专利名称：一种表达中温α-淀粉酶的基因工程菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种表达中温a -淀粉酶的基因工程菌株。
背景技术：
中温a-淀粉酶是一种内切酶，即能水解淀粉、可溶性糊精及低聚糖中的a—l， 4 葡萄糖苷键的a-淀粉酶，其一般反应温度为50-70摄氏度，因此称为中温a-淀粉酶。
随着酿造和发酵工业的发展.a-淀粉酶广泛应用于酱油、酱类、食醋、酒类、味 精及糖色等工业生产，代替传统的制曲。应用酶制剂与制曲相比，既省工省厂房设备， 又能提高出品率，降低成本，增加效益。枯草杆菌cx-淀粉酶是我国产量最大用途最广 的一种高效液化型淀粉酶，它是由耐热性能高的枯草杆菌诱变后逐级扩大培养再经提 纯而获得的一种浅灰褐色粉来状有臭味的酶制剂，主要作用是能将原料中的淀粉质液 化为糊精。
我国目前生产的a-淀粉酶所用菌种均是BF7658的变异种，如BF7658-209、 8a5、 86315、 K211。目前国内工业用a-淀粉酶，是将发酵液加入硫酸铵，使淀粉酶连同菌丝 体等一起析出，经过滤、干燥和粉碎即得工业用a-淀粉酶酶粉。也有将发酵液加稳定 剂，直接喷雾干燥制成工业酶粉[谷军生物技术4 (3) : 1-5.1994]。
我国对cx-淀粉酶菌种的选育、研究和生产做了大量的工作，1957年陈琦等报导了 产生淀粉酶能力强的枯草杆菌Sn和S56 [陈琦等:微生物学报5 (3): 256-261. 1957]， 1965年我国开始应用解淀粉芽孢杆菌BF7658生产a-淀粉酶，以前曾误称为枯草芽孢 杆菌BF7658 ot-淀粉酶，王桂芬证明了原称为枯草芽孢杆菌G^^7^As 6^力""s)BF7658产生的a-淀粉酶与解淀粉芽孢杆菌的液化型a-淀粉酶完全一样[王 桂芬微生物通报29 (2) : 124-126. 1989]。 70年代，无锡酶制剂厂与中科院遗传 所等单位合作，以枯草杆菌06-11为出发株经热处理、UV照射，亚硝基胍处理和Co60、 Y射线、诱变育种得苗株209。在10吨及20吨罐扩试中，发酵单位提高一倍，产品稳 定在300U/ml，最高可达400U/ml。高定华等利用x射线、Y射线及激光等物理因素诱 变，获得BF7658的变异株K2n，酶活力由原来的260U/ml提高到500-600U/ml， 20升 发酵罐酶活力达420U/ml[高定华食品与发酵工业(6) . 1986]。邬显章等从BF7658 变异株209出发，经硫酸二乙酯和5-氟尿嘧啶、亚硝基胍等诱变选育出796变异株， 在麦芽糖培养基中可获得较高的a-淀粉酶活性，达477U/ml[邬显章生物工程学报4(2) . 115-126. 1985]。
通过对a-淀粉酶菌种进行传统的物理化学诱变已经取得了很大的成就，但是若想 再进一步提高其产淀粉酶水平就变得非常困难。伴随着分子生物学理论和基因改造技 术的飞速发展，使对菌株进行基因方面的改造成为可能。但是国内对枯草芽孢杆菌 (Bacillus Subtilis)BF7658的改造主要还是停留在技术水平上，有人将带有淀粉酶 基因的克隆片段，在枯草杆菌中表达[蔡恒等食品与发酵工业31(10): 33-35. 2005]， 或者将枯草杆菌a-淀粉酶基因在大肠杆菌中的表达。而对BF7658直接进行基因改造， 使其淀粉酶产酶效率提升则没有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种表达中温a -淀粉酶的基因工程菌株。 本发明所提供的表达中温a-淀粉酶的工程菌，是将表达中温a-淀粉酶基因的重
组载体导入枯草芽孢杆菌(&"7/^^to'to)中，筛选得到的中温a-淀粉酶表达量提
高的工程菌株；所述中温a -淀粉酶基因具有具有GENBANK ACCESSION Number为
AM409180的5'端第7-1551位核苷酸序列。
所述枯草芽孢杆菌(Sac/〃M^to'fc)为枯草芽孢杆菌(5ac7'〃www^7W 264
CICC10264。
所述表达中温a-淀粉酶的工程菌为枯草芽孢杆菌(Bac说M^Mfo) ZHWY CGMCCNo.2829。
所述枯草芽孢杆菌(Sac///^ to7&) ZHWY CGMCC No. 2829，已于2008年12月 25日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为 中国北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCC No.2829。
本发明所提供的一种表达中温a -淀粉酶的方法，是发酵权利要求1-3中任意一 项所述的表达中温a -淀粉酶的工程菌，得到中温a -淀粉酶。
所述发酵用培养基为含75-86 g/L的玉米粉，35-45 g/L的豆饼粉，1-3g/L的氯 化钙，6. 5-8. 5 g/L的磷酸氢二钠，3. 5-5. 5 g/L的硫酸铵的液体培养基。
所述发酵的温度为36.0-38.5。C，优选为37'C。
