将基因转移至哺乳动物的方法

专利名称：将基因转移至哺乳动物的方法
技术领域：
本发明涉及一种转化毛囊，以及一种通过转化毛囊将基因转移至哺乳动物的方法。
背景技术：
近年来，已经鉴别了致病基因、再生相关基因和其它类似基因，许多病理状态和再 生基于其分子水平的机理而已经得到阐明。在这种情况下，现在进行的研究在于将外源基 因转移至病人或其它实验对象的细胞中，用于病人或实验对象的疾病的治疗以及器官和组 织的再生。通常，用已知的技术来实现外源基因至细胞的转移，例如，脂质体转染法(用脂质 体)和使用病毒载体，例如，腺病毒载体或逆转录病毒载体。在这些技术中，从基因转移效 率的观点来看，广泛采用那些利用了病毒载体的技术。此外，最近为了克服逆转录病毒载体 只可以转移至有丝分裂细胞中的缺点，已经使用慢病毒载体，它是通过将属于逆转录病毒 科(例如，HIV-1)的RNA病毒中的高危特定序列进行删除或失活而构建的。另外，也使用 假型慢病毒载体，其所涉及的结合在细胞表面的包膜蛋白(envelope protein)变为从疱疹 性口腔炎病毒(VSV)、伊波拉萨伊(EboZ)病毒而来的包膜糖蛋白或类似蛋白，从而提高了 对特定细胞的转移效率。以往的研究事实上表明使用EboZ糖蛋白作为包膜蛋白，提高了 基因转移至人呼吸道上皮细胞的效率(Kobinger GP. et al. ,Nat. Biothcnol. 19 :225_230， (2001))以及使用VSV-G作为包膜蛋白，提高了基因转移至人表皮干细胞的效率(Hachiya A. et al.，Gene Ther. 14 :648_56，(2007))。同时，考虑到在基因转移时或转移后监测的方便、容易等因素，通常使用存在于 身体表面的皮肤组织的细胞来作为转移进外源基因的细胞。由于表皮和毛囊是由细胞在 最终分化阶段形成，其干细胞不断产生新细胞(Cotsarelis G.，J Invest. Dermatol. 126 1459-1468，(2006))。因此，当希望外源基因长时间表达时，必须将该基因转移至相应的干 细胞中。至今，在表皮中，已知干细胞存在于表皮基底层，然而在毛囊中，已知干细胞存在于 隆突区。由于研究表明毛囊的干细胞在表皮伤口的愈合中起到重要作用，与通常的表皮更 新相反(Ito M. et al.，Nat. Med. 11(12) 1351-1354，(2005))，存在于毛囊的隆突区的表皮 细胞和黑色素干细胞已经受到关注，将基因转移至毛囊的干细胞中已经变得越来越重要。换言之，如果在愈合期间将促进伤口愈合的外源基因转移至隆突区的干细胞中， 部分表皮从具有新的附加功能的干细胞得到重建。因而，将基因转移至隆突区的干细胞中 的技术实现了更有效的表皮再生，并且是用于基于表皮中特定基因表达的基因治疗的可以 想象地有效方式。关于脂质体转染法，已经报道了使用脂质体包封LacZ，将基因转移至含有小鼠毛 囊的组织中的实验结果(Li L. et al. ,Nat. Med 1:705-706(1995))。另一出版物记载了对 于脂质体组合物优选的受体是处于生长阶段的毛囊，通过脂质体转染法，可以将基因瞬时转移至被移植到免疫缺陷小鼠上的人头皮块的大约10%的毛囊中(Domashenko，A. et al.， Nat. Biotechnol. 18(4) :420_423，(2000))。然而，由于基因是通过脂质体转染法而被暂时转移至细胞中，该技术不适合基因 长期表达的挑战仍然存在。还有报道当小鼠毛囊组织用胶原酶处理后，接着用腺病毒载体转移基因，从而成 功地在体外对该组织进行基因修饰，并且可以将由此修饰的组织成功地移植到健康的哺乳 动物实验对象上(W02001/042449，US 7067496，JP 2004-500809, Norimitsu S. et al.， PNAS 99(20) 13120-13124，(2002))。然而，即使使用腺病毒载体，转基因存在于细胞质中，而且得到的基因表达只是暂 时的，这也仍然是挑战。据进一步报道，通过胶原酶处理将完整的毛囊从小鼠真皮分离出来，接着用 Moloney小鼠白血病逆转录病毒(MoMLV)载体将致癌基因转移至该完整的毛囊中，通过 移植，癌症可以在裸鼠的基因转移组织中发展(Weinberg W. C. et al.，Carcinogenesis 12:1119-1124，(1991) ；Dennis R. R. et al. , Nature 323:822-824，(1986))。还报道 了用小鼠白血病逆转录病毒(MLV)载体将酪氨酸酶基因转移至包装细胞中，接着将包装 细胞和小鼠皮肤组织共同培养，至第6天确认在小鼠毛囊的毛母质和毛干中出现黑色素 (W02001/042449, US7067496, JP2004-500809)。然而，由于逆转录病毒载体在基因转移至例如神经细胞这样的非增殖细胞时遇到 困难，基因转移细胞的类型不利地受到限制。该领域普遍接受观点的是，当用逆转录病毒载 体来转移基因时，难以在防止转基因逃逸同时，长时间维持转基因的表达。

