专利名称：一种检测甲型h1n1流感病毒的试剂盒及专用引物和靶序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测流感病毒的试剂盒，具体涉及一种检测甲型H1N1流 感病毒的试剂盒、专用引物和该弓I物所针对的靶序列。
背景技术：
自2009年4月中下旬起，源自北美的甲型H1N1流感疫情开始在全球多个 国家蔓延，截至北京时间六月九日十四时，世界卫生组织确认全球七十四个国 家和地区共有25288例甲型H1N1流感确诊病例，其中包括死亡病例139例。 至此，中国内地共报告101例甲型H1N1流感确诊病例。甲型H1N1流感已对 人类健康产生严重威胁，严重危害了人们健康，并造成重大的经济损失。快速、 准确地进行流感病毒的检测是防控甲型H1N1流感的关键， 一方面为防治提供 依据和争取时间，另外可以减轻或消除社会恐慌心理。因此快速、敏感和特意 的检测试剂盒的研制具有重大应用价值和社会意义。
2000年，日本学者Notomi等发明了一种新的恒温核酸扩增方法(NotomiT。 等，Nucleic Acids Res， 2000, 28， E63)，即环介导等温扩增法(Loop-mediated isothermal amplification),其特点是针对耙基因的多个区域设计特异引物，利用 一种链置换DNA聚合酶在等温条件65'C下进行反应，通过引物独特的反转设 计，对自身进行链置换扩增，通常60分钟内即可完成反应。不需要模板的热变 性、退火、长时间温度循环等过程。其扩增效率较高，可在60分钟内将耙序 列扩增109 101()倍， 一般能检测到10拷贝以下的样品。由于其引物分别针对多 个不同的区域，任何一个不匹配反应就无法进行，因此出现非特异性扩增的情 况极少。相关方法已用于早期SARA疾病的诊断和肺炎结核杆菌等检测(PoonL丄.等，Clin Chem， 2004， 50(6): 1050-1052; Boehme， C。C等，Clin, Microbiol。， 2007， 45， 1936-1940)。通过逆转录酶环介导等温扩增法(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification )已运用于HIV-l病毒(Kelly A,等，Journal ofVirological Methods,2008， 151,264-270)，禽流感病毒H5、 H5N1和H9等的快 速诊断(Imai M,等，Vaccine，2006，24 (44-46): 66 79-6682; Imai M.等，J Virol Methods, 2007， 141(2): 173-80; ChenHT等，J Virol Methods，2008，151(2):200-3 )。 该方法对于低浓度的病毒数量或无症状的病毒携带者的检测比RT-PCR好，目前 尚未见到利用反转录和等温扩增一体化检测甲型H1N1流感病毒核酸试剂盒的 报道。
目前，检测甲型H1N1流感病毒使用的试剂盒主要利用PCR方法和实时定量 RT-PCR方法。PCR方法灵敏度和特异性均要低于环介导等温扩增法，且操作步 骤繁琐，反应时间长；而实时定量RT-PCR方法检测需要昂贵的实时定量PCR仪， 且结果需要计算机分析。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测甲型H1N1流感病毒的专用引物。 本发明的目的也在于提供一种含有上述专用引物的检测甲型H1N1流感病 毒的试剂盒。
本发明的目的还在于提供上述专用引物的靶序列。
一种检测甲型H1N1流感病毒的专用引物，由4条特异性引物组成，所述4 条特异性引物的序列分别为引物F l具有序列表中SEQIDNo。 2的核苷酸序歹iJ, 引物Bl具有序列表中SEQIDNo. 3的核苷酸序列，引物F2具有序列表中SEQID No. 4的核苷酸序列，引物B2具有序列表中SEQIDNo.5的核苷酸序列。
一种检测甲型H1N1流感病毒的试剂盒，包括含有上述专用引物的反应预混液。
所述反应预混液为下述成分的混合液且各成分的终浓度分别为引物F1
1。76jaM;引物B1 1,76jiM;引物F2 0,29一；引物B2 0。29^M; dNTP2.05mM; 1.47xBstDNA聚合酶缓冲液；MgS04 11。76mM;甜菜碱1,47M。
