专利名称：重组人Claudin18.2肿瘤疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明属于医药生物技术领域，具体涉及基因克隆、基因重组、外源基因 在原核细胞中的表达、目的蛋白的纯化、动物免疫实验、诱导抗血清的抑瘤实 验等技术，进一步涉及重组人Claudin18.2肿瘤疫苗及其制备方法。
二背景技术：
20多年以来，有关人类肿瘤免疫反应研究结果显示肿瘤细胞表达的抗原可 引起特异性细胞与体液免疫反应，但能够通过内源性免疫机制自发清除肿瘤的 病例却极为罕见。2004年，Giorgio Parmiani指出应用以肽为基础的疫苗在治疗 IV期黑色素瘤患者的临床I-II期过程中，仅有12%的患者在治疗后出现临床反 应。近年来，与上述方法相比，在使用自体树突状细胞(DCs)与肽或肿瘤裂 解物一同进行治疗的病例中，虽然患者产生疫苗特异性T细胞的概率增加，但 有关临床反应仍未得到显著改善。免疫系统不能引起肿瘤消退是肿瘤疫苗研究 中所面临的一个巨大困难。大量的研究证据表明，肿瘤存在着许多逃逸免疫系 统识别和攻击的机制，包括HLA-I类抗原和免疫共刺激分子的表达下调或丢 失；肿瘤抗原的表达下调、丢失或突变；肿瘤细胞分泌免疫抑制性可溶性因子; 肿瘤细胞膜上表达免疫抑制性分子；诱导具有免疫抑制功能的调节性T淋巴细 胞等。其中，肿瘤组织中的免疫反应抑制是肿瘤细胞逃逸免疫攻击的重要因素。 许多证据表明，存在于肿瘤组织中的特异性活化T淋巴细胞可发生凋亡。将体 外活化的肿瘤特异性T淋巴细胞输入肿瘤组织后，其杀伤活性消失。这些现象 都说明在肿瘤微环境中存在着保护肿瘤细胞的免疫逃逸机制。同时，还有许多具有免疫抑制功能的可溶性因子(TGF-0、 IL-IO、前列腺素E2、 Fas、 TRAIL 和RACS1等)和细胞膜分子(CTLA4、 B7-H1等)在肿瘤细胞表达上调。因 此，研究肿瘤组织内有关针对免疫攻击的逃逸机制对于提高肿瘤疫苗的治疗效 果具有重要意义。
1、 Claudins家族蛋白在肿瘤中的表达及其研究现状
紧密连接是细胞黏附形式的一种，主要存在于上皮细胞、内皮细胞间的连 接复合体中。它可维持机体内环境的稳定，保持上皮细胞的极性，影响细胞的 运动、增殖、分化，调节细胞功能的发挥。紧密连接分子由Occludin， Claudins 和连接黏附分子(Junctional adhesion molecules, JAMs) 3种完整的膜蛋白和闭 合小环蛋白(ZO-l， ZO-2和ZO-3)等外周胞浆蛋白组成，但对于它们的功能及 其调节目前研究尚少。近年已证实Claudin蛋白是构成紧密连接的骨架蛋白，其 异常表达可导致上皮细胞、内皮细胞结构破坏、功能受损，可能在多种疾病的 发病过程中起重要作用。到目前为止，已发现Claudin基因家族包括24个成员， 其序列的一致性为12.5%-69.7%，该结果表明它们在进化上呈功能高度保守性。 Claudin的分子质量为22-27kD。每一个Claudin分子均具有相同的结构，其肽链 包含有4个跨膜区、2个细胞外环形结构和位于胞质中的羧基端、氨基端。第l 和第4个跨膜区以及第2个细胞外环的氨基酸序列具有高度保守性。第4个跨膜区 对闭锁蛋白准确定位于紧密连接起重要的作用，若丢失将会导致闭锁蛋白的羧 基末端错位到细胞外间隙。两个细胞外环参与同种或异种Claudin蛋白之间的结 合，对紧密连接条带形成和离子通透选择性具有重要作用。
Claiidins广泛分布于正常组织和不同肿瘤组织，且存在差异性的表达。研 究其在肿瘤发生、生长和转移过程中的作用是近年的一个热点。近年，在胃癌 前病变和胃癌中也发现几种claudins蛋白表达异常，并与预后有关。现实生活中，
8胃癌、胰腺癌、食道癌以及转移和未转移卵巢癌免疫治疗中存在着手术切除复 发率高、化疗和放疗毒副作用强以及单抗治疗费用高的问题，迫切需要新的技
术产生，而通过对claudins在胃癌中异常分布和表达的研究，人们能更好得理解 胃癌的发生发展机制，从而有利于胃癌的诊断和治疗。
Claudins在胃癌前病变、胃癌各期和各型中的表达的研究是近年热点，其 中claudin-4、 claudin-7和ctaudin-18研究较多。
Claudin-4定位在人类染色体7ql 1 。 Lee等用免疫组化法研究发现E-cadherin 和claudin-4在69n/。的胃癌中均表达减少，且更常见于弥散型胃癌和分化低的胃 癌，认为两种蛋白作用类似，可能与胃腺体结构的破坏和腺体细胞的分化丧失 有关。Resnick等研究远端胃癌患者通过COX多变量分析，发现高强度claudin-4 的表达与胃癌患者生存期显著下降有关。此外，Cunningham等。通过免疫组化 方法发现claudin-4在36例肠化和14例不典型增生患者中均完全有表达，在98% 胃癌原位组织和100%的转移癌组织中也有表达，而仅有15%的正常胃黏膜组织 表达claudin-4，说明claudin-4在胃癌早期的致癌过程中也起了重要作用。
