专利名称：：一种生物防腐剂4-羟基苯乳酸的制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种生物防腐剂4-羟基苯乳酸的制备方法，具体涉及微生物发酵生物转化制备4-羟基苯乳酸的一种方法，属于食品生物
技术领域：
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背景技术：
：4-羟基苯乳酸是乳酸菌产生的一种新型抑菌物质。研究表明4-羟基苯乳酸具有广谱抑制真菌功能。4-羟基苯乳酸是一种天然防腐剂。它存在于天然蜂蜜中，对人和动物细胞无毒。乳酸菌是公认为安全(Generallyrecognizedassafety,GRAS)的微生物，千百年来用于食品保藏。因此，4-羟基苯乳酸被认为是继乳酸菌产生的第一代抑菌物质如乳酸、醋酸，第二代抑菌物质如Nisin(乳酸链球菌素)等细菌素以外，可用于备且/f太玄的实f;开iJ加苗物活t;M;。；士日l-k丄辛2宜禁每l鹏im苗;雄齒禾争^十生宮亲水性强。目前4-羟基苯乳酸的制备有化学催化合成以及生物转化方法。化学合成法有许多不利的因素，例如反应条件苛刻，产生多种副产物和化学污染物，形成的众多副产物又使分离、纯化步骤变得复杂。近年来研究人员都在寻找生物转化的方法来制备4-羟基苯乳酸，生物转化方法，条件温和，污染少，反应专一性强。由于乳酸菌是GRAS(公认为安全)的微生物，用安全菌株生物转化生产4-羟基苯乳酸成为当前的热点。最近报道某些乳酸菌能够利用MRS培养基发酵生成4-羟基苯乳酸，但产量低、菌种个体差异大，最高产量为0.29mmol/L。针对4-羟基苯乳酸发酵产量低下的问题，本专利研究利用4-羟基苯丙酮酸或4-羟基苯丙酮酸盐作为底物添加至发酵培养基中，可以大幅度提高4-羟基苯乳酸的产量。
发明内容本发明的目的是提供一种生物防腐剂4-羟基苯乳酸的制备方法，具体内容涉及利用乳酸菌发酵生物转化制备4-羟基苯乳酸的一种方法。本发明中乳酸菌可有效利用底物4-羟基苯丙酮酸或4-羟基苯丙酮酸盐，发酵转化生成4-羟基苯乳酸，转化率高、专一性强、条件温和、副产物少，为4-羟基苯乳酸的生物转化提供了一个新的途径。本发明的技术方案以乳酸菌作为菌种，以4-羟基苯丙酮酸或4-羟基苯丙酮酸盐为转化底物，采用碳源、氮源以及无机盐组成发酵培养基，发酵法生物转化制备4-羟基苯乳酸。(1〉菌禾中采用孚L酸菌，￡flcto/>"c/〃ussp.SK007、la"c^ac〖〃Ms/^cmfanwAS1,550、丄acfo6(3c/〃ws//<3wto!rwwSK002、丄oc/o6ac/〃i/spewZtweBCRC15317或Z^rctococcM/"W《1.009。用乳酸菌作为菌种生物转化时，选用/^^6"^//^'sp.SK007效果尤好。(2)培养基，以g/L计-,保藏培养基葡萄糖15，酵母膏10，碳酸钙15，琼脂15，pH6.5-7.0;种子培养基葡萄糖10，蛋白胨10，酵母膏10，无水乙酸钠10，磷酸钾0.2，硫酸镁0.2,硫酸锰0,05，pH6.5-7.0;(3)制备工艺菌种保藏所用菌种保藏在保藏培养基中，4。C保存，两周转接一次。种子培养从保藏培养基转入种子培养基需活化2次，每次3(TC培养12h。发酵种子培养液以1%-3%(V/V)的接种量，接入添加不同碳源、氮源以及无机盐组成的发酵培养基中，发酵培养基组成为4-羟基苯丙酮酸或4-羟基苯丙酮酸盐4-40mmol/L，碳源5-30g/L，氮源5-30g/L，无水乙酸钠10g/L，磷酸钾0.2g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L，pH6.2-6.8，25-40。C静置培养,12-36h，得到含4-羟基苯乳酸的发酵液，所用碳源为葡萄糖、麦芽糖、乳糖或蔗糖，所用氮源为玉米浆、酵母膏、蛋白胨、大豆粕中的一种或几种混用。优选的发酵培养基为4-羟基苯丙酮酸或4-羟基苯丙酮酸盐4rmnol/L，葡萄糖20g/L，玉米浆10g/L，酵母膏10g/L，无水乙酸钠10g/L，磷酸钾0.2g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L，pH6.2-6.4。检测4-羟基苯乳酸的方法如下取发酵液离心，上清液经微孔滤膜过滤〔0.22pm)，滤液上HPLC分析。HPLC条件AgilenU100;色谱柱ZORBAX300SBC！8(54.6mmx250mm)，流动相为0.05。/。的三氟乙酸/甲醇(A)和0.05。/。的三氟乙酸/水(B)的混合液，梯度洗脱程序为020min由10%A线性变化至IOO%，2023mm保持100。/。A，23~25min由100。/。A线性变化至10。/。。流速lmL/min，检测波长210nm，柱温3(TC，进样体积10pL。本发明的有益效果本发明提供了一种利用4-羟基苯丙酮酸或4-羟基苯丙酮酸盐为底物，乳酸菌发酵生物转化制备4-羟基苯乳酸的方法，12h4-羟基苯乳酸的产量可达到1.0-20.0mmol/L。