专利名称：：源自谷氨酸棒杆菌的新型启动子核酸分子、包括所述启动子的重组载体、包括所述重组载...的制作方法
技术领域：
：本发明涉及源自谷氨酸棒杆菌(Co^"Aac/en'wmg/wtow/cwm)的新型启动子核酸分子、包括所述启动子的重组载体、用所述重组载体转化的宿主细胞和利用所述宿主细胞表达耙基因的方法。
背景技术：
：棒状细菌己广泛用于生成在动物饲料、制药、食品等工业中具有多种应用的化学物质，包括L-赖氨酸、L-苏氨酸和多种核酸。为了利用遗传工程和代谢工程技术由所述棒状细菌开发高产率菌株，需要选择性调节棒状细菌中多种代谢途径中涉及的基因的表达，并且由此需要有效用于这些基因调节的启动子。分离启动子的常规方法包括(1)使用启动子探针载体随机克隆仅在克隆的片段包含启动子活性时表达的报道基因上游的基因组DNA片段的方法；(2)利用基于基因-特异性探针的杂交法从基因文库中分离基因及其启动子的方法;和(3)利用可诱导的cDNA探针和非-可诱导的cDNA探针的基因文库差示杂交。在棒状细菌中的基因表达中，基因通常在它们原始启动子的控制下表达(Vasicova,P"等，细菌学杂志(J.Bacteriol,)，181,6188-6191,(1999)，等)。然而，与其他工业微生物诸如大肠杆菌(Escherichiacoli)，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)等不同，用于在棒状细菌中基因表达的启动子序列的典型结构尚是未知的。因此，通过以下步骤开发用于棒状细菌中的启动子从与对抗生素诸如氯霉素的抗性相关的基因中消除启动子区，利用合适的限制性消化向该启动子位点引入从棒状细菌中分离的染色体DNA片段，用由此生成的DNA分子转化棒状细菌，和评估获得的菌株的抗生素抗性(Eikmamis，B丄,等，基因(Gene)，102，93-98,(1991);Patek，M.，等，微生物学(Microbiology)，142，1297-1309,(1996》。然而，常规开发的启动子序列仍需要针对基因表达的选择性、基因表达效率等进行改进。我们通过下列步骤开发源自谷氨酸棒杆菌的新型启动子核酸分子搜索并通过聚合酶链反应(PCR)扩增推定的启动子区，将所述推定的启动子引入到缺乏启动子的lysC基因的起始位点，和通过赖氨酸的生成确定lysC活性的变化从而选择有效的启动子
发明内容技术问题本发明提供源自谷氨酸棒杆菌的新型启动子核酸分子。本发明还提供包括源自谷氨酸棒杆菌的新型启动子核酸分子的重组载体。本发明还提供用包括源自谷氨酸棒杆菌的新型启动子核酸分子的重组载体转化的宿主细胞。本发明还提供利用用包括源自谷氨酸棒杆菌的新型启动子核酸分子的重组载体转化的宿主细胞表达靶基因的方法。技术方案按照本发明的一方面，提供具有SEQIDNO:1或2核苷酸序列的启动子核酸分子。按照本发明的启动子核酸分子的核苷酸序列可以通过若干近期开发的技术诸如定向进化或位点-指导的诱变之一被修饰到一定程度。本领域中的那些技术人员应该容易理解与本发明的启动子序列具有70%或更高同源性的核苷酸序列等价于本发明的启动子，条件是其保持表达靶基因的启动子活性。因此，按照本发明的启动子核酸分子可以包括与SEQIDNO:1或2的核苷酸序列具有70%或更高同源性并且可以作为启动子使用的核苷酸序列。术语"同源性"用于本文中表示与野生型核酸序列的序列相同的程度。本发明的启动子可以包括具有这样的DNA序列的启动子，所述DNA序列与本发明的新型启动子的核苷酸序列75%或更高，优选85%或更高，更优选90%或更高和最优选95%或更高地相同。同源性可以由肉眼或使用商购软件进行比较。根据商购软件程序，可以以百分数(％)计算两种或更多序列之间的同源性，并且可以计算相邻序列之间的同源性(％)。另外，本发明的启动子核酸分子可以包括源自谷氨酸棒杆菌的启动子核酸分子，其选自由包括与上述核苷酸序列互补的核苷酸序列的启动子组成的组。