发明内容
本发明涉及以下内容1. 一种制备转化毛囊的方法，包括利用病毒载体将基因转移至毛囊中，所述方法 包括提供用VSV-G进行假型化的慢病毒作为病毒载体，并且用该慢病毒在体外转染毛囊。2.根据上述1所述的方法，所述毛囊源于人类。3. 一种转化毛囊，是通过如上述1或2所述的方法制备的。4. 一种哺乳动物，被移植了如上述3所述的转化毛囊。5. 一种将基因转移至哺乳动物的方法，包括下列步骤(1) (3)步骤(1)构建慢病毒载体，该慢病毒载体含有目标基因，且用VSV-G进行了假型 化；步骤(2)用慢病毒载体在体外转染毛囊，从而制备转化毛囊；以及步骤(3)将转化毛囊移植至动物中。6.根据上述5所述的方法，所述毛囊源于人类。7. 一种转化哺乳动物，是通过如上述5或6所述的方法制备的。8. 一种评估测试基因的功能的方法，包括下列步骤(1) (4)步骤(1)将测试基因转移至用VSV-G进行假型化的慢病毒载体中；步骤(2)用慢病毒载体在体外转染毛囊，从而制备转化毛囊；步骤(3)将所述转化毛囊移植至测试动物中；以及
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步骤(4)测定从所述毛囊再生的毛发的形状和性能。9. 一种用于将毛囊转化的试剂，包含用VSV-G进行假型化的慢病毒载体。10.用VSV-G进行假型化的慢病毒载体在制造用于将毛囊转化的试剂中的用途。


图1 被修整成苹果形的毛囊。图2:移植大约3个月后再生的毛发A 含有白种人直发的头皮样品被分成4等份，将其中一个部分进行移植。在观察 到头发再生后，间隔一周皮内给予二次慢病毒B 移植白种人直发毛囊；C:移植白种人卷发毛囊。图3 用慢病毒转染后，分离毛囊的器官培养A 培养21天的外观；B 毛囊转染一次和转染二次的比较(培养21天)；C 培养1周中的生长速率。图4 在转染一次和转染二次的毛囊中所消耗的葡萄糖的量和所产生的乳酸的 量A 葡萄糖消耗量；B 乳酸盐产生量。图5 没有转染的毛囊、转染一次的毛囊、转染二次的毛囊中细胞凋亡的状态A 没有转染的毛囊的细胞凋亡状态中的超时变化；B 器官培养14天细胞凋亡的比较。图6 没有转染的毛囊、转染一次的毛囊、转染二次的毛囊的X-gal染色(器官培 养14天)A 没有转染的毛囊；B 转染一次的毛囊；C:转染二次的毛囊。图7 器官培养14天，β _半乳糖苷酶的表达。图8 器官培养14天，外层根鞘中β -半乳糖苷酶的表达红色β -半乳糖苷酶；绿色角蛋白17(外层根鞘的标记)，一个单元长50μπι。图9 器官培养7天，毛囊中存在的黑色素细胞中β -半乳糖苷酶的表达红色β -半乳糖苷酶；绿色gpl00 (黑色素细胞的标记)；上部转染一次的毛囊；下部转染二次的毛囊。图10 没有转染的毛囊(对照组)、转染一次的毛囊、转染二次的毛囊中，外源基因 的拷贝数(从开始转染到48小时)图11 移植二次转染转化毛囊后，大约三个月再生毛囊中半乳糖苷酶的表
5达a:移植白种人直发毛囊；红色β -半乳糖苷酶；绿色角蛋白17(外层根鞘的标记)，一个单元长度50μπι;b:移植白种人卷发毛囊；红色β -半乳糖苷酶；绿色角蛋白17(外层根鞘的标记)，一个单元长度50μπι;c:移植白种人直发毛囊；红色β -半乳糖苷酶；绿色gplOO (黑色素细胞的标记)，一个单元长度=IOOym ；d:移植白种人卷发毛囊；红色β-半乳糖苷酶；绿色gplOO (黑色素细胞的标记)，一个单元长度100μπι;e 移植没有转染的白种人直发毛囊；红色β -半乳糖苷酶；绿色gplOO (黑色素细胞的标记)，一个单元长度=IOOym ；f:移植白种人卷发毛囊；红色β -半乳糖苷酶，一个单元长度100 μ m ；图12 直发和卷缩发的毛囊中IGFBP-5基因的表达。图13 :IGFBP_5过度表达的来自直发(直的)和卷发(卷曲的)的毛囊移植后，观 察到毛发的曲率明显增加的照片。图14 JGFBP-5过度表达导致严重卷缩的再生毛发的照片。图15 从IGFBP-5过度表达的直发毛囊中再生的毛发的扫描电镜图。
具体实施例方式本发明涉及一种转化毛囊和一种通过转化毛囊将基因转移至哺乳动物的方法。本发明人对基因转移至毛囊中进行了大量研究，发现通过用VSV-G假型病毒载体 在体外转染含有人类毛囊的组织，目标基因可以被有效地转移进入毛囊，通过使用转化毛 囊以高概率将目标基因转移进入试验动物，由此转基因可以有效地表达，并且在防止转基 因逃逸同时，高表达水平可以维持很长一段时间。根据本发明，可以将基因以一种简单的方式转移进入人类毛囊中，由此制作转化 毛囊。使用该转化毛囊，目标基因可以有效地转移进入动物中，经过很长一段时间，可以改 善多种病理情况，可以防止或治愈多种疾病。通过使用本发明的基因转移的方法，例如，经 过长时间可以评估被转移至试验动物的人类基因的功能。