所述试剂盒还包括Ba"7/MHfearaAwmo/ /H7us (Bst) DNA聚合酶、RNA酶 抑制剂、AMV反转录酶和无RNA酶的ddH20。
所述试剂盒还包括SYBR Green I。
所述试剂盒还包括阳性模板和阴性模板。
以检测20份样品的试剂盒为例，试剂盒组份包括40U/^iLRNase抑制剂， 8U/pLBstDNA聚合酶和5U/pL AMV反转录酶，各1管，每管21pL;无RNA 酶ddH20 1管lOOpL; 500X SYBR Green I 1管42pL;阳性模板、阴性模板各 1管25pL，浓度分别为1.41xl(r"M和I。3xl0—2GM;反应预混液20管，各17^L。 其中，反应预混液中各成分的终浓度为引物F1 1.76,;引物B1 1.76一；
引物F2 0。29pM;弓l物B2 0.29jaM; dNTP 2.05mM; 1.47xBst DNA聚合酶缓 冲液；MgS04ll。76mM ;甜菜碱1,47M。其中，阳性模板为HA1 RNA，阴性 模板为大肠杆菌RNA。
一种检测甲型H1N1流感病毒的方法，以被检测样品的总RNA为模板， 利用本发明的检测甲型H1N1流感病毒的试剂盒进行环介导反转录等温扩增反 应，然后鉴定被检测样品是否为甲型H1N1流感病毒阳性。
所述被检测样品为疑似甲型H1N1流感病毒感染者的呼吸道样本或血清， 如呼吸道分泌物、痰液、鼻拭子、咽拭子、鼻腔吸取物、鼻腔冲洗液等。 采用常规方法或RNA提取试剂盒从样本中提取病毒总RNA。
所述环介导反转录等温扩增反应的25pL体系中包括17pL反应预混液，2fiL样品总RNA, lpL Bst DNA聚合酶，ljaLAMV反转录酶，1jiL RNase抑 制剂，3pL无RNA酶ddH2()。
所述环介导反转录等温扩增反应的程序为62C反应60min;然后8(TC加热 2min终止反应。
所述鉴定被检测样品是否为甲型H1N1流感病毒阳性的方法为下述方法中 的一种或多种；
(1) 利用反应沉淀浊度来判定，见白色沉淀为阳性；
(2) 反应产物中加入荧光染料SYBRGreenI来判定，呈绿色为阳性；
(3) 通过电泳分析判定，见梯状条带为阳性。 一种上述专用引物的靶序列，所述靶序列的碱基序列如SEQ ID No. 1所示。
上述的专用引物是通过甲型H1N1流感病毒核酸HA区的保守序列，即上述的 耙序列设计出来的。
本发明的有益效果不需要其他昂贵的器材，只需要一个恒温水浴锅就能 进行；结果鉴定方法简单；检测时间短，特异性强，灵敏度高，可用于临床和 科研。
图1是PCR扩增甲型H1N1病毒HA1片段的电泳结果； M: DL2000; 1:HA1基因
图2是反转录等温扩增一体化方法灵敏度检测结果；
M- DL2000; 1 9:模板浓度2,2xl08 2拷贝，浓度依次相差10倍；
10， 11:阴性对照，ddH20质控对照
图3是RT-PCR灵敏度检测结果；
M: DL2000; 1;阴性对照；2 9:模板浓度2.2xl08 2拷贝，浓度依次相差10倍
图4是反转录等温扩增-^体化检测试剂盒特异性结果；
M: DL2000; 1-3: 3株不同亚型的春季H1N1流感病毒RNA; 4-6: 3株不同亚 型的春季H3N2流感病毒RNA; 7:以人全血提总RNA为模板检测；8:质控阳 性对照；9:系统以ddH20为模板阴性对照；10:大肠杆菌总RNA为模板阴性对 昭。
" 、o
具体实施例方式
以下实施例未说明的实验步骤参照《分子克隆实验指南》第二版，或参照 相应试剂盒的说明书。
实施例l设计用于检测甲型H1N1病毒的耙序列和专用引物
O)设计用于检测甲型H1N1病毒的靶序列
根据Genebank报道的甲型HlNl基因的序列，序列号GI: 227977103，运 用生物信息学分析整个流感病毒库，并筛选出特异的针对甲型H1N1核酸HA 区靶序列HA1，位于HA全基因的第301位碱基至第580位碱基。其碱基序列 如SEQIDNo. 1所示。
(2 )设计用于检测甲型H1N1病毒靶序列的特异弓i物