Johnson等，在Trefoil factor-l基因敲除的小鼠模型中通过基因序列分析发 现，daudin-7基因是胃癌中经常表达上调的基因，使用免疫组化方法发现，小 鼠和人类胃黏膜腺体不典型增生时，常过度表达clandin-7，而其周围正常胃黏 膜组织却不表达。其在肠化、不典型增生和胃癌中表达阳性率分别为30%、 80% 和70%，并且多在肠型胃癌中表达。Park等通过免疫组化和Westem blot方法发 现，claudin-7更常表达于肠化、腺瘤和胃癌中，而在47%的正常胃黏膜中不表 达，只有lP/。的肠型胃癌不表达claudin-7，而弥散型胃癌不表达率达到41%。所 以，研究人员认为claudin-7的表达参与了胃癌早期发生发展过程。Lkmi等在研 究食道鳞癌中发现，claudin-7的功能异常导致E-cadherin表达减少，从而增加了食道鳞癌的侵袭性。用siRNA方法使食道鳞癌细胞株中claudin-7失活，导致 E-cadherin表达减少。由于在弥散型胃癌中E-cadherin和claudin-7都较正常组织 和肠型胃癌明显减少，推测在胃癌中可能也存在这种机制。
2、 Claudin18.2简介
人源性Claudinl8基因具有2个不同的第一个外显子，所以可以产生两种亚 型Claudinl8.1和Claudin18.2。这两个分子的N端69个氨基酸的结构不同，其位 于第一个胞外区的环状结构内。Claudinl8的两种亚型分别在不同的组织中进行 转录扩增，其中，Claudinl8.1主要表达在肺组织，而Claudinl8.2则特异性表达 于胃组织。
2006年，Sanada等发现claudin-18基因在57。/。的胃癌中表达下调，通过免疫 组化分析，正常胃黏膜和十二指肠潘氏细胞的胞膜上表达claudin-18，但在一些 肠化和90%的胃腺瘤中，daudin-18表达减少，同时在肠型胃癌中表达减少较其 他型胃癌更常见，推测其可能参与了早期胃癌的发生。生存分析表明，胃癌中 claudin-18表达减少与晚期患者的预后差有关，认为claudin-18表达减少是胃癌 患者预后不佳的因素。
2008年，Sahin等研究证实77。/。原发性胃腺癌组织中存在Claudinl8.2的表 达，极为重要的是其中56%的组织表达量达到60%以上。与上述研究结果一致 的是肠型胃癌中Claudinl8.2蛋白的表达下调，而弥散型胃癌中Claudinl8.2蛋白 的表达较高。但是，胰腺、食道、卵巢等组织在正常状态下没有Claudinl8.2蛋 白表达，而相应的肿瘤组织中可以大量表达Claudinl8.2蛋白。所以，Claudin18.2 蛋白可以作为临床肿瘤诊断和治疗的耙位。但，目前尚未见以该蛋白为靶位研 制的肿瘤疫苗。
3、 治疗性疫苗研究进展近年来，针对人类自身蛋白的单克隆抗体在治疗急、慢性疾病的过程中显 示出了良好的效果。但是，造价的昂贵和使用上的不便限制了单克隆抗体的广 泛应用，因此，由被动地接受这种抗体蛋白转向寻求针对人类自身蛋白的主动 免疫疫苗，既用主动免疫的治疗方式替代被动免疫，成为蛋白药物的发展方向。 目前，治疗性疫苗的研究已成为一个热点，涉及很多疾病，如慢性病毒感染、 过敏、肿瘤、阿尔海默茨病、糖尿病、高血压、肥胖症以及风湿性关节炎等。 治疗性疫苗使人的免疫系统发生有利于患者的反应。大部分的疫苗可以分为两 大类 一类是诱导机体发生体液免疫反应，产生抗体；另一类是诱导机体发生 细胞免疫反应，产生细胞毒性T细胞(CTLs)。后一类治疗性疫苗主要用于肿 瘤和病毒感染性疾病的治疗。
绝大多数的预防性疫苗都是通过诱导抗体的产生来保护机体的，这就证明 通过诱导抗体来治疗感染性疾病是一种有效的治疗方法。与预防性疫苗相比， 治疗性疫苗的发展就要缓慢的多，直到近几年治疗性疫苗才看到成功的希望。 同时，单克隆抗体在治疗疾病方面所取得的巨大成功预示着能够在体内诱导抗 体产生的治疗性疫苗有着广阔的发展前景。实际上，已经有动物试验表明诱导 出一定水平的内源性特异性抗体来治疗疾病是可能的，如阻断TNF-a以治 疗炎症性疾病。
人源化的抗TNF-a单克隆抗体已经被证明在治疗类风湿性关节炎和 Crohn's病方面十分有效。目前己经有几种TNF-a的阻断剂上市，包括两种单 克隆抗体(infliximab, adalimumab)和一种受体阻断剂(etanercept)，它们正在 帮助成千上万的病人减轻痛苦，而且年收入达到20亿美元。所以阻断过量表 达的TNF-a能够达到治疗疾病的效果。在动物试验中已经证实通过主动免疫可 以特异性诱导出TNF-a的中和性抗体，而且诱导的抗体滴度足以治疗动物关节炎模型。
