专利名称：一种合成苦马豆素的棘豆埃里格孢菌fel6-as2及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物技术领域，涉及一种新的棘豆埃里格孢菌(A/^e7力'w's or/^o/^s)，具体涉及一种能够合成疯草毒素一一苦马豆素(Swainsonine， SW) 的棘豆埃里格孢菌FEL6-AS2，还涉及该菌株的用途。
背景技术：
疯草(Locoweed)是豆科棘豆属(Qx^ra;^)和黄芪属C4Wraga/ws)有毒植物的 总称，也是世界范围内危害草原畜牧业最严重的一类毒草。在我国，疯草广泛 分布于西北、华北和西南的广大草原，危害面积达1100万hm2，占全国草场面 积的2.8%。茎直黄芪是我国疯草黄芪属的一种，主要分布于西藏地区；茎直黄 芪主要危害马、羊、牛、骆驼等家畜，不仅引起中毒死亡，还会导致母畜繁殖， 公畜发情，影响畜种改良。每年都有很多家畜因采食该草而中毒，严重危害我 国西部地区草原畜牧业的发展。
茎直黄芪的主要毒性成份是苦马豆素(Swainsonine， SW)，化学名称为1，2，8-三羟基八氢吲哚里西啶(trihydroxyoctahydro-indolizidine)。苦马豆素可抑制哺乳 动物细胞的溶酶体a-甘露糖苷酶和高尔基体甘露糖苷酶II的活性，导致低聚糖 代谢和糖蛋白合成障碍，从而引起动物组织器官功能紊乱。动物采食茎直黄芪 等疯草后，会发生中毒，导致大批家畜死亡，给畜牧业造成巨大损失。
茎直黄芪是豆科草本植物，其营养价值丰富。如果能采取相应的措施将毒 草变为可利用的牧草资源，既可以保护生态环境，防止草地退化，又可促进当 地畜牧业的发展，对社会、牧民、生态都有着深远的意义。近年来，在茎直黄芪的危害、有毒成分、毒理机制、防除和利用等方面的 研究取得了重要进展，但迄今还没有控制茎直黄芪蔓延和防止动物采食茎直黄 荒中毒的特效方法，致使动物茎直黄芪中毒问题日趋严重，成为草原畜牧业的 大患。对于茎直黄芪中毒病的治疗目前尚无特效疗法，关键在于预防。其预防 和治疗方法与其他疯草相同。国内学者曾尝试用人工挖除、焚烧、应用除草剂、 浸泡、生物控制、生态控制、免疫注射、词料添加剂、投放缓释丸等。但仍然 在特定地区或季节实施，尚未大面积推广应用，对主要毒性成份的合成机理和 导致动物中毒的分子机理仍不清楚，因而不能从根本上放出动物疯草中毒病。
研究发现， 一些植物中的有毒成分与其内部寄生的内生真菌、病原真菌或 污染的霉菌有关，通过控制植物中的这些微生物可以防止动物中毒。如麦角菌 寄生在牛尾草和黑麦草中，产生很高含量的麦角生物碱，致使家畜中毒，造成 严重的经济损失。人们通过改良这种牧草，推出不含麦角菌的牛尾草和黑麦草， 从根本上解决了动物牛尾草和黑麦草中毒的问题。通过抑制茎直黄芪中合成苦 马豆素的内生菌的生长可以降低疯草毒素的含量，不仅能从根本上解决动物茎 直黄芪中毒问题，还可以为防治动物疯草中毒病提供借鉴，对草原毒草的生物 学控制利用和草原生态学研究起到积极作用，具有很好的经济效益和社会效益。
苦马豆素具有抗肿瘤作用，不仅能抑制实体瘤的生长和转移，具有免疫刺 激功能和抗辐射作用，而且能减轻化疗和放疗对机体造成的不良影响，从而促 进机体的抗肿瘤免疫功能，加拿大已用于III期临床试验。苦马豆素具有开发抗 肿瘤新药的良好前景，然而苦马豆素的来源却十分匮乏，价格昂贵，远远不能 满足人们研究和临床医疗的需要。因此，挖掘苦马豆素的资源，开辟生产苦马 豆素的新途径是解决苦马豆素匮乏的关键环节。
发明内容
