，0.5uL的ExTaq DNA聚合酶(5umol/L)，反应过程是a、混合 物先在95。C处理3min; b、然后在94。C处理45s,再在55。C处理45s， 再在72。C处理lmin;反应过程b循环30次；然后在72。C处理10min， 重组质粒pGEM-T-Gal-l来源于华南农业大学动物科学学院家禽研究室所 克隆并保存的重组质粒pGEM-T-Gal-l;所获得的鸡防御素-1基因片段核 苷酸序列为
ATGGGMGGAAGTCAGATTGTTTTCGAAAGAGTGGCTTCTGTGCATTTCTGAAGTGCCCTTCC CTCACTCTCATCAGTGGGAAATGCTCAAGATTTTACCTCTGCTGCAAAAGAATATGGGGCTGAPCR产物在1. 5%琼脂糖凝胶电泳观察，见到约130bp的扩增条带， 表明已扩增到目标产物；
3、鸡防御素-l基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-l的构建过程将过 程2的鸡防御素-1基因片段的PCR产物用氛氯仿抽提纯化，加入乙醇获 得沉淀物，将沉淀物干燥后用TE (TE包含有10mmol/L Tris HC1， lmmol/LEDTA)溶解，TE溶解物用万』I、进行双酶切处理， 胶回收约130bp左右的条带；以同样的方法对pcDNA3. 1 (+)质粒进行双酶 切处理，胶回收5.4kb左右的DNA片断，分别取5uL双酶切后胶回收的 鸡防御素-1基因片段和3 ii L双酶切后胶回收的pcDNA3.1 (+)质粒，加入 1 ii L的10XT4 DNA连接Buffer (10XT4 DNA连接Buffer包含有 0.5mol/LTris'HC1, 0.1mol/LMgC12， 50mmol/LDTT， 5mmol/LATP, 0.25mg/mLBSA)， luLT4DNA连接酶，在16。C下连接处理18小时， 将连接产物转化DH5 ct感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB平板上37°C 培养18小时；pcDNA3. 1 (+)质粒为Invitrogen公司的产品
a、 鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3. l(+)-Gal-1的双酶切鉴定 在含有氨苄青霉素的LB平板上挑取单个的白色菌落，接种于3ml含氨 节青霉素的LB液体培养基中，37。C振摇培养18小时，抽提质粒DNA 进行双酶切鉴定；将鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3. 1(+)-Gal-1 分别用iSa/zHI、历V^ni进行双酶切，酶切产物在1. 5%琼脂糖凝胶电泳 观察，pcDNA3. 1 (+)-Gal-1双酶切后产生约5. 4kb和130bp左右的两条带， 证明已经成功构建了鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3. 1(+)-Gal-l; b、 鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3. 1 (+)-Gal-1的PCR鉴定在含有氨苄青霉素的LB平板上挑取单个白色菌落，接种于3ml含氨苄青 霉素的LB液体培养基中，37。C振摇培养18小时，抽提质粒DNA进行 PCR鉴定;以质粒pcDNA3. 1 (+)-Gal-l为模板，加入ExTaq DNA聚合酶、 上下游引物、dNTPs进行扩增反应，PCR的反应体系为10XPCRBuffer5 iiL， 4XdNTPs (2.5mmol/L) 2uL，上、下游引物(20pmol/L)各0.5 U L， pGEM-T-gal-1质粒1 u L, ddH20 40. 5 u L, ExTaq DNA聚合酶(5umol/L) 0.5uL;反应过程为a、 95。C处理3min; b、然后94°C 45s、 55°C 45s、 72°C lmin;反应过程b循环30次，然后72t:延伸10min， PCR产物在 1.5%琼脂糖凝胶电泳观察，可见约130bp的扩增条带，证明已经成功构建 了鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3. 1 (+)-Gal-l; 4、鸡防御素-l基因真核表达质粒pcDNA3. l(+)-Gal-1的制备过程从过 程3的LB固体培养平板中挑取单个白色菌落，接种于盛有10ml液体培 养基的三角瓶中，37。C震荡过夜培养以获得菌种，然后在500ml的三角瓶 中加入100ml的发酵培养基，接入2ml的菌种，在37°C，以200rpm/min 速度摇晃，培养18h，然后用常规提取质粒的碱裂解方法对500ml三角瓶 中的培养物进行质粒的大量抽提，用硅藻土吸附法进行纯化即可获得鸡防 御素-1基因真核表达质粒pcDNA3. 1 (+)-Gal-l。