本发明利用基因工程技术构建带有中温淀粉基因的整合载体，经转化后得到增加 了一个中温淀粉基因拷贝工程菌，即本发明的表达中温a-淀粉酶的工程菌。本发明 的表达中温a -淀粉酶的工程菌特别是枯草芽孢杆菌CSacz7/iw w^/fc) ZHWY CGMCC No. 2829具有比目前国内生产菌株更高的中温a -淀粉酶产酶能力，具有独特的鉴定标签，是一株极具生产应用价值的中温a-淀粉酶的枯草芽孢杆菌生产菌株。本发明的工
程菌，发酵表达量高，相同条件下发酵，较野生菌酶活提高了 83%。
图1为pAXOI-amyl的结构示意图。
具体实施例方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、表达中温a-淀粉酶的携带LacA整合臂穿梭载体pAXOI-amyl的构建 以枯草芽孢杆菌(^^7/^^^7/力264 (购自中国工业微生物菌种保藏中心，保藏 号为CICC10264，是一株目前广泛应用于工业生产中温a-淀粉酶的枯草芽孢杆菌)的 总DNA为模板进行PCR扩增中温a-淀粉酶的基因(amyl)(具有GENBANK ACCESSION Number为AM409180的5'端第7—1551位核苷酸序列)。扩增引物为上游引物5' cgggatccATGATTCAAAAACGAAAGC 3'(下划线标注部分为BamHI酶切位点)和 下游引物5' tccatccgcggTTATTTCTGAACATAAATG 3' (下划线标注部分为SacII,酶 切位点)。
上述扩增得到1545bp的片段，经过测序表明，该片段具有GENBANK ACCESSION Number为AM409180的5'端第7—1551位核苷酸序列，该片段包括中 温a-淀粉酶基因(amyl)的启动子、信号肽编码序列和结构基因，将该片段命名为amyl。
分别用BamHI和SacII双酶切PCR产物amyl和穿梭整合质粒pAXOI(购自从美 国俄亥俄州立大学菌种保存中心，5flc〃/w Genetic Stock Center (BGSC)The Ohio State University),将酶切产物分别用PCR产物回收试剂盒回收纯化后，在4°C采用T4 DNA 连接酶进行连接反应16小时。将连接反应物转化宿主菌￡.^//1\^10(购自北京天根 生化科技有限公司)感受态细胞，涂布LB平板(Amp+),挑选阳性克隆，进行摇瓶培 养16小时。收获细胞，提取小量质粒进行酶切和测序验证。将验证正确的穿梭质粒 即携带中温淀粉酶的启动子、信号肽和结构基因的表达穿梭整合质粒命名为 pAXOI-amyl(结构图如图1所示)。
实施例2、表达中温a-淀粉酶重组枯草芽胞杆菌(ZHWY)的构建 将实施例1构建的携带中温淀粉酶的启动子、信号肽和结构基因的表达穿梭整合 质粒pAX01-amyl以原生质体加电穿孔法(Romero D ， Journal of Microbiology Methods, 2006 Vol 66 p556-559)转化野生菌枯草芽孢杆菌(5ac/〃w wto7/力264 (购自 中国工业微生物菌种保藏中，保藏号为CICC10264，是一株目前广泛应用于工业生产 中温a-淀粉酶的枯草芽孢杆菌)，具体方法如下所述
5采用Romero D枯草芽孢杆菌原生质体制备方法(Romero D ， Journal of Microbiology Methods, 2006 Vol 66 p556_559)获得枯草芽孢杆菌C6ac/〃us s"6似^) 264 CICC10264原生质体后，取5ul纯化后的质粒于一个1. 5 ml的离心管中，将其和0. 2CM 的电击杯放在冰上预冷，将120ul制备好的原生质体转入至1.5 ml的离心管中，小 心混匀，冰上放置10min，然后开启电转仪，调电压到600V;将质粒和原生质体细胞 混合液移到已经预冷的电转杯中，用干滤纸擦干电转杯，注意混合液中不得有气泡。 将电转杯放入电转仪的杯槽中，按下电击键，有放电声出现后，立即向电转杯中加入 lml细胞复苏缓冲液(Romero D ， Journal of Microbiology Methods, 2006 Vol 66 p556-559)，重悬细胞后，转移到1.5 ml的离心管中。放置37。C， 100rpra摇床培养 12-16小时，取150ul菌液涂布于含有10ug/ml红霉素的DM3固体培养基平板(含8g/L 琼脂，5g/L水解酪蛋白，5g/L酵母粉，1.5g/LKH2P04， 3.5g/L K2HP04， 45.5g/L山梨 醇和10g/L淀粉的培养基)，放入37'C培养箱培养72 — 96小时后，挑取出现枯草芽 孢杆菌的单菌落，提取基因组基因，用实施例l所述的扩增中温a-淀粉酶的基闵(a町l) 的上下游引物进行PCR鉴定，扩增得到1545bp的片段的菌株即为阳性菌株，结果得 到一株验证表明正确的导入pAX0I-amyl得到基因重组菌，将该菌株命名为枯草芽孢杆 菌(^^7/m wto'fo) ZHWY。该枯草芽孢杆菌(&c"/m wto7/力ZHWY，巳于2008年12月 25日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为 中国北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCCNo.2829。