针对现有技术中存在的问题与缺陷，本发明的目的在于提供一种合成苦马 豆素的棘豆埃里格孢菌，它能有效的合成苦马豆素，为彻底解决茎直黄底的毒 害奠定基础，也为研制抗癌新药提供材料。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下
一种合成苦马豆素的棘豆埃里格孢菌(f/^e^j\s& ozytropj's) FEL6-AS2， 于2008年10月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNo: M 208145，保藏地址中国武汉武汉大学。
本发明还有一个目的是提供棘豆埃里格孢菌FEL6-AS2在合成苦马豆素中的应用。
本发明还有一个目的是提供棘豆埃里格孢菌FEL6-AS2在制药中的应用。 本发明还有一个目的是提供棘豆埃里格孢菌FEL6-AS2在制备预防动物疯草 中毒药物中的应用。
棘豆埃里格孢菌FEL6-AS2菌株寄生于茎直黄芪的叶、茎、种的组织内部， 与茎直黄芪共生并且不会引起茎直黄芪发生病害，经体外培养发现FEL6-AS2能 够产生SW，说明其参与着茎直黄芪中SW的生物合成，与茎直黄宾的毒性紧密相 关，通过抑制FEL6-AS2在茎直黄贫中的生长可以降低茎直黄芪毒性的目的。
棘豆埃里格孢菌FEL6-AS2菌株经体外培养能够大量繁殖扩增，并能在人工 培养的条件下合成抗肿瘤活性物质SW，为研制抗癌药提供了新材料。
图1 FEL6-AS2菌株的单个菌落形态图。
图2 FEL6-AS2菌株的分生孢子及分生孢子梗的显微镜图。图3利用MEGA 4. 0软件构建系统进化树结构图。 图4 FEL6-AS2菌丝提取物的气相色谱图。
具体实施例方式
以下结合发明人给出的附图和试验例及具体实施例来进一步说明本发明菌 棘豆埃里格孢菌FEL6-AS2的有益效果和制备方法。
实施例1:菌棘豆埃里格孢菌FEL6-AS2的分离筛选
1) 采自西藏日喀则草原上生长的整株茎直黄芪，用去离子水对其表面进 行清洗后，用灭菌的镊子将植物的叶、茎、种分离，然后将叶、茎、种分别用 纱布包扎，进行表面消毒；
2) 用灭菌的滤纸将经表面消毒的植物组织上的水分吸去，再用灭菌的剪 刀将叶、茎、种分别剪成3 mr^大小的组织块，然后分别用灭菌的镊子将各组 织块接种于水琼脂培养基表面，置培养箱中18 'C培养；
3) 待菌丝从组织块周围长出时，挑取菌落边缘的菌丝接种于富集培养基 表面，置18 'C培养箱中进行富集培养；收集富集培养的真菌菌丝，提取其生物 碱并应用薄层色谱法和气相色谱法检测，用苦马豆素标准品作对照，检测菌丝 生物碱中是否含有苦马豆素，最后筛选得到可以合成苦马豆素的棘豆埃里格孢 菌FEL6-AS2。
所述表面消毒的方法为首先用体积分数为75 %的乙醇浸泡20 s;再用 有效氯含量为l ^的次氯酸钠溶液浸泡叶2min，浸泡茎、种4min;最后用灭 菌的去离子水冲洗2次，每次lmin。
所述的富集培养基的组分及配比为葡萄糖20g， MgS04*7H20 0.5g， KC1 0. 5g， FeS04*7H20 0. Olg， K2HP04 lg，大豆蛋白胨5 g，蒸馏水1 000 mL，琼 脂13g， pH为6 6.5， 12rC高压灭菌 。实施例2:菌棘豆埃里格孢菌FEL6-AS2的鉴定
1、形态学特征
FEL6-AS2菌株的菌落呈圆形，起初为白色，随着培养时间的延长逐渐转变 为淡黄色、褐色、黑褐色，中央略突起(图1)。菌丝体具横隔，无纵隔，部分 老龄菌丝生出分生孢子梗，少有分支。分生孢子及分生孢子梗具横隔，无纵隔， 分生孢子的横隔膜较厚，横隔数为1 4个不等，孢子呈棒状，近圆柱形，有的 呈卵圆形，分生孢子大小为20 80 "mX6 12 um(图2)。