其他的动物试验表明可以通过诱导体内产生高滴度抗体来治疗以下疾病 针对血管紧张素的疫苗可以治疗高血压;针对IL-9的疫苗可以治疗病原体引起 的嗜酸性细胞增多症；针对IL-5的疫苗可以治疗哮喘；针对 N-methyl-D-aspartate receptor-l (NMDAR1)的疫苗可以治疗中风。另外，针 对一些性激素如人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotro- pin HCG)的 免疫可以降低妇女体内的激素水平而达到避孕效果；针对促性腺素释放激素 (GnRH)的疫苗可以用于治疗晚期前列腺癌；在晚期胰腺癌病人中，利用治 疗性疫苗诱导出针对胃泌素(gastrin)的抗体可以延长病人的生命。
那么，治疗性疫苗的研究中存在哪些问题呢？最近在针对阿尔海默茨病的 治疗性疫苗的研制过程所发生的情况似乎对这个问题做了回答。阿尔海默茨病 是一种看起来非常适合用治疗性疫苗进行治疗的疾病，这种病的发病过程长达 数年甚至数十年。如果能用治疗性疫苗诱导出持续时间较长的抗体的话，那么 无疑是一种理想的治疗方法，尤其是这种病人经常忘记吃药。
阿尔海默茨病的特征是大脑中斑块的沉积，这种斑块中含有AJ3-肽，这种 Ap-肽是从淀粉样蛋白的前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)衍生来的。 在编码APP的基因发生突变导致A(3-肽的生成增加的人群中，阿尔海默茨病在 早年就开始发生了。表达这种突变的APP的转基因小鼠大脑内有大量的斑块 沉积，这种斑块与阿尔海默茨病病人脑中发现的斑块相似。用Ap-肽加上强免 疫佐剂来免疫这种转基因小鼠会使小鼠脑中的斑块减少，小鼠的精神表现明显 好转。随后， 一种针对阿尔海默茨病的治疗性疫苗开始了临床试验，在临床I 期试验证明其有良好的耐受性后，包括300多名病人的临床II期紧跟着开始了 ， 但是没有想到的是6%的试验对象由于产生无菌性脑炎而被迫停止试验。随后研究证实，这种副作用与抗体的滴度没有关系，实际上， 一名没有产生抗体反 应的受试病人也得了无菌性脑炎。另外，在一名病人的大脑中发现有大量的淋 巴细胞浸润。这些研究结果与一种假说相一致，那就是在病人中发现的副作用
是由于A(3-肽特异性的T淋巴细胞引起的，而不是由于抗体引起的。这就要求 能够研制出不引起T淋巴细胞介导的自身免疫的第二代疫苗。那么，这种针对 阿尔海默茨病的治疗性疫苗的效果如何呢？在前面提到的临床II期试验中，在 诱导出抗Ap-肽抗体的病人中有一部分认知力的减弱确实推迟了，有一些病人 甚至在接受治疗的这一年中意识状态有了好转。如果在疫苗设计时能够解决其 安全性问题，那么在不久的将来，针对阿尔海默茨病的治疗性疫苗就会出现。
另一类稍有不同的疫苗对安全性的要求更低一些，那就是针对上瘾药物的 疫苗。在动物试验中针对可卡因和尼古丁的疫苗降低了这些药物在大脑中的水 平，消除了它们的成瘾症状，试验动物在接受了免疫后对药物不再依赖。在临 床I期试验中，可卡因疫苗被证明有良好的耐受性，并且可以诱导出良好的抗 体反应，现在，人们正在翘首以待它的有效性结果。
Claudinl8.2局限性表达于少数胃组织中，胃癌、胰腺癌、食道癌以及转移 和未转移卵巢癌组织中可以大量表达此蛋白。该蛋白第一个胞外区与其它 Claudin家族成员相比特异性强，而其余部分的蛋白质结构差异并不显著，所 以，将Claudin18.2的第一个胞外区蛋白作为革巴位来研制肿瘤疫苗具有很重要 的现实意义。
4、诱导自身抗体的理论研究
仅仅选择了靶分子构建一个自身蛋白的治疗性疫苗还需要诱导自身免疫系 统产生针对自身蛋白的抗体。要产生足够高滴度的特异性抗体以治疗相关疾病， 治疗性疫苗必须克服三个障碍T细胞耐受、B细胞耐受、在没有佐剂和抗原长效制剂的情况下诱导出抗体。众所周知，人体免疫系统主要是对外来入侵者 发动攻击的，而对机体本身是不攻击的，这可能是由于机体具有能够识别"非 我"与"自我"的能力。免疫系统的这种特性通常被称为耐受或无反应性。耐
受发生在B细胞和T细胞水平。 一般来说，T细胞耐受更严格一些。对许多抗 原来说，在发生T细胞耐受的同时，正常的B细胞株却在体内存在。实际上， 有三种机制导致了免疫耐受细胞株剔除，即特异性的淋巴细胞从淋巴细胞群 中被彻底剔除；免疫无能，即特异性的淋巴细胞存在，但其功能不能被激活； 免疫忽略，即具有免疫功能的淋巴细胞存在，但是由于没有遇到以抗原形式存 在的自身抗原，所以不能被激活。对T细胞来说，诱导耐受和无能的主要器官 是胸腺(中心耐受)，但诱导耐受也可以在外周进行。B细胞耐受主要在骨髓中 诱导，但也可在外周诱导。通常，对于普遍表达的丰富抗原的免疫耐受更容易 阐明。
在针对外来抗原的免疫反应中，T细胞和B细胞互相配合才能有效地产生 抗体当受到外来抗原免疫时，特异性的B细胞结合抗原，产生起始的激活信 号。另外，B细胞内吞抗原，在其表面呈现抗原肽和MHCII类分子的复合物。 通常，B细胞不能激活Th细胞。要激活Th细胞，树突状细胞是必不可少的， 树突状细胞摄取抗原，并在其细胞表面呈递抗原肽和MHCII类分子的复合物， 激活Th细胞。激活后的Th细胞识别B细胞表面呈现的抗原肽和MHCII类分 子的复合物，引起B细胞增殖、抗体的产生以及抗体类别的转换。如果因为免 疫耐受而缺乏Th细胞的协同作用，那么就不会产生抗体。在针对自身蛋白的 疫苗的设计过程中，如果将自身抗原与外源蛋白或多肽载体融合或偶联在一 起，就有可能绕过Th细胞耐受自身抗原特异性的B细胞就能够摄取该自身 抗原以及与其相连的载体蛋白，并在其表面呈现载体肽与MHCII类分子的复合物，由于Th细胞对载体蛋白没有免疫耐受，所以能够被激活，从而协同自 抗原特异性的B细胞产生针对自身抗原的特异性抗体。