本发明的鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3. 1(+)-Gal-l的使用 方法是这样实现的，将鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3. 1(+)-Gal-l 用PBS缓冲液稀释到lmg/ml，就成为鸡防御素-1基因分子佐剂 pcDNA3. 1(+)-Gal-1 。然后将该鸡防御素-1基因分子佐剂 pcDNA3. 1 (+)-Gal-1与DNA疫苗混合就成为可进行肌肉注射的鸡防疫用疫本发明与已有技术相比，由于是选用了鸡防御素-1基因片段与真核 表达载体连接来作为免疫增强剂，因此，具有鸡防御素-1所特有的免疫
增强效果的、适合与鸡DNA疫苗一起使用的优点。
具体实施例方式
现结合实施例对本发明作进一步详细描述
本发明的鸡防御素-1基因真核表达质粒是这样实现的，由
pcDNA3. 1(+)真核表达载体、连接在pcDNA3. 1(+)真核表达载体上的鸡防御 素-1基因片段，该鸡防御素-1基因真核表达质粒的获得方法依次包括1、 上游引物、下游引物的设置过程；2、鸡防御素-1基因片段的PCR获取过 程；3、鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3. 1 (+)-Gal-1的构建过程；4、 鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3. l(+)-Gal-1的制备过程；
1、 上游引物、下游引物的设置过程引物的设计及合成是根据国内外已 在GenBank中登录的鸡防御素-1基因序列经多重比较后设计，并在5，端 加入ATG启动子，根据真核表达载体pcDNA3. 1(+)上的酶切位点，上游引 物设计去掉了前导肽处开始，并加上历V^ III酶切位点；下游引物设计 在基因末端，并加上5』I酶切位点，所需要的引物序列为 上游引物5， -CGAAGCTLU4C6ATGGGAAGGAAGTCAGATTG-3， 下游引物5， -TTGGATCCTCAGCCCCATATTCTTTTGC-3，
2、 鸡防御素-l基因的PCR扩增过程以重组质粒pGEM-T-Gal-1为模板， 加入ExTaqDNA聚合酶、上游引物、下游引物、dNTPs进行扩增反应，PCR 的反应体系为5uL的10XPCR buffer (10 X PCR buffer包含有0.5mmol/L MgC12， 50mmol/L KC1， 10mmol/L Tris HC1， 0.001%明
胶)，2uL的4XdNTPs (4XdNTPs包含有浓度均为2.5mmol/L的dATP， dTTP， dCTP， dGTP)， 0.5uL的上游引物(20ymol/L)， 0. 5uL的下游 引物(20umol/L)， luL的pGEM-T-Gal-1质粒，40,5"的ddH20 (双 蒸水)，0.5uL的ExTaq DNA聚合酶(5umol/L)，反应过程是a、混合 物先在95"C处理3min; b、然后在94。C处理45s，再在55。C处理45s， 再在72。C处理lmin;反应过程b循环30次；然后在72。C处理10min， 重组质粒pGEM-T-Gal-l来源于华南农业大学动物科学学院家禽研究室所 克隆并保存的重组质粒pGEM-T-Gal-l;所获得的鸡防御素-1基因片段核 苷酸序列为
ATGGGAAGGAAGTCAGATTGTTTTCGAAAGAGTGGCTTCTGTGCATTTCTGAAGTGCCCTTCC CTCACTCTCATCAGTGGGAAATGCTCAAGATTTTACCTCTGCTGCAAMGAATATGGGGCTGA
PCR产物在1. 5%琼脂糖凝胶电泳观察，见到约130bp的扩增条带， 表明已扩增到目标产物；