通过提供用VSV-G进行假型化的慢病毒作为载体，并用慢病毒在体外转染含有毛 囊的组织，从而制备本发明的转化毛囊。用VSV-G进行假型化的慢病毒载体是HIV类的慢病毒载体，其包膜糖蛋白被来源 于疱疹性口腔炎病毒(VSV)的包膜糖蛋白所取代。慢病毒载体没有特别限制，只要是通常基因转移中使用的载体，并且该载体具有用VSV-G进行了假型化的包膜蛋白，但是该载体不能产生具有复制能力的病毒粒子。制备慢病毒的方法没有特别限制，可以使用任意已知的方法。下面是一个典型的 方法。基于所谓的三重转染原则来制备慢病毒。因此，需提供三个载体，即，具有HIV辅 助功能的PCMV Δ R8. 2、编码β -半乳糖苷酶的pHxLacZWP转移载体、和表达VSV-G的载体。 所使用的这三个载体可以从加拿大公共卫生局(Dr. Kobinger)或宾夕法尼亚大学卫生系 (Dr. Wilson)得到。用来制备病毒的动物细胞没有特别限制，可以用任意动物细胞，只要是慢病毒制 备中通常使用的动物细胞。然而，从细胞培养、核酸转移便利性、病毒粒子产生率等观点来 看，其中优选293T细胞。当使用293T细胞制备慢病毒时，使用磷酸钙沉淀法(由Clontech提供)或 Effectene试剂(Qiagen(Valencia, CA)提供)。在这两种情况下，将VSV-G表达载体、 pCMV Δ R8. 2和pHxLacZWP转移载体的比例调节至3 1 2。当使用磷酸钙沉淀法时，将无 内毒素的载体混合物(10 μ g或180 μ g)添加到种植在平板(60mm或150mm)上的293T细胞 上。当将Effectene试剂添加到10 μ g的载体混合物中时，需一起加入脂质(40 μ L)、用于浓 缩载体的缓冲液(800 μ L)和增强剂(55 μ L)。当将Effectene试剂加入180 μ g的载体混合 物中时，需一起加入脂质(2. 9mL)、用于浓缩载体的缓冲液(58mL)和增强剂(4mL)。添加44 小时后，将介质加入每个平板中，随后培养16小时。用0. 45 μ m的过滤器过滤含有病毒样粒 子的培养介质，并采用常规方法测定滴度。无细胞的病毒上清液通过超速离心2小时(4°C， 28，000rpm)来浓缩，并在 DMEM(Dulbecco' s modified Eagle' s medium(Invitrogen, Calsbard, CA))中再悬浮。使用前，该悬浮液可以在_80°C下贮藏。需要指出的是，通过培 养被储备悬浮液(stock suspension)中的病毒感染的MT4或293T细胞30天，并检测培养 物中P24抗原的表达，来证明所获得病毒储备悬浮液不含有可复制的慢病毒。在JP2005-533485中披露了不同于上述方法的制备慢病毒的典型方法。待转移目标(外源)基因包括可编码控制头发生长或头发质量(颜色、天然垂直 或卷曲、密度等)蛋白的基因或其片段、编码激素或疾病相关蛋白质的基因或其片段，涉及 促进伤口愈合的基因或其片段。一个具体的例子是具有胰岛素样生长因子结合蛋白-5(IGFBP_5)基因，它源于卷 缩毛发的毛囊中的表达水平高于下述参考实施例2中源于直发的毛囊中的表达水平。根据 下述实施例6的说明，用本发明的包含IGFBP-5基因的慢病毒载体可以制作表达IGFBP-5 的转化毛囊，将转化毛囊移植进入实验对象可以使实验对象的毛发更卷曲。IGFBP-5在 1994年第一次被克隆，已经报道了其完整的核苷酸序列(Allander S. V. , Larsson C.， Ehrenborg E. , Suwanichkul A. , Weber G. , Morris S. L. , Bajalica S. , Kiefer Μ. C., Luthman H. , Powell D. R. , Characterization of the chromosomal gene and promoter for human insulin-like growth factor binding protein-5. J. Biol. Chem. 1994 Apr 8 ； 269(14) :10891-8)。就基因功能分析而言，待转移基因没有特别限制。然而，为了提高目标基因的功 能，目标基因优选与启动子序列转移。启动子序列的例子包括在所有情况下表达基因的序 列、组织特异表达基因的序列、药物诱导表达基因的序列。为了减小目标基因的功能，启动
7子序列优选与其它序列，例如，编码目标基因SiRNA的序列、反义序列、或编码目标基因产 物的显性阴性形式的序列一起转移，。这些片段涉及的核苷酸序列每个包含至少表达目标功能的区域。本发明使用的毛囊可以从人类的皮肤或动物，例如，小鼠、猪或猴子的皮肤收集， 优选来源于哺乳动物的毛囊，更优选来源于人类的毛囊。此处使用的术语“毛囊”狭义上是指头皮部分，包括(来自于毛干侧)髓质、内部根 鞘(IRS)、外部根鞘(ORS)、透明膜、结缔组织的毛囊。然而，除非另外规定，术语“毛囊”广义 上指来源于人类或其它动物皮肤的发根周围整体的组织(以下，称为“毛囊器官”)；也就是 说，整体组织至少包括毛发生长相关的器官，例如，毛干、真皮乳突、毛囊基质细胞、发根等。术语“包含毛囊的组织”是指组织整体，包括毛囊和周围皮肤组织(表皮、真皮、膜