与T细胞耐受相比，B细胞耐受要宽松得多。实际上，在许多情况下，自 身特异性B细胞在体内以正常的频率出现，如果受到抗原和Th细胞的共同作 用就会被激活。所以对许多可溶性自身蛋白来讲，体内存在其特异性B细胞株， 尤其当这种蛋白不是非常富余表达的时候更是这样。对于这类蛋白或多肽，将 其与载体蛋白相连，绕过T细胞耐受，就有可能产生有效的疫苗。
发明内容
综上所述，本发明的目的在于提供一种重组人Claudin18.2肿瘤疫苗及其制 备方法，以克服胃癌、胰腺癌、食道癌以及转移和未转移卵巢癌免疫治疗中手 术切除复发率高、化疗和放疗毒副作用强以及单抗治疗费用高等问题。
为了实现上述目的，本发明所釆用的技术方案是
一种重组人Claudinl8,2肿瘤疫苗，其序列为HMKSSQYIKANSKFIGEFD
上述重组人Claudin18.2肿瘤疫苗的制备方法，依次包括下述步骤
(1) rhHis-TT-Claudin18.2基因的克隆及原核表达载体的构建采用 RT-PCR方法获得Claudin18.2第一个胞外区基因片段(第28位氨基酸至第79 位氨基酸)，与丁丁83。.843基因片段连接后，插入pQE-30原核表达载体，转化大 肠杆菌；在大肠杆菌中获得高效表达，经纯化后得到His-TT-Claiidinl8.2蛋白。
(2) 重组蛋白表达将构建好的pQE-30-TT-Claudin18.2质粒转化大肠杆 菌，在大肠杆菌中获得高效表达，经亲和纯化后得到rhHis-TT-Claudin18.2蛋白。
(3) 融合蛋白的纯化和复性表达产物经裂菌、溶解包涵体、Ni-NTA亲 和层析柱的纯化，蛋白纯度可达80%以上。上述步骤(1)中rhHis-TT-Claudinl8,2蛋白的制备方法是采用RT-PCR 方法从人胃癌KATOIII细胞中获得Claudin18.2基因片段，将该片段连接 TT83,3基因片段后插入pQE-30载体中构建rhHis-TT-Claudin18.2表达质粒； 含有目的基因rhHis-TT-Claudin18.2的原核表达载体的构建及重组蛋白表达；表 达产物的鉴定；重组蛋白的纯化；rhHis-TT-Claudinl8.2蛋白免疫荷瘤小鼠可以 抑制小鼠体内胃癌MFC细胞和胰腺癌MPC-83细胞的生长。
本发明的重组人His-TT-Claudinl8.2肿瘤疫苗(rhHis-TT-Claudin18.2)，通 过免疫荷瘤小鼠产生抗Claudin18.2抗体，从而有可能为胃癌和胰腺癌的免疫治 疗提供一种新的蛋白质药物。
本发明的应用目的在于以Claudin18.2为耙点获得一种能够促使荷瘤小鼠 体内产生针对Claudin18.2分子的中和抗体的肿瘤疫苗，从而研究应用主动免疫 的方法进行肿瘤的免疫治疗。依照本发明的技术方案，釆用RT-PCR的方法获 得rhHis-TT-Claudinl8.2基因，构建原核表达载体，并在大肠杆菌中获得高效表 达。表达产物经溶解包涵体、Ni-NTA亲和层析柱的纯化，蛋白纯度可达80% 以上。纯化后的rhHis-TT-Claudin18.2蛋白免疫荷瘤小鼠后不仅能够产生可特异 性结合人胃癌KATOIII和胰腺癌PANC-1细胞以及小鼠胃癌MFC和胰腺癌 MPC-83细胞的抗体，同时还可以抑制小鼠体内胃癌MFC和胰腺癌MPC-83细 胞的生长。
通过体外实验发现，使用rhHis-TT-Claudin18.2肿瘤疫苗免疫获得的血清中 的抗体可以特异性与胃癌和胰腺癌等多种肿瘤细胞结合；正常胃的细胞和组织 与该肿瘤疫苗免疫后产生的抗体仅有少量结合；而该抗体与其余组织无明显结 合。所以，本发明所提供的产品的安全性高。rhHis-TT-Claudinl8.2肿瘤疫苗釆 用Ni亲和柱层析获得，采用梯度的方法将纯化得到的溶液复性，故制备方法易行。
四
图1是重组表达质粒pQE-30-TT-Claudin18.2的酶切鉴定，目的片段大小约 220bp (TT+Claudinl8.2);
图2是rhClaudinl8.2的表达，其中1:分子量蛋白质标准(最下面一条 10000Da)， 2:未诱导rhClaudin18.2, 3:诱导后的rhClaudin18.2， 4:裂菌沉 淀，5:裂菌上清，6:纯化后rhClaudin18.2， 7:复性后的rhClaudin18.2蛋白；
图3 rhClaudin18.2蛋白表达与纯化的免疫印迹鉴定，其中1:未诱导 rhClaudn18.2， 2:诱导后的rhClaudin 18.2， 3:裂菌沉淀，4:裂菌上清，5: 纯化后rhClaudin18.2， 6:复性后的rhCkudin18.2蛋白；