3、鸡防御素-l基因真核表达质粒pcDNA3. 1(+)-Gal-l的构建过程将过 程2的鸡防御素-1基因片段的PCR产物用氛氯仿抽提纯化，加入乙醇获 得沉淀物，将沉淀物干燥后用TE (TE包含有10mmol/L Tris HC1， lmmol/LEDTA)溶解，TE溶解物用fe/dil、进行双酶切处理， 胶回收约130bp左右的条带；以同样的方法对pcDNA3， 1 (+)质粒进行双酶 切处理，胶回收5. 4kb左右的DNA片断，分别取5uL双酶切后胶回收的 鸡防御素-1基因片段和L双酶切后胶回收的pcDNA3. 1(+)质粒，加入1 u L的10XT4 DNA连接Buffer (10XT4 DNA连接Buffer包含有 0.5mol/LTris'HCl， 0.1mol/LMgC12， 50mmol/L DTT， 5mmol/L ATP， 0.25mg/mLBSA)， luLT4DNA连接酶，在16。C下连接处理18小时， 将连接产物转化DH5 a感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB平板上37°C 培养18小时；pcDNA3.1 (+)质粒为Invitrogen公司的产品
a、 鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3. 1(+)-Gal-l的双酶切鉴定 在含有氨苄青霉素的LB平板上挑取单个的白色菌落，接种于3ml含氨 苄青霉素的LB液体培养基中，37r振摇培养18小时，抽提质粒DNA 进行双酶切鉴定；将鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3. 1 (+) -Gal-l 分别用泡WI、历/^III进行双酶切，酶切产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳 观察，pcDNA3. 1(+)-Gal-1双酶切后产生约5. 4kb和130bp左右的两条带， 证明已经成功构建了鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3. 1(+)-Gal-l;
b、 鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3. 1 (+)-Gal-l的PCR鉴定 在含有氨苄青霉素的LB平板上挑取单个白色菌落，接种于3ml含氨苄青 霉素的LB液体培养基中，37t振摇培养18小时，抽提质粒DNA进行 PCR鉴定；以质粒pcDNA3. 1 (+)-Gal-1为模板，加入ExTaq DNA聚合酶、 上下游引物、dNTPs进行扩增反应，PCR的反应体系为10XPCRBuffer5 UL， 4XdNTPs (2.5咖ol/L) 2uL，上、下游引物(20umol/L)各0.5 P L， pGEM-T-gal-l质粒1 u L， ddH20 40. 5 u L， ExTaq隠聚合酶(5umol/L) 0.5uL;反应过程为a、 95。C处理3min; b、然后94°C 45s、 55°C 45s、 72°C lmin;反应过程b循环30次，然后72。C延伸10min， PCR产物在 1.5%琼脂糖凝胶电泳观察，可见约130bp的扩增条带，证明己经成功构建了鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3. 1 (+)-Gal-l; 4、鸡防御素-l基因真核表达质粒pcDNA3. 1(+)-Gal-l的制备过程从过 程3的LB固体培养平板中挑取单个白色菌落，接种于盛有10ml液体培 养基的三角瓶中，37。C震荡过夜培养以获得菌种，然后在500ml的三角瓶 中加入100ml的发酵培养基，接入2ml的菌种，在37°C，以200rpm/min 速度摇晃，培养18h，然后用常规提取质粒的碱裂解方法对500ml三角瓶 中的培养物进行质粒的大量抽提，用硅藻土吸附法进行纯化即可获得鸡防 御素-1基因真核表达质粒pcDNA3. 1 (+)-Gal-l。
使用的限制性内切酶S"wHI、历^/in、 T4DNA连接酶、ExTaq DNA聚合酶等均购自广州宝泰克生物科技有限公司。
本发明的鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3. 1(+)-Gal-l的使用 方法是这样实现的，将鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3. 1(+)-Gal-l 用PBS缓冲液稀释到lmg/ml，就成为鸡防御素-1基因分子佐剂 pcDNA3. 1(+)-Gal-1 。然后将该鸡防御素-1基因分子佐剂 pcDNA3. 1 (+)-Gal-l与DNA疫苗混合就成为可进行肌肉注射的鸡防疫用疫 苗。