术语"互补"用于本文中，表示核苷酸或核酸之间，例如，双链DNA分子的两条链之间或寡核苷酸引物和待测序或扩增的单链核酸模板的引物结合位点之间可能的杂交或碱基配对。另外，本发明源自谷氨酸棒杆菌的启动子核酸分子包括源自谷氨酸棒杆菌的启动子核酸分子的功能等价物。包括其功能片段的本发明启动子的功能等价物可以包括具有至少一个碱基取代、缺失、插入或其组合的变体。本发明的谷氨酸棒杆菌启动子核酸分子是源自棒状细菌的启动子，且优选有效用作在原核细胞，具体地大肠杆菌和棒状细菌中表达目的基因的启动子。术语"启动子"用于本文中，表示RNA聚合酶与其结合从而起始基因转录的DNA区域，其位于mRNA转录起始位点的上游，到5'方向。具有本发明SEQIDNO:1或2核苷酸序列的本发明启动子可以是基因NCgll504(SEQIDNO:ll)和基因NCgl1305(SEQIDNO:12)的启动子，所述基因是通过分析谷氨酸棒杆菌ATCC13032的约3000个基因的基因表达量选择的。在本文中，"具有核苷酸序列NCgl1504的基因"和"具有核苷酸序列NCgl1305的基因"不仅指源自谷氨酸棒杆菌ATCC13032分别具有SEQIDNOS:11和12核苷酸序列的基因，还指在属于棒杆菌(Corynebacterium)属的微生物中表达与由NCgl1504或NCgl1305表达的那些基本相同的产物的基因。术语"NCgl1504基因"和"NCgl1305基因"分别指"具有核苷酸序列NCgl1504的基因"和"具有核苷酸序列NCgl1305的基因"。术语"基本相同"用于本文中，表示活性和调节机制。具有核苷酸序列NCgll504的基因可以是具有SEQIDNOS:11的核苷酸序列的基因，且具有核苷酸序列NCgl1305的基因可以是具有SEQIDNO:12的核苷酸序列的基因。按照本发明的启动子核酸分子可以利用标准分子生物学技术，例如通过使用适当引物序列的PCR分离或制备。其还可以通过使用自动化DNA合成器的标准合成技术制备。本发明还通过包括具有SEQIDNO:1或2的核苷酸序列的启动子和与所述启动子可操作性连接的靶基因的编码序列的重组载体。术语"载体"用于本文中，表示包括这样的DNA序列的DNA构建体，所述DNA序列与适用于在合适的宿主细胞中表达的控制序列可操作性连接。所述合适的控制序列包括指导转录的启动子、调节所述转录的任意操纵基因序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列和用于转录和翻译的序列。所述载体可以是质粒、噬菌体粒子或仅是潜在的基因组插入物。当载体转化相容的宿主时，该载体可以独立于宿主基因组进行复制和起作用，或在一些情形中可以整合到宿主的基因组中。术语"可操作性连接的"用于本文中，表示待表达的基因与其控制序列功能性连接，以使该基因正确表达。包括按照本发明的谷氨酸棒杆菌启动子核酸分子的重组载体可以与编码多种蛋白质的基因可操作性连接，从而重组地产生靶蛋白。欲使用本发明的载体表达的靶基因可以是编码天冬氨酸激酶的lysC、编码二氢吡啶二羧酸还原酶的dapB等，但并不仅限于此。按照本发明的靶基因可以是编码天冬氨酸激酶的lysC。编码天冬氨酸激酶的lysC可以具有SEQIDNO:13的碱基序列(Ikeda等，微生物学和生物技术应用(ApplMicrobiolBiotechnol.)2002年2月;58(2):217-23使用谷氨酸棒杆菌基因组信息产生新型L-赖氨酸-生成突变体的新方法学(AnovelmethodologyemployingGor少weZ)aCen'Mwg/w^fw/cwwgenomeinformationtogenerateanewL-lysine-producingmutant))。按照本发明的重组载体可以是pDZ-NCgll504-lysC，其包括具有与作为靶基因的lysC编码序列(SEQIDNO:13)可操作性连接的SEQIDNO:1的核苷酸序列的启动子。