图4 rhClaudin18.2免疫血清与肿瘤细胞的结合，其中1: MFC， 2: MPC-83， 3:胰岛细胞癌组织裂解液，4: KATOIII， 5: PANC-1;
图5荷瘤小鼠抑瘤率，其中MFC为胃癌组(黑色为(:1肌^1118.2免疫组， 白色为生理盐水对照组)，MPC-83为胰腺癌组(黑色为Claudin18.2免疫组， 白色为生理盐水对照组)。
五具体实施例方式
为了更清楚的理解本发明，以下结合发明人完成的实施例对本发明作进一
步的详细描述。
以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细描述。
一、本发明所提供的重组人Claudinl8.2肿瘤疫苗(rhHis-TT-Claudin18.2)，
其氨基酸序列为
HMKSSQYIKANSKFIGEFDQWSTQDLYNNPVTAVFNYQGLWRSCVRESSGF TECRGYFTLLGLPAMLQAV二、上述重组人Claudin18.2肿瘤疫苗(rhHis-TT-Claudin18.2)制备方法，
依次包括以下步骤
(1) rhHis-TT-Claudinl8.2基因的克隆及原核表达载体的构建
按照GeneBank中人Claudin18.2的第一个胞外区基因序列，采用RT-PCR 常规方法，上游引入fcoRI酶切位点，下游引入酶切位点获得 Claudinl8.228aa.79aa与破伤风类毒素表位(即TT83Q-843表位氨基酸序列为 QYIKANS KFIGITE，以引发体内较强的细胞免疫反应，从而促进肿瘤疫苗更 好发挥作用)基因连接(TT咖-843基因片段的5'末端为B頻HI，3'末端为&oRI)， 插入pQE-30载体。连接产物转化感受态细胞DH5a，挑取单克隆培养过夜，提 取质粒，经酶切鉴定获得预期大小的插入片段(图1)，进行测序。测序正确的 质粒命名为pQE-30-rhHis-TT-Claudin18.2 。工程菌命名为pQE-30-rhHis-TT-Claudinl8.2/DH5a。
(2) 重组蛋白表达 挑取工程菌单菌落接种于5mLLB培养液(含Ampl00mg/L)中，37'C摇床
培养过夜，次日以l:100的比例转接到含Amp的LB培养液中，在37'C摇床培 养3h至对数生长中期(OD6。。为0.4 0.6)，加入终浓度为lmmol/L的IPTG, 继续培养4h。离心收集菌体。
对上述的表达产物进行鉴定
①SDS画PAGE
取30liL裂菌上清，加入30uL 2X载样缓冲液，混匀。另取其他样品加 入30uL水，混悬后再加入30UL2X载样缓冲液混匀。沸水中煮5min， 12000 rpm离心5 min，取10 u L上清加样于18%分离胶6%浓縮胶，上样后电压为60 V约20min，样品进入分离胶后电压升至100 V约4-5 h，用0.5%考马斯亮兰R-250振荡染色2-3 h，脱色直至背景清晰后制备干胶保存(参见图2)。 ②免疫印迹反应
SDS-PAGE结束后，按Bio-Rad产品说明，凝胶靠近阴极一侧，硝酸纤维 膜(NC膜)靠近阳极一侧，置转移缓冲液中(25 mmol/L Tris、 192 mmol/L Glycine、 20%甲醇)，100V恒压lh，将蛋白从凝胶电转移至NC膜上，电转 移结束后，取出NC膜，用洗涤液TBST(含0.02 mol/L pH7.4 TBS、0.4%Tween20) 室温洗3次，浸入封闭液(含2%BSA的TBST)中37°C， 1 h，洗涤液(TBST) 室温洗3次，加山羊抗人Claudin18.2抗体(Santa cruze公司)，37'C孵育1 h， TBST室温洗膜3次，加入兔抗山羊IgG-HRP 二抗(中杉公司)，37。C孵育1 h， TBST室温洗膜3次，再用TBS洗3次，NC膜浸入OPD显色液中，室温避光 显色10min，蒸馏水冲洗终止反应(参见图3)。 (3)融合蛋白的纯化和复性
取含pQE-30-TT-Claudin18.2重组质粒的菌株大量诱导菌液，5000 rpm离心 10min，收菌，超声裂菌；4°C, 12000rpm，离心20min，分别收集上清液和沉 淀。将沉淀用6mol/L尿素溶液重悬，4'C下静置溶解。将溶解的沉淀和上清分 别取样进行SDS-PAGE电泳，对目的蛋白的表达形式进行分析。在证实目的蛋 白以包涵体的形式表达后，用Ni-NTA柱亲和层析纯化所溶解的沉淀(包涵体)。 按1 g菌体加10 mL裂菌缓冲液的比例将菌体重悬，冰浴条件下进行超声裂菌。 12000rpm,离心15min，弃上清，1 g沉淀加10mL6M尿素，0.1MNaH2PO4， 0.01 MTris(pH 8.0)。 4"C搅拌2h， 12000rpm，离心15min，共离心2次，收集 上清待用。用6M尿素，0.1 MNaH2P04， 0.01 MTris (pH8.0)充分平衡Ni柱， 先用含10mmo1咪唑的6M尿素，0.1MNaH2PO4, O.OlMTris (pH8.0)洗脱 杂蛋白，再用含250mmol咪唑的6M尿素，0.1MNaH2PO4, 0.01MTris (pH8,0)洗脱目的蛋白。收集洗脱峰，纯化产物透析至2M尿素，0.1MNaH2PO4，0.01M Tris(pH 6.0)复性，终浓度lmg/ml。最后透析入0.01MTris(pH 6.0)中，PEG8000 浓縮后，用Bradford法测定蛋白浓度(参见图2)。 三、动物模型实验