寸J ο使用毛囊组织提高了移植的成功率。在优选状态下，通过修剪组织，使其成为如图 1所示的苹果形，可以进一步提高移植效率。从提高移植效率的观点来看，脂肪组织优选除 去至如图1所示的程度。当进行器官培养时，由于不必考虑在移植进入哺乳动物实验对象 过程中的损坏，毛囊组织优选尽可能彻底地修剪。术语“苹果形”是指大体上为圆柱形的毛囊器官，该毛囊器官上附着少量的外周组 织。包含毛囊的组织样品的大小可以按使用的毛囊组织的类型适当调节。就人类毛囊组织 而言，样品优选直径3 5_，长度5 15_。至于毛发周期，毛囊可以在生长期或退化期。由于从供体收集的皮片可以直接组 织培养，优选生长期。即使毛囊不处于生长期，也可以进行生长期诱导。具体来说，在一个 可能的过程中，通过蜡法将头发从皮肤上去除。毛发生长建立后，在适当的时间点收集包含 毛囊的皮片。通常，当使用小鼠作为实验对象时，收集的时间是3天 10天，优选5天 7 天，更优选6天。当使用其它哺乳动物作为实验对象时，根据毛发生长建立所需要的周期来 决定时间的选择。将收集的毛囊移植进入的动物，包括动物，例如，猴子、狗、猫、羊、马，和实验动物， 例如兔子、小鼠、大鼠。不必说，收集到的毛囊也可以移植进入人体。根据本发明，通过用病毒在体外转染含有毛囊的组织来实现利用病毒载体将基因 转移进入毛囊。由于病毒载体实现毛囊的直接转染，本发明的方法在操作性上比使用逆转 录病毒的传统方法更好，即，该传统方法是利用逆转录病毒将基因转移进入包装细胞，将转 基因包装细胞和小鼠皮肤组织片共同培养，从而将基因转移进入小鼠组织的方法(例如， 参照 US7067496)。外源基因转移至存在于毛囊的细胞中，该细胞最优选存在于隆突区的干细胞。也 优选源自干细胞的前体细胞。该干细胞对于在发育过程中提供细胞以及组织/器官的维持 起到作用。因此，基因转移进入干细胞后，在很长一段时间，转基因可以有效地表达并维持 高的表达水平，并可以防止转基因逃离。在一个特定的转染过程中，将已经制备的毛囊或含有毛囊的组织浸入慢病毒滴度 液中，接着在毛囊器官培养介质中培养，由此进行转化。介质的例子包括RPMI 1640 介质、William，s E 介质和 / 或 DMEM/HamF12(l 1) 介质。在介质中可以适当添加琼脂或凝胶。如果需要，在介质中也可以添加抗生素、氨基酸、血清、生长因子、生物提取物等。在一个典型培养过程中，将浸于慢病毒滴度液中的毛囊器官在5% C02、37°C下 在恒温箱中培养，使用无酚红的William’ s E介质(Sigma, St. Louis, MO)，在介质中加 入 2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)、10y g/mL 胰岛素(Invitrogen)、10 μ g/mL 转铁蛋白 (Invitrogen)、10ng/mL 硒酸钠(Sigma)、10ng/mL氢化可的松(Invitrogen)、抗生素和抗菌 药(Invitrogen)。转染的次数没有特别限制。然而，考虑到目标基因的拷贝数和由转染引起的毛囊 损坏，次数优选2 3次，更优选2次。为了防止由病毒载体引起的毛囊毁灭性的损坏，当施行2次转染时，优选在第一 次转染后培养15 20h后进行第2次转染。在使用腺病毒载体的基因转移方法中，已知用胶原酶处理毛囊可以提高目标基因 转移的效率(SaitO N. et al. , PNAS. 99(20) =13120-4, (2002))。然而，胶原酶处理可能会 破坏培养的细胞，必须小心地进行。根据本发明使用慢病毒载体的方法，不用进行任何胶原 酶处理，转染也可以有效进行。将由此制作的转化毛囊移植至目的动物(受体)。可以通过已知的方法将毛囊或 含有毛囊的组织移植至受体。在一个优选的方法中，受体的皮肤到筋膜开一个孔，通过该孔 加入毛囊器官培养介质，加入转化毛囊，用生物用瞬干胶使加入的毛囊固定在皮肤上。例如，当要将转化毛囊移植到实验室小鼠，在每个小鼠从背部皮肤到筋膜制成小 孔(直径1 2mm，深度10 20mm)，使孔轴平行于小鼠的毛干，通过小孔加入毛囊器官培 养介质，插入转化毛囊，插入的毛囊用生物用瞬干胶固定在皮肤上。通过这个过程，在移植 几个月后毛发可以再生，再生的毛发保持供体毛发的形态特征。从上述哺乳动物和人类中选择实验对象作为受体。为了防止移植组织的排异，受 体优选和毛囊供体动物为同种。至于人类，优选使用从相同实验对象上收集的毛囊。当使 用从其它实验对象收集的毛囊时，移植可以给予免疫抑制剂或其类似物来进行。在后一种 情况下，可以使用免疫缺陷动物，例如，SCID小鼠或裸鼠作为受体。