方法如下根据Genebank中序列号为GI; 227977103的甲型H1N1 流感病毒核酸HA区段基因序列和上述筛选出的特异针对H1N1基因的H A区靶序列HA1,应用引物设计与特异性分析为一体的软件工具BioSrni 设计检测甲型H1N1病毒的4条特异性的专用引物 F1 :GCCATGAACTTGTCTTGGGGAGAGAGCAATTGAGCTCAGT (SEQ ID No, 2);
B1 :CAAAGGTGTAACGGCAGCATGAATTTCCTTTTTTAACTAGCCA(SEQ ID No. 3); F2:ACCCAGGAGATTTCATCG (SEQ ID No' 4); B2:CTTTCCCTTTATCATTAATGTAGGA (SEQ ID No, 5 )。 实施例2本发明试剂盒阳性对照HA1 RNA片段的制备
(1) pMD-20T—HAl质粒的构建
将购自上海生工生物工程技术服务有限公司的重组表达质粒pBluescript II SK (+) -HAl取lul，采用CaCl2方法转化感受态细胞DH5a，利用含有氨苄 青霉素抗性的LB固体培养基筛选出重组克隆，提取质粒。以提取的含有HA1 的pBluescriptll SK ( + ) -HAl的质粒为模板，以F2即碱基序列为SEQIDNo. 4和B2即碱基序列为SEQIDNo.5为引物，PCR扩增HA1片段，反应体系为
pBluescript II SK (+) -HAl质粒(0.5吗)IpL
F2 (5pM) : 0,5^iL
B2 (5^M) : O早
dNTP (2.5mM) : 1.6RNA
10xPCR buffer: 2pL
Taq酶(5U/pL) : 0.2pL
ddH20: 加到20pL
94°C， 2min;然后94。C， 30sec;55。C， 30sec; 72°C， 30sec反应30个循环；72°C 延伸7min。
扩增产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，扩增片段长度为243bp，结果见 图1 ，经纯化后的HA1片段与购自Takam生物技术有限公司的pMD-20T载体 进行连接，采用CaCl2方法转化感受态细胞DH5a，利用蓝白斑筛选重组克隆，提取质粒，并用 pMD-20T 载体上游引物 5GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3 ' (SEQ ID No. 6)与HA1片段的下 游引物5 '-CTTTCCCTTTATCATTAATGTAGGA-3 ' (SEQ ID No. 5)，进行P CR扩增，以筛选和鉴定HA1片段正向插入的重组载体pMD-20T-HA1，正向 插入时扩增的片段长度为317bp，并对PCR鉴定为正向插入的重组载体进行测 序鉴定。该PCR的扩增条件和反应体系与上述的以pBluescriptII SK (+) -HA1 质粒为模板扩增HA1片段相同，仅模板和引物不同。PCR产物经l。5y。琼脂糖 凝胶电泳鉴定。
其中质粒DNA的提取、酶切反应、感受态细胞DH5a的制备及转化等操 作均参照《分子克隆实验指南》第二版(J。萨姆布鲁克E。F。弗里奇等，科学出 版社，1996)。 (2) HA1基因的转录
将鉴定正向插入的重组pMD-20T—1仏1质粒用^附//1酶切后回收做为模 板，用SP6RNA聚合酶进行转录反应，以下反应试剂购自Takara，反应体系如 下
pMD-20T—HAl线性化回收产物lul
二硫苏糖醇(DTT) (100mM):2ul
0.1%BSA:2ul
10xSP6 RNA聚合酶缓冲液2ul
NTP混合物(10mM):4ul
RNA酶抑制剂(40U/^L):0,5ul
SP6RNA聚合酶(10-50 U/^iL):lul
ddH20:5.5ul反应条件37"C， lh，得到相应的HA1RNA。然后加入luL的DNAase I (5U/piL)消化DNA， 37°C， 30min，之后按照RNA提取试剂盒(购自博迈德生 物技术有限公司)中纯化RNA步骤进行RNA纯化。 实施例3利用本发明试剂盒检测甲型H1N1病毒的方法
(1) 、检测甲型H1N1病毒的专用试剂盒 检测20份样品的试剂盒的各组分及其组分来源或配制方法 40U/(JLRNase抑制剂，购自宝生物工程(大连)有限公司，l管，共21pL; 8U/pLBstDNA聚合酶，购自百灵克生物技术公司，1管，共21pL; 5U&LAMV逆转录酶，购自宝生物工程(大连)有限公司，l管，共21^iL; 无RNA酶ddH20， l管，共100[iL;