(1) 小鼠分组与免疫方案
分组将24只BALB/c小鼠分成4组，于小鼠背部皮下按照口107个/只， 每组6只分别接种胃癌MFC和胰腺癌MPC-83细胞各2组。每个肿瘤细胞接 种2组荷瘤小鼠，待成瘤后，按照常规免疫方法分别注射rhClaudinl8.2或生理 盐水。在第4次免疫后10天摘眼球采血，测定血清中抗Claudin18.2抗体效价。 免疫方案背部皮下多点注射；rhClaudinl8,2: 40 W g/只+生理盐水总体积为200 txL/只，分别隔周注射；第4次，使用rhClaudinl8.2: 40 u g/只+生理盐水200 wL/只，腹腔注射。
(2) ￡03八法测定血清抗(:1&11&1118.2抗体效价
在第4次免疫后10天采血，收集抗血清，通过间接ELISA测定血清抗 Claudinl8.2抗体效价。每个样品均设6个孔。ELISA实验方法如下
所需溶液的配制a.包被缓冲液碳酸盐缓冲液取Na2C03: 0.32 g (终浓 度0.015 mol/L)， NaHC03: 0.59g(终浓度0.035 mol/L)，纯水定容至200 mL
(pH9.6)，有效期两周。b.洗涤液含0.5% Tween-20的PBS (pH7.4)。 c.封闭液含1% BSA的洗涤液。d.稀释液含0.5% BSA的洗涤液。e.底 物缓冲液Na2HP04* 12H20: 1.84 g，柠檬酸0.51g纯水定容至100 mL (pH 5.0)。 f.底物显色液OPD: 8mg， 3% H202: 30 u L。 h.终止液H2S04: lmol/L。
操作方法
20包被先取96孔ELISA板，将Claudinl8.2蛋白溶解于包被缓冲液中(0.5 ug/ml),按100nL/孔加入板孔中，4t:包被过夜；倒掉包被液，加入封闭液， 室温下封存2h;弃去封闭液，用洗涤液洗6次，每次2min;分别加入倍比稀 释的山羊抗人Claudin18.2 (500ixg/ml)和抗血清，100pL/ L，室温下孵育lh; 弃去抗体和抗血清，用洗漆液洗6次，每次3min;加入HRP标记的抗山羊二 抗，100uL/孔，室温孕育lh;弃去二抗，用洗涤液洗6次，每次3min;加入 底物显色液，100uL/ L，室温，显色10-20min;加入终止液，50uL/孔，终止 反应；酶标仪读数，测定没孔在490nm的吸光值。
(3) 免疫印迹反应测定血清抗Claudin18.2抗体的结合活性 分别取人胃癌KATOin和胰腺癌PANC-1细胞以及小鼠胃癌MFC和胰腺
癌MPC-83细胞按照3.1的方法进行SDS-PAGE电泳，结束后，按Bio-Rad产 品说明，凝胶靠近阴极一侧，硝酸纤维膜(NC膜)靠近阳极一侧，置转移缓 冲液中(25mmol/LTris、 192mmol/LGlycine、 20%甲醇)，100V恒压lh,将 蛋白从凝胶电转移至NC膜上，电转移结束后，取出NC膜，用洗涤液TBST (含0.02 mol/L pH7.4 TBS、0.4% Tween20)室温洗3次，浸入封闭液(含2% BSA 的TBST)中37'C， 1 h，洗涤液(TOST)室温洗3次，加荷瘤小鼠抗血清， 37。C孵育1 h， TBST室温洗膜3次，加入兔抗山羊IgG-HRP 二抗(中杉公司)， 37。C孵育l h， TBST室温洗膜3次，再用TBS洗3次，NC膜浸入OPD显色 液中，室温避光显色10min，蒸熘水冲洗终止反应(参见图4)。
(4) 抑瘤实验
每周观察小鼠体内抗体滴度变化，待观察到形成肿瘤组织块后隔天检测肿 瘤体积和小鼠体重。小鼠死亡时取出肿瘤组织称重，计算抑瘤率(参见图5)。
(5) 综上所述，本发明的效果如下① 设计并构建了 rhClaudin18.2融合蛋白疫苗。
② 通过动物实验证实rhClaudinl 8.2融合蛋白能够在荷瘤小鼠体内诱导出高 滴度中和抗体1:10000以上。
③ 该抗体(抗rhClaudin18.2多克隆抗体)可以与人KATOIII和PANC-1肿 瘤细胞以及小鼠胃癌MFC和胰腺癌MPC-83细胞相结合。
该蛋白作为肿瘤疫苗可抑制小鼠体内胃癌MFC和胰腺癌MPC-83细胞的生长。
2权利要求
1.一种重组人Claudin18.2肿瘤疫苗，其序列为HMKSSQYIKANSKFIGEFDQWSTQDLYNNPVTAVFNYQGLWRSCVRESSGFTECRGYFTLLGLPAMLQAV。