所述重组载体还可以是pDZ-NCgll305-lysC，其包括具有与作为靶基因的lysC编码序列(SEQIDNO:13)可操作性连接的SEQIDNO:2的核苷酸序列的启动子。本发明还提供用重组载体转化的宿主细胞，所述重组载体包括具有SEQIDNO:1或2的核苷酸序列的启动子。所述宿主细胞，例如，原核细胞，优选大肠杆菌和棒状细菌，和更优选棒状细菌可以被制备的重组载体转化，以使谷氨酸棒杆菌启动子核酸分子与编码耙蛋白的基因可操作性连接，从而表达该靶蛋白。所述"棒状细菌"可以是属于棒杆菌属或短杆菌(Brevibacterium)属的细菌，具体地，谷氨酸棒杆菌，和更具体地，谷氨酸棒杆菌ATCC13032。本发明的棒状细菌可以包手舌棒杆菌属的其4也菌株，C"or少"e6fl"er/ww^zer附ofl附z'woge"esFERMBP-1539,黄色短杆菌(&evAacfen'wmy7avww)ATCC14067,乳发酵短杆菌(S^W6ac^7'wm/acto/e/7we"加w)ATCC13869及其生成L-氨基酸的突变体、或谷氨酸棒杆菌KFCC10881,谷氨酸棒杆菌KFCC11001等。术语"转化"用于本文中，表示以这样的方式将DNA引入宿主中，所述方式是其能够作为染色体外元件或通过染色体整合进行复制。宿主细胞可以是用这样的重组载体转化的棒杆菌，所述重组载体包括具有SEQIDNO:1的核苷酸序列的启动子和与所述启动子可操作性连接的lysC(SEQIDNO:13)。宿主细胞可以优选地是谷氨酸棒杆菌(保藏号KCCM10831)。宿主细胞还可以是用这样的重组载体转化的棒杆菌，所述重组载体包括具有SEQIDNO:2的核苷酸序列的启动子和与所述启动子操作连接的lysC(SEQIDNO:13)。宿主细胞可以优选地是谷氨酸棒杆菌(保藏号KCCM10830)。本发明还提供表达靶基因的方法，所述方法包括培养用具有源自谷氨酸棒杆菌的启动子核酸分子的重组载体转化的宿主细胞。与具有SEQIDNO:1或2的核苷酸序列的启动子可操作性连接的靶基因可以是编码与合成终产物诸如赖氨酸和苏氨酸相关的蛋白质的基因。术语"表达靶基因"用于本文中，表示生成合成途径I的终产物，所述合成途径I涉及由靶基因编码的蛋白质。因此，表达靶基因的方法可以是通过培养用包括所述靶基因的重组载体转化的宿主而生成合成途径的终产物的方法，在所述合成途径中涉及由所述靶基因编码的蛋白质。所述最终产物可以是赖氨酸。即本发明可以提供生成赖氨酸的方法，其包括培养由重组载体转化的宿主细胞，所述重组载体包括编码赖氨酸合成中涉及的蛋白质的lysC和与该基因可操作性连接的具有SEQIDNO:1或2的核苷酸序列的启动子。在按照本发明的赖氨酸合成方法中，所述宿主细胞可以是由重组载体转化的谷氨酸棒杆菌KCCM10831或棒状细菌(C07"e/0削k^e〃'"m)KCCM10830，所述重组载体包括与靶基因，即SEQIDNO:13的lysC可操作性连接的具有SEQIDNO:1或2的核苷酸序列的启动子。转化的宿主细胞(转化体)的培养可以按照本领域中常用的方法进行。已知的培养方法记述在Chmiel,(Bioprozesstechnik1.EinfiihrungindieBioverfahrenstechnik(GustavFischerVerlag,Stuttgart,1991);禾卩Storhas(BioreaktorenundperiphereEinrichtungen(ViewegVerlag,Braunschweig/Wiesbaden,1994》中。用于该培养的培养基需要达到以适当方式生长特定菌株的要求。用于棒杆菌菌株的培养基公开在，例如，常规细菌学方法手册(ManualofMethodsforGeneralBacteriology),美国细菌学协会(AmericanSocietyforBacteriology).华盛顿，美国，19S1中。