专利名称：一种生物材料玻璃化冷冻载体的制作方法
技术领域：
本实用新型属于生物医学领域，涉及一种生物材料玻璃化冷冻载体。
背景技术：
目前，低温冷冻技术在辅助生殖领域应用广泛。玻璃化冷冻技术是利用体积微
小的冷冻承载工具，在极快速降温(〉2 00(TC/min)过程中，使高浓度的冷冻保护 液由液态转变为黏度很高的类似玻璃样的固态，避免细胞内冰晶的形成，达到冷冻 保护的作用，从而显著提高细胞/组织冷冻后的存活力和发育能力。玻璃化冷冻技 术具有简单、高效、省时、安全、费用少等优点。近年来，玻璃化冷冻技术在人卵 与胚胎的冷冻保存中的应用逐渐增多，利用该技术对人未成熟卵母细胞、成熟卵母 细胞、胚胎及囊胚进行冷冻均巳有成功报道。
冷冻载体是冷冻保存时承载细胞/组织的物体，玻璃化冷冻成功的关键因素之 一就是选择适当的冷冻载体。目前使用的玻璃化冷冻载体主要包括开放式拉细麦 管、封闭式拉细麦管、电子显微镜铜网、Cryoloop、 Cryotop和Cryoleaf等。冷冻 载体的功能在于承载标本的同时尽量减少负载的冷冻液，达到以下两个目的冷 冻过程中使标本直接接触液氮，快速降温达到玻璃化状态；解冻过程中使冻存标本
充分接触解冻液，及时脱离高浓度冷冻保护剂环境。
目前已有的玻璃化冷冻载体在制作、使用中存在着各种问题，影响了冻存效率
和玻璃化冷冻技术的开展。开放式拉细麦管或封闭式拉细麦管存在如下问题制作 过程中加热装置(酒精灯或热板)的温度不易控制，温度稍低不能将麦管拉长，温 度稍高麦管易断；存储过程中易受到外力破坏而断损，致冻存标本丢失。电子显微 镜铜网、Cryoloop、 Cryotop在冷冻过程及储存过程容易丢失标本。所以上述冷冻 载体在临床应用推广中可行性差，不被广泛接受。Cryoleaf是目前临床上应用最广 泛的冷冻载体，但费用昂贵(每支约需200元人民币)，在科学研究中难以广泛采 用。
实用新型内容
本实用新型的目的是提供一种生物材料玻璃化冷冻载体。
本实用新型提供的生物材料玻璃化冷冻载体，其特征在于它包括注射针头1
3和麦片2;
所述注射针头1由针头1-1和针头座1-2组成；
所述麦片2为开放型拉细麦管，其一端2-l套设于所述针头1-l的内腔中；另
一游离端2-2的麦管壁部分缺失，余留麦管壁的横截面为圆周的1/5-1/3。 所述针头1-1的内腔与所述开放型拉细麦管的口径最好匹配。 所述冷冻载体还可包括防护套3，所述针头1-1和所述麦片2套设于防护套3内。
为了组装方便，所述麦片2套设于所述针头中的一端2-1的端缘为尖端；所述
针头1-1的端缘为平端。
所述麦片2游离端2-2余留麦管壁的横截面具体可为圆周的1/3。
所述麦片2的厚度最好控制在80-100um之间，外径、内径及长度可根据所选
用的注射针头而定。
所述麦片2的外径具体可为0. 8-1. 2mm，优选lmm;所述麦片2的内径具体可 为O. 6-1.04mm，优选0. 8mm;所述麦片2的长度具体可为2. 5-3. 5cm，优选3cm。
所述注射针头可为任何市售注射针头，所述麦片可由任何市售麦管制作而成。
所述针头1-1可采用金属材质，所述针头座l-2可采用塑料材质，所述麦片2 的可采用聚乙烯材质，所述防护套3具体可为注射器针头套。
所述生物材料玻璃化冷冻载体可按照如下步骤制备
本发明提供的制备方法，包括如下步骤是将开放型拉细麦管的一端2-l套设 入注射针头1的针头1-l的内腔中；另一端2-2沿纵向切去部分麦管壁，余留麦管 壁的横截面为圆周的1/5-1/3;得到生物材料玻璃化冷冻载体。
所述开放型拉细麦管可将麦管在沸水浴中拉长得到。
实际操作时，可将保护套3套设于所述针头1-1和麦片2外，对其进行保护。 为了组装方便，制备本实用新型的冷冻载体时，可先将麦片2的一端2-1的端
缘加工为尖端，将针头1-1的端缘加工为平端。