2. 获得如权利要求1所述的重组人Claudin18.2肿瘤疫苗的制备方法，其 特征在于，依次包括下述步骤-(1) rhHis-TT-Claudin18.2基因的克隆及原核表达载体的构建采用 RT-PCR方法获得Claudin18.2第一个胞外区基因片段(第28位氨基酸至第79 位氨基酸)，与^83。_843基因片段连接后，插入pQE-30原核表达载体，转化大 肠杆菌；在大肠杆菌中获得高效表达，经纯化后得到His-TT-Claixdinl8.2蛋白。(2) 重组蛋白表达将构建好的pQE-30-TT-Claudin18.2质粒转化大肠杆 菌，在大肠杆菌中获得高效表达，经亲和纯化后得到rhHis-TT-Claudin18.2蛋白。(3) 融合蛋白的纯化和复性表达产物经裂菌、溶解包涵体、Ni-NTA亲 和层析柱的纯化，蛋白纯度可达80%以上。
3. 如权利要求2所述的重组人Claudinl8.2肿瘤疫苗的制备方法，其特征 在于，依次包括下述步骤(1) rhHis-TT-Claudin18.2基因的克隆及原核表达载体的构建 按照GeneBank中人Claudin18.2的第一个胞外区基因序列，采用RT-PCR 常规方法，上游引入五②RI酶切位点，下游引入S"/1酶切位点获得 Claudin18.228aa.79aa与破伤风类毒素表位(即^83。.843表位氨基酸序列为 QYIKANS KFIGITE，以引发体内较强的细胞免疫反应，从而促进肿瘤疫苗更 好发挥作用)基因连接(TT83,3基因片段的5'末端为5fl附ffl， 3'末端为五②RI)， 插入pQE-30载体。连接产物转化感受态细胞DH5a，挑取单克隆培养过夜，提 取质粒，经酶切鉴定获得预期大小的插入片段，进行测序；测序正确的质粒命名为pQE-30-rhHis-TT-Claudin18.2，工程菌命名为 pQE-30-rhHis- TT-Claudin18.2麵5a其特异性氨基酸序列为TECRGYFTLLGLPAMLQAV (2)重组蛋白表达挑取工程菌单菌落接种于5mLLB培养液(含Ampl00mg/L)中，37t摇床 培养过夜，次日以l: 100的比例转接到含Amp的LB培养液中，在37'C摇床 培养3h至对数生长中期(OD6。。为0.4 0.6)，加入终浓度为lmmol/L的IPTG， 继续培养4h，离心收集菌体；表达产物的鉴定 SDS-PAGE取30uL裂菌上清，加入30HL 2X载样缓冲液，混匀。另取其他样品加 入30"L水，混悬后再加入30uL2X载样缓冲液混匀。沸水中煮5min， 12000 rpm离心5 min,取10u L上清加样于18%分离胶6%浓縮胶，上样后电压为60 V约20 min，样品进入分离胶后电压升至100 V约4 -5 h，用0.5%考马斯亮兰 R-250振荡染色2 -3 h，脱色直至背景清晰后制备干胶保存；免疫印迹反应SDS-PAGE结束后，按Bio-Rad产品说明，凝胶靠近阴极一侧，硝酸纤维 膜(NC膜)靠近阳极一侧，置转移缓冲液中(25 mmol/L Tris、 192 mmol/L Glycine、 20%甲醇)，100V恒压lh，将蛋白从凝胶电转移至NC膜上，电转 移结束后，取出NC膜，用洗涤液TBST(含0.02 mol/L pH7.4 TBS、 0.4% Tween20 ) 室温洗3次，浸入封闭液(含2°/。 BSA的TBST)中37°C， 1 h，洗涤液(TBST) 室温洗3次，加山羊抗人Claudin18.2， 37。C孵育1 h， TBST室温洗膜3次，加入兔抗山羊IgG-HRP二抗，37'C孵育lh， TBST室温洗膜3次，再用TBS洗 3次，NC膜浸入OPD显色液中，室温避光显色10min，蒸馏水冲洗终止反应。 (3)融合蛋白的纯化和复性取含pQE-30-TT-Claudin18.2重组质粒的菌株大量诱导菌液，5000 rpm离心 10min,收菌，超声裂菌；4'C， 12000rpm，离心20min,分别收集上清液和沉 淀。将沉淀用6mol/L尿素溶液重悬，fC下静置溶解。将溶解的沉淀和上清分 别取样进行SDS-PAGE电泳，对目的蛋白的表达形式进行分析。在证实目的蛋 白以包涵体的形式表达后，用Ni-NTA柱亲和层析纯化所溶解的沉淀(包涵体)。 按1 g菌体加10 mL裂菌缓冲液的比例将菌体重悬，冰浴条件下进行超声裂菌。 12000rpm，离心15min，弃上清，1 g沉淀加10 mL 6 M尿素，0.1MNaH2PO4， 0.01 M Tris(pH 8.0)。 4'C搅拌2h， 12000rpm，离心15min，共离心2次，收集 上清待用。用6M尿素，0.1 MNaH2P04， 0.01 MTris (pH8.0)充分平衡Ni柱， 先用含10mmo1咪唑的6M尿素，0.1MNaH2PO4， O.OlMTris (pH8.0)洗脱 杂蛋白，再用含250mmo1咪唑的6M尿素，0.1MNaH2PO4， O.OlMTris (pH 8,0) 洗脱目的蛋白。