500XSYBRGreenI，购自得比林科技有限公司，1管，共42pL;
1,41X10—2'M的阳性模板和UX 10 2"M的阴性模板，各1管，均为25pL;其中， 阳性模板HA1 RNA的制备方法如实施例2，阴性模板大肠杆菌RNA采用博迈德 生物技术有限公司的RNA提取试剂盒挺取总RNA。
反应预混液20管，各17nL，配制如下每17pL所述反应预混液中含有 10xBstDNA聚合酶缓冲液，2.5pL; 10mM dNTP， 3.5|aL; 5M甜菜喊，5mL; 100mM MgS04， 2pL;浓度为30jiM、的引物Fl和引物Bl各lpL,浓度为5pM的引物 F2和引物B2各l&。
(2) 、检测方法
A、 病毒RNA的提取
取疑为甲型H1N1流感病患者的咽拭子，使用Qiagen公司的QIAamp⑧viral RNAMini kit提取试剂盒提取病毒总RNA。
B、 环介导反转录等温扩增反应样品总RNA: 2(aL
反应预混液 17pL
BstDNA聚合酶 l|_iL AMV反转录酶 lpL RNA酶抑制剂 l)iiL ddH20: 3pL
混匀，做好标记，在水浴锅中62'C反应60min，然后80。C， 2min终止反应。
阳性对照反应产物见白色沉淀，阴性对照透明。被检测样品见白色沉淀， 表明样品中含有甲型H1N1流感病毒。
为了进一步确定结果的可靠性，又采用了另外两种方法进行鉴定。如下 电泳鉴定
配制1%的琼脂糖凝胶，将反应产物上样、电泳，结果判定时，阳性对照 见梯状条带，阴性对照无条带出现。被检测样品中出现梯状条带，表明样品中 含有甲型H1N1流感病毒。
SYBR Green I染色鉴定
向反应产物中加入2pL的500 X SYBR Green I混匀，阳性对照反应液呈绿 色，阴性对照无色，被检测样品呈绿色，表明样品中含有甲型H1N1流感病毒。 实施例4反转录等温扩增一体化方法的灵敏度检测试验
以得到的HA1 RNA片段为阳性模板，紫外定量HA1 RNA浓度为40ng/ul，
772 w 1r^-- X A/^ X 10
计算拷贝数按如下公式n=M^ (NA=6。02xl023)，为2。2xl0"个拷贝
数/ul。并进行梯度稀释从2,2xl011—2.2个拷贝，以10倍梯度稀释样品，浓度从
12高到低依次为1-12号管，以稀释好的不问梯度拷贝的样本为模板分别用反转录
等温扩增一体化检测方法和RT-PCR方法进行检测，反转录等温扩增一体^^检测 方法扩增产物为梯状条带，RT-PCR方法扩增243bp的片段，反应体系如下:
反转录等温扩增一体化方法，使用实施例3所述的试剂盒模板分别取按 梯度稀释的样品4 12号，模板分别为2.2xl()s 2。2拷贝，62°C， 60min， 80°C， 2min，反应体系(25(iL)如下 模板 2pL
反应预混液
BstDNA聚合酶: AMV反转录酶 RNA酶抑制剂 ddH20:
17^L
l)iL 3fxL
RT-PCR方法模板分别取按梯度稀释的样品4 12号，模板浓度分别为 2。2xl()8 2.2拷贝，反应如下: 模板 2pL Oligo dT primer (50pM): 1jaL dNTP(10mM) : 1jiL ddH20: 加到 IO^iL
65。C保温5min后，迅速在冰上冷却2min。离心数秒，在管中加下列反转 录反应液
5xAMV反转录酶缓冲液2pL AMV反转录酶(5U): 1jiL RNA酶抑制剂(40U):1 pLddH20: 加到20pL
42°C， 30min， 75°C， 15min， 4°C，冷却。取2jiL反转录产物进行PCR反 应，反应体系(20|iL)如下 模板 2pL 引物F2 (5pM) : 0.5(xL 引物B2 (5pM) : 0.5pL 2.5mMdNTP: l单 10xPCR buffer: 2pL Taq酶 0,2jjL ddH20: 力口到20(xL
94°C， 2min;然后反应30个循环94°C ， 30sec; 55。C，30sec;72。C，30sec; 72°C 延伸7min。