2)培养学的特征
该菌株在在PDA、 PCA、 Cz即ek等培养基上生长非常缓慢，其生长速度分别 为0.57， 0. 49和0.47 mm/d，最适生长温度为18°C，当温度高于25。C时生长 受到抑制。
所述的PDA、 PCA、 Czapek培养基的组分及配比为
PDA培养基:去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂13g，蒸馏水1000mL， pH 为6 7， 121。C高压灭菌20min。
PCA培养基去皮马铃薯20g，胡萝卜20g,琼脂13，蒸馏水1000 mL， pH 为6 7， 121。C高压灭菌20min。
Cz即ek培养基葡萄糖20g， MgS04. 7H20 0. 5g， KC1 0. 5g， FeS04. 7H20 0. Olg， K2HP04 lg， NaN03 2g，蒸馏水1000mL，琼脂13g， pH为6 6. 5， 121。C高压灭 菌20 min。
3)分子生物学鉴定
FEL6-AS2菌株ITS-5. 8S rDNA序列已在GenBank公开，登录号为EU604069。 将FEL6-AS2菌株的5.8S rDNA-ITS序列用BLAST与Genbank中的5.8SrDNA-ITS序列进行同源性比较，以假球壳科(户/eo^oraceae)的链格孢属 (y^er"aWa)、匍柄霉属(6tewp //Mm)、假格 包属(7Wmtya)、埃里格孢属 (五m^〃Wa)、细基格孢属(t//oc/aAwm)、突脐蠕孢属(五xsera/w7ww)、平脐蠕 孢属(Ajw/fln; )、弯孢属(Cwrvw/an'a)、内脐蠕孢属(Z>ec/w/era)等菌株序列 构建系统发育树。应用ClustalX 1.83 version和MEGA 4.0软件采用邻接法 (neighbor-joining,NJ)构建系统发育树(图3)， FEL6-AS2菌株的遗传进化距离 与埃里格孢属最近，与五w6e〃/w'a fw^ra/^ strain DA0M 237697同源性最高， 说明该菌在分子系统发育分类学上为棘豆埃里格孢。
根据形态学特征、培养特性、系统发育分析，并结合文献报道，确定该菌 为棘豆埃里格孢菌FEL6-AS2。
试验例1:菌棘豆埃里格孢菌FEL6-AS2合成苦马豆素试验 将FEL6-AS2菌株接种于富集培养基表面，置18 。C培养30d，然后将菌丝 刮下，50 。C烘干，然后称量菌丝。将干燥的菌丝研磨成粉后，用滤纸将其包裹 放入索氏提取器中用甲醇70 "C加热提取24h，将甲醇提取液浓縮挥干得残渣。 用去离子水将残渣溶解，加入5cm长的AG 50W阳离子交换树脂柱。先用去离 子水洗脱树脂柱，再用氨水洗脱树脂柱，收集氨水洗脱液，并将其浓縮挥干， 用甲醇将SW标准品、FEL6-AS2中提取的生物碱溶解，并分别点样于硅胶薄层 板上，用薄层色谱法检测。若菌丝生物碱经薄层色谱分离后具有与SW标准品 的颜色和位移相同的斑点，即可确定其对应的真菌可以合成SW。应用气相色谱 法检测菌丝中SW的含量为35.28吗/g，其气相色谱图如图4所示。 试验例2:几种杀菌剂对棘豆埃里格孢菌FEL6-AS2抑菌试验 1)供试菌棘豆埃里格孢菌FEL6-AS2。2) 供试杀菌剂50%多菌灵，70%甲基托布津，70%百菌清，50%福美双， 45%万霉灵，25%丙环唑。