用该分子佐剂pcDNA3.1(+)-Gal-l与鸡法氏囊病DNA疫苗(IBD VP2DNA疫苗)联合应用，免疫IBDVP2血清抗体阴性鸡只，通过 检测血清IBDVP2特异性抗体值、CD3+、 CD4+、 CD8+百分含量 来检测其对鸡法氏囊病DNA疫苗(IBD VP2 DNA疫苗)的免疫增强 作用。60只14日龄的健康小鸡，随机分成3组，每组20只，免疫 两次，第一次免疫后15天进行二免。第一组为PBS组(免疫剂量为0.2ml)，第二组为IBDVP2DNA疫苗组(免疫剂量为150 y g)，第 三组为IBD VP2 DNA疫苗组(免疫剂量为150ug) + pcDNA3.1(+)-Gal-l (免疫剂量为150u g)。分别于免疫后7、 14、 21、 28、 35d随机取5只鸡颈静脉采血，分离血清，采用间接ELISA法检 测血清中VP2特异性抗体效价。同时采抗凝血分离淋巴细胞，用流式 细胞仪进行淋巴细胞亚类CD3+、 CD4+、 CD8+百分含量的测定。测 定结果发现，从免疫后第7天开始，IBDVP2特异性抗体值、CD3+、 CD4+、 CD8+百分含量在第二组和第三组随时间增加而增加，在21 天达到最高值，然后开始下降至最低值，慢慢又恢复上升。但是加入 pcDNA3.1(+)-Gal-l佐剂组即第三组鸡血清特异性VP2抗体值、 CD3+、 CD4+、 CD8+百分含量就一直高于IBD VP2 DNA疫苗即第二组 单独注射组，免疫后21天出现显著性差异(P0.05)。实验结果表明分 子佐剂pcDNA3.1(+)-Gal-l对IBD VP2 DNA疫苗具有很好的免疫增 强作用。
权利要求
1、一种鸡防御素-1基因真核表达质粒，其特征在于由pcDNA3.1(+)真核表达载体、连接在pcDNA3.1(+)真核表达载体上的鸡防御素-1基因片段构成，该鸡防御素-1基因真核表达质粒的获得方法依次包括1、上游引物、下游引物的设置过程；2、鸡防御素-1基因片段的PCR获取过程；3、鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1的构建过程；4、鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1的制备过程；(1)、上游引物、下游引物的设置过程引物的设计及合成是根据国内外已在GenBank中登录的鸡防御素-1基因序列经多重比较后设计，并在5’端加入ATG启动子，根据真核表达载体pcDNA3.1(+)上的酶切位点，上游引物设计去掉了前导肽处开始，并加上Hind III酶切位点；下游引物设计在基因末端，并加上BamH I酶切位点，所需要的引物序列为上游引物5’-CGAAGCTTAAACCATGGGAAGGAAGTCAGATTG-3’下游引物5’-TTGGATCCTCAGCCCCATATTCTTTTGC-3’(2)、鸡防御素-1基因片段的PCR扩增过程以重组质粒pGEM-T-Gal-1为模板，加入ExTaq DNA聚合酶、上游引物、下游引物、dNTPs进行扩增反应，PCR的反应体系为5μL的10×PCR buffer，2μL的4×dNTPs，0.5μL的浓度为20μmol/L的上游引物，0.5μL的浓度为20μmol/L的下游引物，1μL的pGEM-T-Gal-1质粒，40.5μL的ddH2O，0.5μL的浓度为5μmol/L的ExTaq DNA聚合酶，反应过程是a、混合物先在95℃处理3min；b、然后在94℃处理45s，再在55℃处理45s，再在72℃处理1min；反应过程b循环30次；然后在72℃处理10min，重组质粒pGEM-T-Gal-1来源于华南农业大学动物科学学院家禽研究室所克隆并保存的重组质粒pGEM-T-Gal-1；所获得的鸡防御素-1基因片段核苷酸序列为ATGGGAAGGAAGTCAGATTGTTTTCGAAAGAGTGGCTTCTGTGCATTTCTGAAGTGCCCTTCCCTCACTCTCATCAGTGGGAAATGCTCAAGATTTTACCTCTGCTGCAAAAGAATATGGGGCTGA；PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳观察，见到约130bp的扩增条带，表明已扩增到目标产物；(3)、鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1的构建过程将过程2的鸡防御素-1基因片段的PCR扩增产物用氛氯仿抽提纯化，加入乙醇获得沉淀物，将沉淀物干燥后用TE溶解，TE溶解物用BamH I、HindIII进行双酶切处理，胶回收约130bp左右的条带；以同样的方法对pcDNA3.1(+)质粒进行双酶切处理，胶回收5.4kb左右的DNA片断，分别取5μL双酶切后胶回收的鸡防御素-1基因片段和3μL双酶切后胶回收的pcDNA3.1(+)质粒，加入1μL的10×T4 