得到的生物材料玻璃化冷冻载体可以消毒后售出，也可直接售出，使用前进行
消毒即可。常规消毒方法均可采用，如环氧乙垸熏蒸法。
本实用新型提供的生物材料玻璃化冷冻载体，具有如下优点
1)材料主要是一次性注射针头和麦管，来源丰富、成本低(注射器针头每支
l.O元，麦管每支0.4元)。2) 冷冻载体上有多处用于标记的部位，使用很方便。
3) 冷冻载体占用储存容器空间小，易于储存、运输。
4) 具有防护套，可以防止外界的机械碰触而导致的冻存标本丢失，冻存标本 放心、可靠。
本实用新型可以解决目前存在的自制冷冻载体难度大，而商品化载体价格昂贵 的问题，适用于各医院生殖中心实验室及各研究单位使用，对于推动玻璃化冷冻技 术的发展以及卵、胚胎、卵巢组织等的冷冻保存研究有着重要的意义。
以下的实施例便于更好地理解本实用新型，但并不限定本实用新型。
图1为生物材料玻璃化冷冻载体的结构示意图。
图2为麦片的结构示意图。
图3为图2的俯视图。
图4A、图4B、图4C为应用生物材料玻璃化冷冻载体的操作示意图。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。 实施例l、生物材料玻璃化冷冻载体的制备
一、 材料的准备
市售注射针头(18号)；市售注射器针头套(18号)；
麦管(0. 25ml):法国I.M.V公司。
二、 生物材料玻璃化冷冻载体的制备
用钳子将注射针头的针头前二分之一处剪断成平口，得到平口注射针头；
用电炉将双蒸水煮沸；
用血管钳将麦管两端夹住；
手持血管钳，将麦管浸入沸水浴中，向两端平拉至原管长的4倍，得到开放 型拉细麦管(外径1.0mm，内径0.8mm);
将开放型拉细麦管抬离液面，维持原先的拉力数秒，至冷却； 用剪刀将开放型拉细麦管剪成3厘米的管段； 将开放型拉细麦管(3厘米) 一端剪成0.5厘米斜口末端； 将管段的斜口末端插入平口注射针头，进深1.3厘米；
用手术刀片从开放型拉细麦管(3厘米)中点开始，沿纵向切去长1.5cm、截面2/3圆周的管壁，剩余管壁修整为长1. 3cm、宽O. lcm的薄片； 得到生物材料玻璃化冷冻载体。
如图1所示，生物材料玻璃化冷冻载体由注射针头l、麦片2和防护套3组成；其 中，注射针头l由端缘为平端的针头卜l和针头座l-2组成；麦片2的一端2-l的端缘 为尖端、套设于针头l-l的内腔中，另一端2-2麦管壁部分缺失，呈薄片状；针头l-l 和麦片2套设于防护套3内。由图2和图3可见，麦片2的一端2-l为斜口末端，另一端 2-2麦管壁部分缺失，呈薄片状。
针头l-l的作用为把持、固定麦片；针头1-l的孔可作为减压孔，不仅可以在将 载体浸入液氮时做为液氮自行注入管内的进口，在从液氮中取出时，还可以释放管 内因液氮迅速气化而产生的高压。针头座l-2用于操作时把持和文字标记。麦片2的 2-l端与注射针头l的针头l-l连接，起固定作用。麦片2的2-2端承载要冻存的标 本，浸入液氮中使标本与液氮直接接触而急速降温达到玻璃化状态。防护套3保护 麦片2及冻存标本免遭外界机械性碰撞，避免存放时标本丢失，还可用于文字标记。 所以组装后的注射针头1和麦片2的长度等于或略小于防护套3的长度。
实施例2、生物材料玻璃化冷冻载体的应用
将实施例l制备的冷冻载体用环氧乙垸熏蒸法消毒。用消毒后的冷冻载体玻璃 化冷冻53枚小鼠成熟卵母细胞，冷冻1天后，解冻卵母细胞，检测其存活情况。复 苏卵母细胞存活标准为卵母细胞折光性好，透明，没有明显的胞浆皱縮,透明带与 细胞膜完整。
平衡液(EM) : 10。/o乙二醇+l(^二甲基亚砜+10y。胎牛血清+DPBS; 玻璃化冷冻液(VM) : 20。/。乙二醇+20y。二甲基亚砜+l(m胎牛血清+DPBS; 解冻液(Tl溶液)0. 1M蔗糖+10。/。胎牛血清+DPBS; 解冻液(T2溶液)0.5M蔗糖+l(m胎牛血清+DPBS; 解冻液(T3溶液)0.25M蔗糖+1(^胎牛血清+DPBS; 解冻液(T4溶液)1(m胎牛血清+DPBS; M16培养基Sigma公司。 一、玻璃化冷冻