收集洗脱峰，纯化产物透析至2M尿素，0.1MNaH2PO4，0.01M Tris(pH 6.0)复性，终浓度lmg/ml。最后透析入0.01M Tris(pH 6.0)中，PEG8000 浓縮后，用Bradford法测定蛋白浓度。动物模型实验小鼠分组与免疫方案分组将24只BALB/c小鼠分成4组，于小鼠背部皮下按照lx^个/只， 每组6只分别接种胃癌MFC和胰腺癌MPC-83细胞各2组。每个肿瘤细胞接 种2组荷瘤小鼠，待成瘤后，按照常规免疫方法分别注射rhClaiidinl8.2或生理 盐水。在第4次免疫后10天摘眼球采血，测定血清中抗Claudin18.2抗体效价。 免疫方案背部皮下多点注射；rhClaudinl8,2: 40 u g/只+生理盐水总体积为200^L/只，分别隔周注射；第4次，使用rhClaudinl8.2: 40 H g/只+生理盐水200 liL/只，腹腔注射。ELISA法测定血清抗Claudin18.2抗体效价在第4次免疫后10天采血，收集抗血清，通过间接ELISA测定血清抗 (:1311出1118.2抗体效价。每个样品均设6个孔。ELISA实验方法如下所需溶液的配制a.包被缓冲液碳酸盐缓冲液取Na2C03: 0.32 g (终浓 度0.015 mol/L)， NaHC03: 0.59g(终浓度0.035 mol/L)，纯水定容至200 mL(pH9.6),有效期两周。b.洗涤液含0.5% Tween-20的PBS (pH7.4)。 c.封闭液含1% BSA的洗涤液。d.稀释液含0.5% BSA的洗涤液。e.底 物缓冲液Na2HP04*12H20: 1.84 g，柠檬酸0.51g纯水定容至100 mL (pH 5.0)。 f.底物显色液OPD: 8mg， 3% H202: 30 uL。 h.终止液H2S04: lmol/L。操作方法包被先取96孔ELISA板，将Claudinl8.2蛋白溶解于包被缓冲液中(0.5 ug/ml)，按100uL/孔加入板孔中，4。C包被过夜；倒掉包被液，加入封闭液， 室温下封存2h;弃去封闭液，用洗涤液洗6次，每次2min;分别加入倍比稀 释的山羊抗人Claudin18.2 (500ug/ml)和抗血清，100wL/孔，室温下孵育lh; 弃去抗体和抗血清，用洗涤液洗6次，每次3min;加入HRP标记的抗山羊二 抗，100nL/孔，室温孕育lh;弃去二抗，用洗涤液洗6次，每次3min;加入 底物显色液，100uL/孔，室温，显色10-20min;加入终止液，50"L/孔，终止 反应；酶标仪读数，测定没孔在4卯nm的吸光值。免疫印迹反应测定血清抗Claudin18.2抗体的结合活性分别取人胃癌KATOIII和胰腺癌PANC-1细胞以及小鼠胃癌MFC和胰腺癌MPC-83细胞按照3.1的方法进行SDS-PAGE电泳，结束后，按Bio-Rad产 品说明，凝胶靠近阴极一侧，硝酸纤维膜(NC膜)靠近阳极一侧，置转移缓 冲液中(25mmol/LTris、 192 mmol/L Glycine、 20%甲醇)，100V恒压lh，将 蛋白从凝胶电转移至NC膜上，电转移结束后，取出NC膜，用洗涤液TBST (含0.02 mol/LpH7.4 TBS、0.4% Tween20)室温洗3次，浸入封闭液(含2% BSA 的TBST)中37。C， 1 h，洗涤液(TBST)室温洗3次，加荷瘤小鼠抗血清， 37t孵育1 h， TBST室温洗膜3次，加入兔抗山羊IgG-HRP 二抗(中杉公司)， 37'C孵育1 h， TBST室温洗膜3次，再用TBS洗3次，NC膜浸入OPD显色 液中，室温避光显色10min，蒸馏水冲洗终止反应。 抑瘤实验每周观察小鼠体内抗体滴度变化，待观察到形成肿瘤组织块后隔天检测肿 瘤体积和小鼠体重。小鼠死亡时取出肿瘤组织称重，计算抑瘤率。
全文摘要
本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种重组人Claudin18.2肿瘤疫苗及其制备方法。本发明要克服胃癌、胰腺癌、食道癌以及转移和未转移卵巢癌免疫治疗中手术切除复发率高、化疗和放疗毒副作用强以及单抗治疗费用高等问题。所采用的技术方案是一种重组人Claudin18.2肿瘤疫苗，其序列为HMKSSQYIKANSKFIGEFDQWSTQDLYNNPVTAVFNYQGLWRSCVRESSGFTECRGYFTLLGLPAMLQAV。通过动物实验证实rhClaudin18.2融合蛋白能够在荷瘤小鼠体内诱导出高滴度中和抗体1∶10000以上；该抗体可以与人KATOIII和PANC-1肿瘤细胞以及小鼠胃癌MFC和胰腺癌MPC-83细胞相结合；该蛋白作为肿瘤疫苗可抑制小鼠体内胃癌MFC和胰腺癌MPC-83细胞的生长。
文档编号C12N15/70GK101584860SQ200910022198
公开日2009年11月25日 申请日期2009年4月27日 优先权日2009年4月27日 公开号200910022198.发明者镭 刘, 松 张 申请人:西安杰诺瓦生物科技有限公司