两种方法的扩增产物均使用1%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，结果如图2 和3所示，反转录等温扩增一体化方法检测HA1 RNA阳性模板灵敏度可达到 2个拷贝，比常规PCR方法检测高100倍。 实施例5反转录等温扩增一体化方法检测试剂盒特异性检测试验
模板病毒RNA的来源3株不同亚型的春季H1N1流感病毒RNA， 3株不同 亚型的春季H3N2流感病毒RNA，均来自河北疾病预防控制中心；人全血总RNA 是以来自北京儿研所采集的正常人全血为材料，采用博迈德生物技术有限公司 的RNA提取试剂盒提取总RNA;
大肠杆菌DH5ot购自Takara，也采用博迈德生物技术有限公司的RNA提取试 剂盒提取总RNA。
以实施例2制备的甲型H1N1流感病毒的HA1 RNA为阳性对照、系统以ddH20为阴性对照检测该试剂盒非特异性。反应体系(25pL)如下:
模板:
反应预混液:
17|iL
BstDNA聚合酶:
AMV反转录酶:
1pL
RNA酶抑制齐IJ(40U)
1pL
ddH20:
加到25。0jjL
反应在62"C进行，反应时间60分钟，结朿后8(TC加热2分钟，各取 2mL样品电泳鉴定。结果如图4所示，除HA1RNA阳性对照有梯度条带外，其 余均为阴性。
L Notomi， T" Okayama, H" Masubuchi， H。， Yonekawa， T.， Watanabe5 K', Amino， N。， Hase,T.， Loop-mediated isothermal amplification of DNA， Nucleic Acids Res'，2000， 28， E63。 2. Poon L L， Leung C S， Tashiro M， et al. Rapid detection of the severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus by a ioop-mediated isothermal amplification assay [J] 。 Clin Chem， 2004， 50(6):
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<■> 1
agttcagaca atggaacgtg ttacccagga gatttcatcg attatgagga gctaagagag 60
caattgagct cagtgtcatc atttgaaagg tttgagatat tccccaagac aagttcatgg 120
cccaatcatg actcgaacaa aggtgtaacg gcagcatgtc ctcatgctgg agcaaaaagc 180
ttctacaaaa atttaatatg gctagttaaa aaaggaaatt catacccaaa gctcagcaaa 240
tcctacatta atgataaagg gaaagaagtc ctcgtgctat 280
<210> 2
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<212> DNA
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<223>反转录等温扩增专用引物l
<400> 2
gccatgaact tgtcttgggg agagagcaat tgagctcagt 40
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>反转录等温扩增专用引物2
<400> 3
caaaggtgta acggcagcat gaatttcctt ttttaactag cca 43
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223>反转录等温扩增专用引物3
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acccaggaga tttcatcg 18<210> 5
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<213> Artificial Sequence