培养基的碳源可以是碳水化合物诸如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素，油和脂肪诸如豆油、葵子油、蓖麻由(casteroil)和椰油，脂肪酸诸如棕榈酸、硬脂酸和亚麻酸，醇诸如甘油和乙醇，和有机酸诸如乙酸。碳源可以单独或混合使用。氮源也可以是蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉和尿素，或无机化合物，例如，硫酸铵、硫化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。氮源可以单独或混合使用。磷源可以是磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或其钠盐。另外，所述培养基应该包含生长所必需的金属盐，诸如硫酸镁或硫酸铁。最后，所述培养基还可以包括生长的必需物质，诸如氨基酸和维生素。另外，还可以向培养基中加入合适的前体。培养基的那些成分可以在培养过程中一批或基于持续的加入到培养基中。培养基的pH可以使用碱性化合物诸如氢氧化钠、氢氧化钾和氨水，或酸性化合物诸如磷酸或硫酸，以适当的方式调节。另外，利用防沫剂诸如脂肪酸聚乙二醇酯可以防止泡沫形成。氧或含-氧气体，例如空气，可以引入到培养基中，从而维持充气状态。培养基的温度可以在20-45°C，和优选25-4(TC的范围内。持续培养直至生成的靶物质的量达到其最大值。通常，培养进行10-160小时。将参考下列实施例更详细地描述本发明。下列实施例仅是为了举例说明的目的，且不意欲限制本发明的范围。有利效果按照本发明，提供源自谷氨酸棒杆菌的新型启动子核酸序列以用于有效表达目的基因。本发明的以上和其他目的、特征和其他优点将通过以下结合附图的详细说明得到更加清楚的理解，在所述附图中图1示意性显示按照本发明的实施方案，为了研究启动子活性制备载体的过程。发明模式实施例l:制备包括新型启动子序列的重组载体1.选择关于源自谷氨酸棒杆菌的新型启动子的候选基因在5L发酵器中培养谷氨酸棒杆菌ATCC13032，并收集细胞。利用基因组DNA芯片(cDNA芯片，Genomictree，公司，韩国)确定谷氨酸棒杆菌ATCC13032的约3000种基因的mRNA表达水平。将基于总基因组表达分别占0.88%和0.43%的NCgl1504和NCgl1305基因选作本发明新型启动子的候选基因。2.扩增推定的启动子区的DNA片段谷氨酸棒杆菌基因组的核苷酸序列是已经完全确定并公知的(微生物学和生物技术应用(Appl.Microbiol.Biotechnol.)，62(2-3),99-109(2003):GenBank登记号NC_003450)。蛋白质(NCg11504和NCgll305)的序列信息获自全国卫生研究所(NIH)Genbank(美国)数据库。为了扩增位于各种基因开放阅读框(ORF)上游的推定的启动子区(SEQIDNO:1-NCgll504的启动子区，SEQIDNO:2-NCgl1305的启动子区)，基于报告的核苷酸序列合成包括EcoRV/BamHI和Ndel限制性位点的引物1-4。在PCR中，利用谷氨酸棒杆菌ATCC13032的染色体DNA作为模板，分别使用引物1和2(SEQIDNOS:3和4)和引物3和4(SEQIDNOS:5和6)，以30个94。C变性，55。C退火1分钟和72。C聚合30秒的循环，扩增NCgl1504和NCgl1305基因的推定的启动子区[Sambrook等，分子克隆，实验室手册(MolecularCloning,aLaboratoryManual)(1989)，冷泉港实验室(ColdSpringHarborLaboratories)]。3，制备用于染色体整合从而确定启动子活性的重组载体为了确定获得的NCgl1504和NCgl1305的推定的启动子区在棒杆菌染色体中活性，我们使用载体pDZ进行染色体整合(韩国专利申请号1-2006-089672)，它是由Cheiljedang株式会社利用pACYC177(新英格兰生物实验室(NewEnglandBiolab),GenBankaccetion#X06402),即一种大肠杆菌的克隆载体作为基本载体开发的。