本发明基因转移的方法也可以用于评估测试基因的功能。具体地说，将测试基因 用上述方法转移进入毛囊，通过将转化毛囊应用在实验动物上，还可以评估被转移的测试 基因所表达的蛋白或其类似物的效应。按照本发明的方法，测试基因可能转移进入毛囊的 干细胞。因而，测试基因的功能可以长时间表达，可以长时间评估该功能的影响。不必说， 也可以得到转化的实验动物。测试基因没有特别限制，可以使用任意上述基因。功能评估的方法可以通过根据 转基因的类型而通常选择使用的评估技术来进行。测试基因可以是已知的或未知的。然而， 优选功能未知的已知测试基因或未知的测试基因。特别是，当测试与包括形态特征在内的 毛发性质相关的基因时，该测试基因包括与包括形态特征在内的毛发性质相关的已知基 因、功能未知的已知基因、以及可以想象地与包括形态特征在内的毛发性质相关的未知基 因。测试基因的具体例子包括控制毛发周期的基因、和控制包括颜色和形态特征在内的毛 发性质的基因。当评估与包括形态特征在内的毛发性质相关的基因的功能时，例如，测定包括从 毛囊再生的毛发的形态特征在内的性质。特别是当毛囊还未移植到实验对象(受体)时，通过图像分析、在显微镜下使用测微计的测定、计数在毛囊器官中凋亡细胞等，对于毛囊器 官，在器官培养期间，在毛干生长(长度)、毛干直径变化(减小或增大)和毛囊弯曲特点方 面进行分析。移植后，直接评估或图像分析毛发性质，例如，从再生的毛根到毛干尖端的长 度、毛干直径(截面)、毛发生长速率、色调、卷曲度和其它性质。通过上述分析，可以评估毛发生长状态(生长速率、粗细等)、颜色、包括形态特征 (卷的或直的)的毛发性质和其它性质。此外，用上述分析的外源基因转移后，通过有效地并且经济地评估长好了的人的 毛发的生长、颜色和性质的改善，本发明方法可以用于毛发相关疾病的基因治疗。下面用实施例进一步详细地说明本发明，这些实施例不能被解释为限制了本发 明。实施例实施例1 将基因转移至毛囊中的方法(1)含有毛囊的皮肤组织样品的制备用穿刺活检法从白种人对象得到头皮样品，由St印hens Mssociates (S&A)(合约 实验室，Dallas)进行该手术。具体说，用穿刺活检法(穿刺针直径4mm)从一个对象得到二个皮肤组织块。将 组织块浸入4°C含抗菌剂的DMEM中运送。组织块到达后，马上在解剖显微镜下从每个组织 块中除去脂肪组织，并将其修剪成如图1所示，从而制备含毛囊并且具有苹果形(尺寸直 径3 5mm、长度5 15mm)的皮肤组织样品。(2)病毒载体的制备从加拿大公共卫生局(Dr. Kobinger)得到VSV-G (HIV类慢病毒载体，其包膜蛋白 用疱疹性口腔炎病毒糖蛋白(VSV-G)来取代)假型慢病毒，在使用前将其在-80°C下储存。下面说明制备病毒载体的典型方法。将三种载体(即，具有HIV辅助功能的pCMVAR8.2、编码β-半乳糖苷酶的 PHxLacZffP转移载体、和表达VSV-G包膜蛋白的pMD. G载体)同时转移至293T细胞中来制 备用VSV-G进行假型化的慢病毒载体。用239T细胞制备慢病毒时，用磷酸钙沉淀法(由 Clontech提供)或Effectene试剂(Qiagen提供，(Valencia, CA)) 在这两种情况下，将 VSV-G表达载体、pCMVAR8. 2和pHxLacZWP转移载体的比例调节至3 1 2。当使用磷 酸钙沉淀法时，将无内毒素的载体混合物(IOyg或180yg)添加到种植在平板(60mm或 150mm)上的293T细胞上。当将Effectene试剂添加到10 μ g的载体混合物中时，需一起加 入脂质(40 μ L)、用于浓缩载体的缓冲液(800 μ L)和增强剂(55 μ L)。当Effectene试剂加 入180 μ g的载体混合物中时，需一起加入脂质(2. 9mL)、用于浓缩载体的缓冲液(58mL)和 增强剂(4mL)。添加44小时后，将介质加入每个平板中，随后培养16小时。用0. 45 μ m的 过滤器过滤含有病毒样粒子的培养介质，采用常规方法测定滴度。无细胞的病毒上清液通 过超速离心 2 小时(4°C，28，OOOrpm)来浓缩，并在 DMEM(Dulbecco' s modified Eagle' s medium(Invitrogen,Calsbard,CA))中再悬浮。使用前，该悬浮液可以在_80°C下贮藏。应 当注意的是，通过培养被储备悬浮液中的病毒感染的MT4或293T细胞30天，并检测培养物 中P24抗原的表达，来证明所获得病毒储备悬浮液不含有可复制的慢病毒。(3)转化