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<223>反转录等温扩增专用引物4
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etttcccttt atcattaatg tagga 25
<210> 6
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>用于鉴定pMD-20T-HAl的下游引物
<400> 6
gagcggataa caatttcaca cagg 2权利要求
1、一种检测甲型H1N1流感病毒的专用引物，由4条特异性引物组成，其特征在于，所述4条特异性引物的序列分别为引物F1具有序列表中SEQ ID No.2的核苷酸序列，引物B1具有序列表中SEQ ID No.3的核苷酸序列，引物F2具有序列表中SEQ ID No.4的核苷酸序列，引物B2具有序列表中SEQ ID No.5的核苷酸序列。
2、 一种检测甲型H1N1流感病毒的试剂盒，其特征在于，包括含有权利要求l 所述专用弓I物的反应预混液。
3、 根据权利要求2所述的检测甲型H1N1流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述 反应预混液为下述成分的混合液且各成分的终浓度为引物F1 L76pM;引物 Bl l'76拜；弓l物F2 0,29[xM;弓I物B2 0,29拜；dNTP2.05mM; 1.47xBstDNA 聚合酶缓冲液；MgS04 11。76mM;甜菜碱1,47M。
4、 根据权利要求3所述的检测甲型H1N1流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述 试剂盒还包括BstDNA聚合酶、RNA酶抑制剂、AMV反转录酶和无RNA酶的 ddH2。。
5、 根据权利要求4所述的检测甲型H1N1流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述 试剂盒还包括SYBR Green I。
6、 根据权利要求5所述的检测甲型H1N1流感病毒的试剂盒，其特征在于，所 述试剂盒还包括阳性模板和阴性模板。
7、 一种检测甲型H1N1流感病毒的方法，其特征在于，以被检测样品的总RNA 为模板，利用权利要求1-6任一项所述的检测甲型H1N1流感病毒的试剂盒进 行环介导反转录等温扩增反应，然后鉴定被检测样品是否为甲型H1N1流感病 毒阳性。
8、 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述环介导反转录等温扩增反应 的程序为62。C反应60min;然后8(TC加热2min终止反应。
9、 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述鉴定被检测样品是否为甲型 H1N1流感病毒阳性的方法为下述方法屮的- 种或多种(1) 利用反应沉淀浊度来判定，见白色沉淀为阳性；(2) 反应产物中加入荧光染料SYBR Green I来判定，呈绿色为阳性；(3) 通过电泳分析判定，见梯状条带为阳性。
10、 权利要求l所述专用引物的耙序列，其特征在于，所述耙序列的碱基序列 如SEQIDNo. 1所示。
全文摘要
本发明公开了一种属于病原体基因快速诊断领域的检测甲型H1N1流感病毒的专用引物和包括该引物的检测甲型H1N1流感病毒的试剂盒以及该引物所对应的靶序列。本发明的专用引物所对应的靶序列，其碱基序列如SEQ ID No.1所示，该试剂盒利用基因反转录和等温扩增技术原理，对甲型H1N1病毒核酸进行快速检测，检测结果可肉眼判定，也可利用电泳进行分析。该试剂盒具有快速、敏感、特异和操作方便的特点。
文档编号C12R1/93GK101591715SQ20091008763
公开日2009年12月2日 申请日期2009年7月1日 优先权日2009年7月1日
发明者付文亮, 徐东刚, 源 曹, 李伍举, 欣 蔡, 邹民吉 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所