具体实施例方式实施例l不同菌种对4-羟基苯乳酸产量的影响在发酵培养基中添加4mmol/L的4-羟基苯丙酮酸，按说明书上述的优选的培养基对初选的一些乳酸菌进行发酵实验，发酵I2h后对发酵液迸行检测，结4果如表1所示，各种乳酸菌都能转化4-羟基苯丙酮酸生成4-羟基苯乳酸，其中丄actoZ^"7/wsp.SK007的4-羟基苯乳酸发酵产量较高，不同菌种对4-羟基苯乳酸的生成有较为显著的区别。_表l不同菌种对产4-羟基苯乳酸的影响_菌种4-羟基苯乳酸产量(mmol/L)丄(3cto6a"7/wssp.SK0072.85丄acto^2"7/ws//"wtonm2SK0020.91丄a"o6ac/〃ws//awtorwm1.13AS1.550丄ac^coccMs/acfz'51.0091.67丄acto6a"7/uspe"toseBCRC153171.32实施例2发酵时间对产4-羟基苯乳酸的影响按说明书所述的发酵条件，添加4mmol/L的4-羟基苯丙酮酸，通过丄acto6ac///^sp.SK007在不同发酵时间产4-羟基苯乳酸的检测，发现发酵18h时4-羟基苯乳酸的含量最高，随着发酵时间延长，4-羟基苯乳酸的含量稍有下降。所以确定发酵时间为18h，发酵时间对产4-羟基苯乳酸的影响如表2所示。_表2发酵时间对产4-羟基苯乳酸的影响__时间(h)_612182420364-羟基苯乳酸(mmol/L)1.121.962.852.762.482.41实施例3不同底物对产4-羟基苯乳酸的影响按说明书所述的发酵条件，分别添加4mmol/L的不同底物4-羟基苯丙酮酸或4-羟基苯丙酮酸钠，通过对kcto^c/〃wsp.SK007在发酵18h后产4-羟基苯丙酮酸的检测，4-羟基苯丙酮酸与4-羟基苯丙酮酸钠为底物的4-羟基苯乳酸发酵产量相接近，证明以4-羟基苯丙酮酸与4-羟基苯丙酮酸钠均为4-羟基苯乳酸的发酵制备的有效底物。<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>权利要求1.一种4-羟基苯乳酸的制备方法，其特征是以乳酸菌为菌种，以4-羟基苯丙酮酸或4-羟基苯丙酮酸盐为转化底物，采用碳源、氮源及无机盐组成发酵培养基，发酵法生物转化制备苯乳酸；(1)菌种乳酸菌；(2)培养基，以g/L计保藏培养基葡萄糖15，酵母膏10，碳酸钙15，琼脂15，pH6.5-7.0；种子培养基葡萄糖10，蛋白胨10，酵母膏10，无水乙酸钠10，磷酸钾0.2，硫酸镁0.2，硫酸锰0.05，pH6.5-7.0；发酵培养基4-羟基苯丙酮酸或4-羟基苯丙酮酸盐4-40mmol/L，碳源5-30，氮源5-30，无水乙酸钠10，磷酸钾0.2，硫酸镁0.2，硫酸锰0.05，pH6.2-6.8；(3)制备工艺菌种保藏所用菌种保藏在保藏培养基中，4℃保存，两周转接一次；种子培养从保藏培养基转入种子培养基需活化2次，每次30℃培养12h；发酵种子培养液以体积比1％-3％的接种量，接入发酵培养基中，25-40℃静置培养12-36h，得到含4-羟基苯乳酸的发酵液，所用碳源为葡萄糖、麦芽糖、乳糖或蔗糖，所用氮源为玉米浆、酵母膏、蛋白胨、大豆粕中的一种或几种混用。2.根据权利要求l所述的4-羟基苯乳酸的制备方法，其特征是发酵培养基为4-羟基苯丙酮酸或4-羟基苯丙酮酸盐4mmol/L，葡萄糖20g/L，玉米浆10g/L，酵母膏10g/L，无水乙酸钠10g/L，磷酸钾0.2g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L，pH6.2-6.4。3.根据权利要求l所述的4-羟基苯乳酸的制备方法，其特征是菌种选用丄a"o^(3"7/W:S1sp.SK007、丄acfoZ)a"'〃wsp/awfarwmAS1.550、丄acfo6ac/〃wsp/awZarw附SK002、1^(^06￡3(^7/2^pe"o^eBCRC15317或jLac/ococcws/acf/s1.009。全文摘要一种生物防腐剂4-羟基苯乳酸的制备方法，涉及微生物发酵生物转化制备4-羟基苯乳酸的一种方法，属于食品生物
技术领域：
。本发明用乳酸菌作为菌种，以4-羟基苯丙酮酸或4-羟基苯丙酮酸盐为转化底物，添加碳源、氮源及无机盐组成发酵培养基，发酵生物转化制备4-羟基苯乳酸。所用乳酸菌在MRS培养基中，25-40℃培养，生长良好，作为种子培养液，发酵培养基碳源为葡萄糖、麦芽糖、乳糖或蔗糖，氮源选用玉米浆、酵母膏、蛋白胨、大豆粕中的一种或几种混合使用，发酵后经检测，在发酵液中4-羟基苯乳酸浓度为1.0-20.0mmol/L。本发明所得产品安全可靠，具有很强的抑菌功能。文档编号C12P7/40GK101440382SQ20081024405公开日2009年5月27日申请日期2008年12月19日优先权日2008年12月19日发明者波江,沐万孟申请人:江南大学