制备慢病毒滴度为109TU/mL的液体。将每个上述制备的含毛囊的皮肤组织样品 浸入该滴度的液体中4小时，接着在37°C、5% CO2气氛下在毛囊器官培养介质中培养。培养19小时后，浸入相同滴度的液体中进行第二次转染。第二次转染后，继续在 相同介质中器官培养14 35天。毛囊器官培养介质补充有2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen，Carlsbad，CA)、10 μ g/ mL 胰岛素(Invitrogen)、10 μ g/mL 转铁蛋白(Invitrogen)、10ng/mL 硒酸钠(Sigma)、 10ng/mL氢化可的松(Invitrogen)和抗生素、抗真菌药(Invitrogen)的无酚红的Williams E 介质(Sigma，St. Louis, MO)(4)移植慢病毒转染后，用18G注射器(直径1mm)在免疫缺陷小鼠身上(重症联合免疫 缺陷，SCID)从背部皮肤到筋膜开孔(直径大约1mm，深度大约10 20mm)，使孔轴平行 于小鼠的毛干。通过小孔加入毛囊器官培养介质(大约25 μ L)，将转化毛囊插入孔中。用 生物用瞬干胶将插入的毛囊固定在皮肤上。通过该步骤，发现移植大约3个月后，大部分毛囊再生毛发(图2Β和2C)。由此再 生的毛发保持供体毛发的形态特征。参考实施例1 观察含毛囊的组织将用穿刺活检法收集到的毛囊组织样品根据头皮面积(直径2 3mm)(没有修 剪成苹果形)分成4等份。用与实施例1相似的方法转化被等份的部分，将每个被转化的 组织样品移植至小鼠。在该参考实施例中，移植的直发再生成卷发。由于小鼠皮肤张力使该毛发卷曲 (图 2A)。实施例2 转染次数对毛囊的影响为了评估慢病毒转染引起毛囊受损情况，分析了毛囊生长速率、在毛囊培养介质 中葡萄糖转变成乳酸的量、以及毛囊的凋亡状态。(1)毛囊的生长速率用显微照片和SPOT 软件(Diagnostic Instruments, Sterling Heights,MI)每周
测定一次毛囊生长速率。开始器官培养的第一周，比较了未转染的毛囊(对照组)、转染一次的毛囊、转染 二次的毛囊的生长速率。虽然区别不明显，但发现转染延缓了生长速率(图3)。之后，从 第2周开始，比较了转染一次和转染二次毛囊的生长速率。结果，相比于转染一次的毛囊， 转染二次的毛囊从14天开始生长减少，第21天没有发现生长。(2)培养基中葡萄糖转变成乳酸的量用2300STAT Plus 葡萄糖和乳酸分析仪(YSI, Inc.，Yellow Springs, OH)测定培
养基中葡萄糖的消耗量和乳酸的生成量。使用转染一次的毛囊和转染二次的毛囊，测定第4天、第14天、第21天的每日葡 萄糖转变成乳酸的量。任意测定时间下，两组间转变量没有发现区别(图4)。(3)毛囊的凋亡状态使用ApopTaq 原位细胞凋亡检测试剂盒(Chemicon，Temecula, CA)观察毛囊的 凋亡状态。
观察随着时间变化没有转染毛囊的凋亡状态。如图5A所示，红色区域表示随着时 间流逝，凋亡增加。特别在第14天，毛球处于退化阶段。基于该观察，比较没有转染的毛囊 (对照组)、转染一次的毛囊、转染二次的毛囊在第14天的凋亡状态。没有观察到凋亡状态 的区别(图5B)。如上所述，用慢病毒转染稍微影响毛囊的生长，但相比在器官培养时毛发周期中 的变化，其迟缓不明显。在到第14天这段时间内(S卩，进入退化阶段)，如下所述，优选进行
二次慢病毒转染。实施例3 基因转移效率的测定在按实施例1的方法器官培养14天结束后，用X-gal测定基因(β _半乳糖苷酶) 转移进入转化毛囊的基因转移效率，其中X-gal是β _半乳糖苷酶的底物。具体地说，转化毛囊用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗三次，并用0. 戊二醛固定。固 定的产物在用含有 5mM K3Fe(CN)6、5mM K4Fe (CN)6UmM MgCl2、0. 02% NP-40 和 0. 01 % 脱氧 胆酸的0. IM磷酸缓冲液(β Η7. 4)稀释的lmg/mL X-gal溶液中培养18小时。结果如图6所示。蓝色区域增大，则基因转移效率增加。观察到转染二次的毛囊 总体表现颜色(蓝色)增长，表明基因转移效率对转染次数的反应。接着，通过免疫组织化学分析，研究外源基因在毛囊中表达的位置。沿着水平或垂直方向切开转化毛囊，制成切片。使用半乳糖苷酶的抗体来分 析基因表达的位置。结果如图7 9所示。器官培养14天，在外部根鞘(ORS)和内部根鞘(IRS)观察 到红色(阳性)区域，随着毛球到观察点距离的增加，颜色浓度增加(图7)。分别制备沿着 垂直方向切开的切片，用角蛋白17的特定抗体分析基因表达，角蛋白17的特异抗体用作外 部根鞘(ORS)的标记物和半乳糖苷酶的抗体。黄色(阳性)区域表示两种蛋白质共同 表达，在毛囊全体ORS中观察到黄色区域(图8)。当使用黑色素细胞中黑色素(gplOO)抗 体HMB45和半乳糖苷酶抗体时，黄色(阳性)区域表示两种蛋白质共同表达，器官培养 7天时在出现黑色素细胞的基质区可以观察到黄色区域(图9)。实施例4 外源基因的拷贝数第二次转染24小时后，用DNeasy提取试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)从毛囊器官 抽提染色体DNA和载体DNA。