DNA连接Buffer，1μL T4DNA连接酶，在16℃下连接处理18小时，将连接产物转化DH5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB平板上37℃培养18小时；pcDNA3.1(+)质粒为Invitrogen公司的产品a、鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1的双酶切鉴定在含有氨苄青霉素的LB平板上挑取单个的白色菌落，接种于3ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振摇培养18小时，抽提质粒DNA进行双酶切鉴定；将鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1分别用BamH I、Hind III进行双酶切，酶切产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳观察，pcDNA3.1(+)-Gal-1双酶切后产生约5.4kb和130bp左右的两条带，证明已经成功构建了鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1；b、鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1的PCR鉴定在含有氨苄青霉素的LB平板上挑取单个白色菌落，接种于3ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振摇培养18小时，抽提质粒DNA进行PCR鉴定；以质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1为模板，加入ExTaq DNA聚合酶、上下游引物、dNTPs进行扩增反应，PCR的反应体系为5μL的10×PCRBuffer，2μL的4×dNTPs，浓度均为20μmol/L的上、下游引物各0.5μL，pGEM-T-gal-1质粒1μL，ddH2O 40.5μL，浓度为5μmol/L的ExTaqDNA聚合酶0.5μL；反应过程为a、95℃处理3min；b、然后94℃45s、55℃45s、72℃1min；反应过程b循环30次，然后72℃延伸10min，PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳观察，可见约130bp的扩增条带，证明已经成功构建了鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1；(4)、鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1的制备过程从过程3的LB固体培养平板中挑取单个白色菌落，接种于盛有10ml液体培养基的三角瓶中，37℃震荡过夜培养以获得菌种，然后在500ml的三角瓶中加入100ml的发酵培养基，接入2ml的菌种，在37℃，以200rpm/min速度摇晃，培养18h，然后用常规提取质粒的碱裂解方法对500ml三角瓶中的培养物进行质粒的大量抽提，用硅藻土吸附法进行纯化即可获得鸡防御素-1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1。
2、 一种鸡防御素-1基因真核表达质粒的使用方法，其特征在于将鸡 防御素-1基因真核表达质粒用PBS缓冲液稀释到lmg/ml，就成为鸡防御 素-l基因分子佐剂pcDNA3.1 (+)-Gal-l。
3、 根据权利要求2所述的鸡防御素-1基因真核表达质粒的使用方法， 其特征在于将鸡防御素-1基因分子佐剂pcDNA3.1 (+) -Gal-l与DNA疫苗混 合就成为可进行肌肉注射的鸡防疫用疫苗。
全文摘要
一种鸡防御素-1基因真核表达质粒及其使用方法，其特征在于由pcDNA3.1(+)真核表达载体、连接在pcDNA3.1(+)真核表达载体上的鸡防御素-1基因片段构成，将鸡防御素-1基因真核表达质粒用PBS缓冲液稀释到1mg/ml，就成为鸡防御素-1基因分子佐剂pcDNA3.1(+)-Gal-1。本发明与已有技术相比，具有鸡防御素-1所特有的免疫增强效果的、适合与鸡DNA疫苗一起使用的优点。
文档编号C12N15/79GK101629182SQ20081021977
公开日2010年1月20日 申请日期2008年12月8日 优先权日2008年12月8日
发明者张辉华, 曹永长, 杨小梅, 毕英佐, 谢青梅, 马保华, 马静云 申请人:佛山科学技术学院