3) 抑菌试验采用菌丝生长速率测定法测定不同杀菌剂对FEL6-AS2的生长 抑制作用。在15mL的灭好菌的PDA培养基中分别加入不同的杀菌剂，配制成含 不同杀菌剂的培养基平板。然后将直径为6 mm的菌苔接入含有杀菌剂的培养基 平板上，置于18 'C下培养，以不加杀菌剂的处理作对照。培养15d后测量菌落 生长直径，计算生长抑制率，每个处理重复6次。为了测试不同浓度杀菌剂对 FEL6-AS2的影响，每种杀菌剂采用2种浓度:500吗/mL或l 000jig/mL。菌丝的 生长抑制率按下面公式进行计算
菌丝生长抑制率(％)=(对照菌落生长直径_处理菌落生长直径)/对照菌落
生长直径xioo。
4) 不同杀菌剂对病原菌生长的抑制作用6种供试杀菌剂对棘豆埃里格孢 菌FEL6-AS2的菌丝生长均有一定程度的抑制作用(表1)。其中25 %丙环唑是6种 供试杀菌剂中效果最好的，当供试浓度为500吗/mL或l 000ug/mL时，25 %丙 环唑对FEL6-AS2菌丝的生长都有很强的抑制作用；70 %甲基托布津的抑制作用 略低于25%丙环唑，但仍可以达到比较好的效果，随着浓度的升高，抑制作用 越明显；50%多菌灵，45%万霉灵的效果较差，且不同浓度之间的抑制效果无 显著性差异；70 %百菌清和50 %福美双抑制率最弱。。
表l 不同杀菌剂对棘豆埃里格孢菌FEL6-AS2菌丝生长的抑制作用
供试杀菌剂 浓度(ug/mL) 菌落直径(mm) 抑制率(％)
对照组(CK) 5
50%多菌灵 500 14.7 16
50%多菌灵 1000 14.2 18.86
70%甲基托布津 500 9.6 45.14
70%甲基托布津 1000 8.4 52
70%百菌清 500 15.5 11.43
970 %百菌清100015.213.14
50 %福美双50016.74.57
50 %福美双00016.46.29
45 %万霉灵50013.721.71
45 %万霉灵100012.230.29
25 %丙环唑5007.557.14
25 %丙环哇10006.761.7权利要求
1.一种合成苦马豆素的棘豆埃里格孢菌(Embellisia oxytropis)FEL6-AS2，保藏号为CCTCC NoM 208145。
2. 权利要求1所述的棘豆埃里格孢菌FEL6-AS2在合成苦马豆素中的应用。
3. 权利要求1所述的棘豆埃里格孢菌FEL6-AS2在制药中的应用。
4. 权利要求1所述的棘豆埃里格孢菌FEL6-AS2在制备预防动物疯草中毒 药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种合成苦马豆素的棘豆埃里格孢菌FEL6-AS2，于2008年10月8日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号CCTCC NoM 208145。该菌株的菌落呈圆形，起初为白色，随着培养时间的延长逐渐转变为灰白色、灰黑色、黑色，中央突起。菌丝体具横隔，无纵隔，部分老龄菌丝生出分生孢子梗，分生孢子梗有分支。分生孢子及分生孢子梗具横隔，无纵隔，分生孢子的横隔膜较厚，横隔数为1～4个不等，孢子呈棒状，近圆柱形，有的呈卵圆形，分生孢子大小为20～80μm×6～12μm；该菌株从茎直黄芪的叶、茎、种子中经人工分离、筛选而得，具有合成疯草主要毒素苦马豆素(SW)的功能。
文档编号C12N1/14GK101597572SQ20091002186
公开日2009年12月9日 申请日期2009年4月3日 优先权日2009年4月3日
发明者余永涛, 王建华, 王建娜, 耿果霞, 赵清梅 申请人:西北农林科技大学