用 TaciManw 探针(Applied Biosystems)和 ABI PRISM 7300序 列检测系统(AppliedBiosystems)测定外源基因的拷贝数，其中，该探针对于转移的β -半 乳糖苷酶特异。结果发现相比转染一次的毛囊，转染二次的毛囊中外源基因的拷贝数大大 增加(图10)。实施例5 移植了转化毛囊的小鼠的转基因分析移植大约3个月后，人类毛囊器官来源的毛发再生。毛发再生时，毛囊恢复，将毛 囊沿着垂直方向切开，制成切片。用半乳糖苷酶的抗体研究每个切片的基因表达位置。具体地说，移植大约3个月后，将再生的直发毛囊(图Ila)和卷发毛囊(图lib) 沿其垂直方向切开，制成切片。用角蛋白17的特异抗体和半乳糖苷酶的抗体分析基因 表达。结果发现半乳糖苷酶在内部根鞘(IRS)、外部根鞘(ORS)和髓质中表达。进一 步，当使用ΗΜΒ45和β -半乳糖苷酶的抗体时，在黑色素细胞出现的基质区中观察到表示两 种蛋白质共同表达的黄色(阳性)区域(图Ilc和lid)。移植三个月后也在毛囊角质形成
12细胞和黑色素细胞中发现外源基因蛋白质表达，表明外源基因转移进入了干细胞。相反，从未处理的毛囊再生的毛囊中没有观察到半乳糖苷酶阳性区域(图 lie)。然而，出乎意料地，在转染的人类毛囊附近的一些小鼠毛囊的毛球中观察到非常小的 β -半乳糖苷酶阳性区域(图Ilf人类毛囊(左下)，小鼠毛囊(中央))，表明已经转移了 外源基因的人类细胞中有一部分移向了小鼠毛囊。参考实施例2 毛囊中IGFBP-5表达的分析(1)人类毛囊的制备按照辛辛那提儿童医院医学中心的机构审查委员会(the Institutional Review Board of Cincinnati Children' s Hospital Medical Center)批准的协议，直发的白种 人对象、卷缩发(kinky hair)的非洲裔对象、卷发(curly hair)的西班牙裔对象，他们都 具有受试者同意书，用穿刺活检法(冲头直径6mm)从他们每个人获得2个头皮组织块。将 组织块浸入4°C含有抗菌剂的DMEM中运送。收集组织块的2小时内，在解剖显微镜下从每 个组织块中除去脂肪组织，分离毛囊。(2) IGFBP-5 表达的分析为了避免RNA的分解，分离后立刻将分离的毛囊浸入RNAlater(Qiagen的产品， Valencia, CA)中，用RNeasy micro kit(Qiagen的产品)提取总RNA。用寡脱氧胸腺嘧啶 (oligo dT)禾口莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶(Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase)通过常规方法合成cDNA。为了研究直发和卷缩发之间IGFBP-5表达水平 的区别，从应用生物系统公司(Applied Biosystems)(福斯特市，CA)购买基因特异探针和 TaqMan Gene Expression Assays (检测编号Hs00181213ml)。通过使用 ABI PRISM 7300 序列检测系统(应用生物系统公司的产品)进行实时定量RT-PCR。使用甘油醛-3-磷酸脱 氢酶(GAPDH的检测编号人类GAPDH VIC-MGB No. 4326317E)的表达作为内标。对于直发毛囊中IGFBP-5的基因表达水平，将基因表达水平相对评估为1的值。卷 缩发毛囊中IGFBP-5的基因表达水平大约是3. 5，该值显著高于直发毛囊中的表达水平(图 12)。实施例6 毛囊中IGFBP-5的过度表达引起的实验对象的转化(5)将IGFBP-5基因转移至毛囊中按实施例1 (2)中所述的步骤制备将IGFBP-5基因转移进入毛囊的慢病毒载体。使 用CMV作为表达IGFBP-5的启动子。使用下列引物通过人类皮肤cDNAs (Invitrogen的产 品)的PCR扩增来克隆IGFBP-5基因5’ :ATATATCTAGAGCCACCATGGTGTTGGTCACCGC3’ :ATATAGGATCCCTCAACGTTGCTGTC确定克隆基因的序列后，将基因转移进入慢病毒转移载体。为了过度表达IGFBP-5，将如参考实施例2分离的毛囊浸入慢病毒滴度液体 (1.6X109TU/mL)4小时，接着在37°C、5% 0)2气氛下，在毛囊器官培养介质(无酚红的 Williams E介质(Sigma公司的产品，St. Louis，MO)中进行培养，其中，该毛囊器官培 养介质补充有2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen的产品，Calsbard，CA)、10 μ g/mL胰岛素 (Invitrogen 的产品)、10 μ g/mL 转铁蛋白(Invitrogen 的产品)、10ng/mL 硒酸钠(Sigma 的产品)、10ng/mL氢化可的松(Invitrogen的产品)、抗生素和抗真菌药(Invitrogen的产