室温下将小鼠成熟卵母细胞在平衡液(EM)中停留5分钟后移入玻璃化冷冻液 (VM)中40秒，移到用冷冻载体的麦片上(见图4A)，立即投入液氮(见图4B)， 在液氮中盖好注射器针头帽(见图4C)。
6二、快速解冻
将冷冻l天的小鼠成熟卵母细胞进行解冻，并检测解冻后细胞的存活情况，具 体操作如下
从液氮中迅速取出冷冻载体，在室温下把负载小鼠成熟卵母细胞的冷冻载体的
麦片(见图4A)迅速放入T1溶液，在体式显微镜下找到卵母细胞，依次移入T2溶液、 T3溶液和T4溶液中，各停留3min，最后移入M16培养基于培养箱中(37°C， 5%C02)孵 育l小时后观察卵母细胞存活情况。
结果表明，冻存53枚卵母细胞，解冻复苏后获得53枚卵母细胞，存活47枚，无 丢失，存活率88.7%。
权利要求1、一种生物材料玻璃化冷冻载体，其特征在于它包括注射针头(1)和麦片(2)；所述注射针头(1)由针头(1-1)和针头座(1-2)组成；所述麦片(2)为开放型拉细麦管，其一端(2-1)套设于所述针头(1-1)的内腔中；另一游离端(2-2)的麦管壁部分缺失，余留麦管壁的横截面为圆周的1/5-1/3。
2、 如权利要求1所述的冷冻载体，其特征在于所述冷冻载体还包括防护套(3)， 所述针头(1-1)和所述麦片(2)套设于防护套(3)内。
3、 如权利要求2所述的冷冻载体，其特征在于所述防护套(3)为注射器针头套。
4、 如权利要求1至3中任一所述的冷冻载体，其特征在于所述麦片(2)套设于所述针头中的一端(2-1)的端缘为尖端；所述针头(1-1)的端缘为平端。
5、 如权利要求1至3中任一所述的冷冻载体，其特征在于所述麦片(2)游离 端(2-2)余留麦管壁的横截面为圆周的1/3。
6、 如权利要求1至3中任一所述的冷冻载体，其特征在于所述麦片(2)的外 径为O. 8-1.2mm、内径为0. 6-1. 04mm，所述麦片(2)的长度为2. 5-3. 5cm。
7、 如权利要求6所述的冷冻载体，其特征在于所述麦片(2)的外径为lmm、 内径为0.8mm，所述麦片(2)的长度为3cm。
8、 如权利要求4所述的冷冻载体，其特征在于所述麦片(2)游离端(2-2) 余留麦管壁的横截面为圆周的1/3。
9、 如权利要求8所述的冷冻载体，其特征在于所述麦片(2)的外径为0. 8-1. 2mra、 内径为0.6-1.04mm，所述麦片(2)的长度为2. 5-3. 5cra。
10、 ，如权利要求9所述的冷冻载体，其特征在于所述麦片(2)的外径为lmm、 内径为0.8mm，所述麦片(2)的长度为3cm。
专利摘要本实用新型公开了一种生物材料玻璃化冷冻载体。本实用新型提供的生物材料玻璃化冷冻载体包括注射针头(1)和麦片(2)；所述注射针头(1)由针头(1-1)和针头座(1-2)组成；所述麦片(2)为开放型拉细麦管，其一端(2-1)套设于所述针头(1-1)的内腔中；另一游离端(2-2)的麦管壁部分缺失，余留麦管壁的横截面为圆周的1/5-1/3。本实用新型将处理后的开放型拉细麦管与注射针头组装，用于生物材料的玻璃化冷冻，具有操作简便，成本低等优点，适用于各医院生殖中心实验室及各研究单位使用，对于推动医学领域玻璃化冷冻技术的发展以及卵、胚胎、卵巢组织等的冷冻保存研究有着重要的意义。
文档编号C12M1/24GK201284339SQ20082012320
公开日2009年8月5日 申请日期2008年10月21日 优先权日2008年10月21日
发明者杰 严, 杰 乔, 平 刘, 颖 廉, 闫丽盈 申请人:北京大学第三医院