实施例3、基因重组枯草芽孢杆菌(5ac"/w ZHWY中温a-淀粉酶表达效果
验证
将实施例2所得重组枯草芽孢杆菌CSa"7/iw raZ)"7/力ZHWY CGMCC No. 2829和 枯草芽孢杆菌(^^///^ w^/fo) 264 CICC10264 (野生菌)活化做种子。活化条件为将重 组枯草芽孢杆菌ZHWY或枯草芽孢杆菌(^"c///^ 264 CICC10264 (野生菌)分别
接种于装有25ml活化培养基的250mL三角瓶中，37°C ， 200rpm摇床培养16小时得 到重组枯草芽孢杆菌(^]^7/^ ZHWY CGMCC No. 2829或枯草芽孢杆菌
CBa"'〃"s 264 CICC10264 (野生菌)种于液。
活化培养基组分为蛋白胨10g/L，酵母粉5/L，氯化钠10g/L， pH7.0-7.2，其余 为水。
将上述获得的重组枯草芽孢杆菌CSad//^犯^/fo) ZHWY CGMCC No. 2829或枯 草芽孢杆菌(5ac///^ wto'fc) 264 CICC10264 (野生菌)种子液分别按照体积百分含量为 2-4% (请将该数值范围替换成具体实施的数据)的接种量接种于装有50ml发酵培养
6基的500毫升带带档板的三角瓶中，37°C， 200rpra摇床培养，发酵培养76小时，终 止发酵。
上述发酵培养基的组成为玉米粉85g/L，豆饼粉40g/L，氯化钙2/L，磷酸氢二 钠8g/L，硫酸铵4g/L， pH7.0， 其余为水。
发酵过程中，取样发酵液离心(12000r/min， 5min)，取上清液进行检测酶活， 中温淀粉酶活检测采用中华人民共和国家标准法测定(QB/T2306-1997)，酶活的定 义lg酶粉或lml酶液于60°C， p朋.0条件下，以lh液化可溶性淀粉的克数来表示(克 可溶性淀粉/克.小时或克可溶性淀粉/毫升.小时)(中华人民共和国国家标准， GB8275-87)。
结果表明，在发酵培养76小时，重组菌枯草芽孢杆菌CSa"7/w wto7/力ZHWY的酶 活达到731U/毫升发酵液，而野生菌酶活为400U/毫升发酵液，重组菌枯草芽孢杆菌 CSac/〃w w6afo) ZHWY CGMCC No. 2829酶活(731 U /毫升)比野生菌提高83 % 。
权利要求
1、表达中温α-淀粉酶的工程菌，是将表达中温α-淀粉酶基因的重组载体导入枯草芽孢杆菌(BacillusSubtilis)中，筛选得到的中温α-淀粉酶表达量提高的工程菌株；所述中温α-淀粉酶基因具有具有GENBANK ACCESSION Number为AM409180的5′端第7—1551位核苷酸序列。
2、 根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于所述枯草芽孢杆菌(Ba"7/M ^to'fo)为枯草芽孢杆菌(^flc/〃z^w^/fc) 264 CICC10264。
3、 根据权利要求2所述的工程菌，其特征在于所述表达中温a-淀粉酶的工程 菌为枯草芽孢杆菌CBac/〃ws w6"fo) ZHWY CGMCC No. 2829。
4、 一种表达中温a-淀粉酶的方法，是发酵权利要求1-3中任意一项所述的表达 中温a-淀粉酶的工程菌，得到中温a-淀粉酶。
5、 根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述发酵用培养基为含75-86 g/L 的玉米粉，35-45 g/L的豆饼粉，l-3g/L的氯化钙，6.5-8.5 g/L的磷酸氢二钠， 3.5-5.5 g/L的硫酸铵的液体培养基。
6、 根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述发酵的温度为36.0-38.5。C。
7、 根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述发酵的温度为37。C。
全文摘要
本发明公开了一种表达中温α-淀粉酶的基因工程菌株。该工程菌是表达中温α-淀粉酶的工程菌，是将表达中温α-淀粉酶基因的重组载体导入枯草芽孢杆菌(BacillusSubtilis)中，筛选得到的中温α-淀粉酶表达量提高的工程菌株；所述中温α-淀粉酶基因具有具有GENBANK ACCESSION Number为AM409180的5′端第7-1551位核苷酸序列。本发明的方法，是发酵所述的表达中温α-淀粉酶的工程菌，得到中温α-淀粉酶。该工程菌具有比目前国内生产菌株更高的中温α-淀粉酶产酶能力，具有独特的鉴定标签，是一株极具生产应用价值的中温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌生产菌株。
文档编号C12N1/21GK101451115SQ20081024673
公开日2009年6月10日 申请日期2008年12月30日 优先权日2008年12月30日
发明者杨建国, 兵 汪, 赵仁国 申请人:北京中天诺亚体育科技有限公司