13品))。开始培养19小时后，将毛囊浸入相同滴度的溶液中进行第二次转染。使用半 乳糖苷酶(LacZ)基因作为与IGFBP-5基因对照。从而制成了用于表达具有CMV启动子的 LacZ基因的慢病毒滴度溶液，以上述相同方法用来处理毛囊。(2)移植用慢病毒转染后，将毛囊移植至免疫缺陷(严重联合免疫缺陷，SCID)小鼠，评估 再生毛发的毛发形态。具体地说，用18G注射器(直径1mm)在每只SCID小鼠背部从皮肤 到筋膜开孔(直径大约1mm，深度大约5 20mm)，使孔轴平行于小鼠的毛干。在小孔中 加入毛囊器官培养的介质(大约25 μ L)，接着在其中插入毛囊。插入的毛囊用生物用瞬干 胶(强力胶)固定于皮肤。在插入位置滴加2. 5%利多卡因(Iidocaine)，用来局部麻醉， 用粘膜(Tegaderm的产品，3M，0ntario，加拿大)覆盖小鼠整个背部包括移植点。确认粘膜 附着在小鼠背部至少48小时。(3)毛囊移植后毛发形态的变化当移植半乳糖苷酶过度表达的毛囊时，移植后几个月中，不论毛发类型(直 发或卷发)，毛发生长都保持了毛囊供体的毛发形态(图13Α和13D)。相比而言，当移植 IGFBP-5过度表达的直发毛囊时，再生毛发具有如移植卷发的毛发形态，发现某些毛发丝非 常卷曲(图13B、13C和图14)。当移植IGFBP-5过度表达的卷发毛囊时，卷曲度大大提高 (图 13Ε 和 13F)。用SEM分析再生毛发。具体地说，将再生毛发丝切成2 3mm段，每段固定在铝 样本支架上(Electron Microscopy Sciences 的产品，Hatfield, PA)。用 Hummer 溉射涂 膜机(Hummer Sputter Coater，Anatech产品，Hayward, CA)在蒸发的条件下用钯金合金 进行2分钟涂层，目测毛干的形状和毛发丝的横截面。用FEI Quanta 200SEM(FEI产品， Hillsboro，OR)在20kV工作电压下获得图像。如图15所示，发现从毛囊中半乳糖苷酶过度表达的白种人对象的直发的再 生毛发和供体毛囊的毛发的再生毛发具有相似的结构。具体地说，薄角质层互相重叠大约 4/5的部分，形成不整齐但致密的横向起伏的样式。还用SEM观察到从毛囊中IGFBP-5过 度表达的相同实验对象的毛囊中再生的毛发。此时，角质层密度低，没有规律地起伏。其形 态和非洲裔对象的卷缩发非常相似(Guohua Wei, Bharat Bhushan, Peter M. Torgerson, Ultramicroscopy 105 :248_266，2005)。
权利要求
一种制备转化毛囊的方法，包括利用病毒载体将基因转移至毛囊中，其特征在于所述方法包括提供用VSV G进行假型化的慢病毒作为病毒载体，并且用该慢病毒在体外转染毛囊。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于 所述毛囊源于人类。
3.一种转化毛囊，其特征在于是通过如权利要求1或2所述的方法制备的。
4.一种哺乳动物，其特征在于 被移植了如权利要求3所述的转化毛囊。
5.一种将基因转移至哺乳动物的方法，其特征在于 包括下列步骤⑴ ⑶步骤(1)构建慢病毒载体，该慢病毒载体含有目标基因，且用VSV-G进行了假型化； 步骤(2)用慢病毒载体在体外转染毛囊，从而制备转化毛囊；以及 步骤(3)将转化毛囊移植至动物中。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于 所述毛囊源于人类。
7.一种转化哺乳动物，其特征在于是通过如权利要求5或6所述的方法制备的。
8.一种评估测试基因的功能的方法，其特征在于 包括下列步骤⑴ ⑷步骤(1)将测试基因转移至用VSV-G进行假型化的慢病毒载体中； 步骤(2)用慢病毒载体在体外转染毛囊，从而制备转化毛囊； 步骤(3)将所述转化毛囊移植至测试动物中；以及 步骤(4)测定从所述毛囊再生的毛发的形状和性能。
9.一种用于将毛囊转化的试剂，其特征在于 包含用VSV-G进行假型化的慢病毒载体。
10.用VSV-G进行假型化的慢病毒载体在制造用于将毛囊转化的试剂中的用途。
全文摘要
本发明提供一种转化毛囊和一种通过转化毛囊将基因转移至哺乳动物的方法。一种制备转化毛囊的方法，包括利用病毒载体将基因转移至毛囊中，其特征在于，包括提供用VSV-G进行假型化的慢病毒作为病毒载体，并且用该慢病毒在体外转染毛囊。
文档编号C12N5/071GK101918011SQ200880125200
公开日2010年12月15日 申请日期2008年12月26日 优先权日2008年1月24日
发明者P·诗威理雅诺, 八谷辉 申请人:花王株式会社