为了将基因插入棒杆菌染色体中，将具有SEQIDNOS:1或2的核苷酸序列的新型启动子插入到lysC起始位点前，从而分别获得pDZ-Ncgll504-lysC或pDZ-Ncgll305-lysC载体。以下列方式制备重组载体，其中将NCgll504和NCg11305的推定的启动子位点插入到lysC基因中。为了扩增SEQIDNO:13的lysC，将谷氨酸棒杆菌ATCC13032的染色体DNA用作模板，并利用引物5和6(SEQIDNOS:7和8)以及引物7和8(SEQIDNOS:9和10)进行PCR(PCR条件30次94°C变性，55。C退火1分钟和72。C延伸30秒的循环)。用EcoRV和Klenau消化利用TOPO克隆试剂盒(Invitrogen)扩增的LysC片段，这两个平端片段连接，并克隆到pCR2.1-lysC中。然后，利用EcoRV和Ndel裂解pCR.2.1-lysC和NCgl1504或NCgl1305的启动子位点，并利用DNA连接酶将SEQIDNO:1或2的新型启动子插入到该限制性位点。然后，将克隆的片段转移到pDZ载体中，从而制备pDZ-Ncgll504-lysC和pDZ-Ncgll305-lysC载体，如图1中所示。实施例2.用包括新型启动子序列的重组菌株转化如微生物学和生物技术应用(Appl.Microbiol.Biotechnol.)(1999)52:541-545中所公开地，利用制备的重组载体pDZ-NCgll504-lysC或pDZ-NCgll305-lysC，通过电脉冲转化谷氮酸棒杆菌KFCC10881，即L-赖氨酸-生成菌株。在包含25mg/L卡那霉素(10g/L牛肉提取物，10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，5g/L氯化钠，3.7g/L脑心浸液(BHI)和9.1g/L山梨糖醇)的选择性培养基中选择转化的菌株，其中反应器上的新型启动子通过同源重组整合到染色体中。根据该菌株是否在包括X-gal(5-溴-4-氯-3』引哚基-(3-D-半乳糖苷)的固体培养基中变蓝，可以鉴定载体的插入。在营养培养基中，通过摇动，在3(TC培养这样的菌株8小时，在所述菌株中载体通过第一次交叉插入到染色体中，分别稀释将其到10夂10—w并涂布到包括X-半乳糖的固体培养基上。大多数菌落显示出蓝色，且在其中通过第二次交叉去除插入的载体序列的菌株通过选择白色菌落筛选。利用针对卡那霉素的易感性，鉴定并通过测序完全证实所选择的菌落。将其中lysC基因的启动子被Ncgl1504代替的菌株称为CA01-0037，且将其中lysC基因的启动子被Ncgl1305代替的菌株称为CA01-0036,且它们于2006年12月28日，分别以KCCM10831和KCCM10830保藏在韩国微生物培养中心(KoreanCultureCenterofMicroorganisms)。实施例3:棒杆菌中启动子序列的活性培养转化的菌株，从而按下述分析启动子序列的活性。以1:20的比例，将各种转化的谷氨酸棒杆菌菌株接种到装有25ml培养基[20g葡萄糖，5g硫酸铵，5g酵母提取物，1.5g尿氣4gKH2P04，8gK2HP04,0.5gMgS047H20，150叱生物素，1.5mg盐酸硫胺素，3mg泛酸钙，3mg烟酰胺(基于1L蒸馏水)，pH7.2]的250ml带边缘-挡板(comer-baffle)的摇瓶中，并在30°C，在以200rpm摇动时培养直到该培养物达到对数生长中期(OD6()()=10)。当终止该培养时，通过离心收集细胞，并混悬在100mMTris-HC1缓冲液(pH7.0)中，通过超声波裂解，并然后进行高速离心，以获得上清液。使用来自该上清液的lmg蛋白质来测量lysC酶的活性(Black和Wright(1955b))。结果，在其中关于lysC的启动子被NCgl1504或NCgl1305代替的菌株中证实了lysC活性的改变，如下表中所示。表.通过赖氨酸的添加比较启动子活性<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>用于专利程序的国际承认的微生物保藏布达佩斯条约<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>1在适用细则6.4((1)的情况下，该日期是取得国际保藏机构法律状态的日期；在取得国际保藏机构的法律状态后在布达佩斯条约外进行的保藏转变为根据布达佩斯条约的保藏的情况下，该日期是国际保藏机构收到微生物的日期。表BP/4独立页--韩国微生物培养中心-YoylimBldg,1100§)。-1(1011&Seodaemun-gu,首尔120-091,韩国，Tel:82-2-3W-0950,396-0950Fax:82-2-392-2859,E-mail:kccmkftx@icccm.or,kr用于专利程序的国际承认的微生物保藏布达佩斯条约国际表格致CJ株式会社由在本页底部确定的国际保藏机构在500-5-GANAMDAEMUN-RO，按照细则7.1原始发行的情形中接收CHUNG-KU,首尔，韩国I.微生物的鉴定保藏人给予的鉴定参考国际保藏机构提供的登记号谷氨酸棒杆菌(Cor拜6a"en'wwKCCM10830Pg/w/腦/c)CA01-0036II.科学描述和/或提议的分类命名对上文I中确定的微生物附有科学描述提议的分类命名(在适用的地方标注叉号)in.接收和接受本国际保藏机构接受了上述I中确定的微生物，该微生物于2006年12月28日<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>'在适用细则6.4(d)的情况下，该日期是取得国际保藏机构法律状态的日期；在取得国际保藏机构的法律状态后在布达佩斯条约外进行的保藏转变为根据布达佩斯条约的保藏的情况下，该日期是国际保藏机构收到微生物的日期。表BP/4独立页--韩国微生物培养中心-~YoylimBldg,36卜221Hongje-ldong，Seodaemun-gu,首尔120-091,韩国，Tel:82-2-391-0950，396-0950Fax:82-2-392-2859,E-mail:kccmkfcc@kccm.or.kr权利要求1.启动子核酸分子，其具有SEQIDNO1或2的核苷酸序列。2.重组载体，其包括与靶基因编码序列可操作性连接的权利要求1的启动子。3.宿主细胞，其用权利要求2的重组载体转化。4.权利要求3的宿主细胞，其属于棒杆菌(Corynebacterium)属。5.权利要求4的宿主细胞，其为由重组载体转化的谷氨酸棒杆菌(Oo^e6acte〃'wwg/wtom/cM7w)KCCM10831，所述重组载体包括与lysC基因编码序列可操作性连接的命名为SEQIDNO:1的启动子。6.权利要求4的宿主细胞，其为由重组载体转化的谷氨酸棒杆菌(Coo^Wacte〃'wng/wtom/ciwOKCCM10830，所述重组载体包括与lysC基因编码序列可操作性连接的命名为SEQIDNO:2的启动子。7.表达靶基因的方法，所述方法包括培养按照权利要求3-6中任一项的宿主细胞。8.权利要求7的方法，其中所述靶基因是lysC基因。全文摘要本发明提供具有源自谷氨酸棒杆菌的SEQIDNO1或2的核苷酸序列的新型启动子核酸分子，包括所述启动子的重组载体，用所述载体转化的宿主细胞和利用所述宿主细胞表达目的基因的方法。文档编号C12N15/09GK101605890SQ200880001888公开日2009年12月16日申请日期2008年1月15日优先权日2007年1月15日发明者张在佑,朴英薰,李善英,林相曹,罗昭妍申请人:Cj第一制糖株式会社