抗人rBPI₂₃的单克隆抗体及其应用的制作方法

专利名称：抗人rBPI₂₃的单克隆抗体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫检测领域，具体涉及一种单克隆抗体以及其在免 疫检测中的应用。
背景技术：
杀菌/渗透增强蛋白(bactericidal/permeability increasing protein, BPI)是存在于人和许多哺乳动物多形核白细胞(polymorphonuclear leukocytes, PMN)嗜天青颗粒中的 一种分子量为55KD的碱性蛋白， 因其具有中和内毒素和广谱杀伤G—菌的作用而受到人们的重视。 1989年以来，人们成功获得了完整重组BPI(rBPl55)和重组BPI N 端功能片段(rBPI21/rBPI23)。实验和临床研究表明，rBPI55、 rBPI21 和rBPl23具有与天然BPI (nBPI55)相同的生物学活性。
但是，rBPI55、 rBPL和rBPI23作为 一种生物抗菌制剂，临床应 用存在血清半衰期短(<45min)、杀菌所需时间长(>3h)、用量大、 费用高等影响疗效和推广使用等问题。安云庆等(2000)研制了一种 由rBPI23与IgGl Fc嵌和组成的rBPI2rFqd融合蛋白，以期解决 rBPI55、 rBPI21和rBPI23临床应用所存在的问题。
另外，BPI也是诱导产生抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)的第 三大重要乾抗原，地位仅次于蛋白酶3( PR3 )和髓过氧化物酶(MPO )。 许多炎症性疾病时，血清中BPI含量可增高，BPI定量检测试剂盒将 有助于上述临床相关疾病的辅助诊断。
对于BPI的检测，目前仅有国外研制的BPI ELISA试剂盒，其 价格昂贵，不利于临床广泛开展检测。而且，国外研制的BPIELISA 试剂盒不能用来检测rBPI23和rBPI2rFcYl等重组蛋白，给这些重组 蛋白的研究工作带来一定困难。

发明内容
本发明的目的在于针对上述不足提供一种抗rBPI23的单克隆抗 体，其能特异性地与rBPl23结合，也能特异性地结合天然BPI。
本发明的另 一 目的在于提供一种基于上述单克隆抗体的检测试 剂或检测试剂盒，用于rBPI23或其融合蛋白或天然BPI的检测。
为实现上述目的，本发明以rBPl23作为免疫原制备获得既能与 rBPl23特异性结合，也能与天然BPI特异性结合的单克隆抗体。
具体而言，本发明釆用小鼠淋巴细胞杂交瘤技术制备抗人rBPI23
单克隆抗体，包括如下步骤
(1) 取人rBPl23免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞在聚乙二
醇作用下使二者融合形成杂交瘤细胞；
(2) 釆用有限稀释法获得单克隆杂交瘤细胞株，用间接ELISA 法和Western - blot方法筛选和鉴定分泌抗人rBPI23抗体的杂交瘤细 胞，亚克隆三次后获得稳定高效分泌抗人rBPl23抗体的杂交瘤细胞；
(3) 扩增杂交瘤细胞注入小鼠腹腔2周后收集腹水，釆用 Western-blot分析抗体的特异性，夹心EUSA法鉴定抗体类、亚类和 型，间接ELISA法测抗体效价；
(4) 用饱和硫酸铵沉淀法纯化IgM类抗体，蛋白A纯化抗体试 剂盒纯化IgG类抗体，SDS-PAGE鉴定抗体纯度，BCA法测定纯化 后抗体含量。
通过上述方法获得了多株稳定分泌抗人rBPI23单克隆抗体的杂 交瘤细胞株，釆用Western-blot方法证实，这些杂交瘤细胞分泌的抗 体能与人rBPI23和人BPI55标准品特异性结合，不能与小鼠BPI25和人 LBP结合。其中一株编号为2H11的杂交瘤细胞其综合性状显著优于 其它株，现已于2009年6月17日在中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心(地址北京巿朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微 生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为分泌抗rBPl23单克隆抗体的杂交瘤细胞，保藏号为CGMCCNo.3131。该杂交瘤细胞株可 分泌k型IgGl亚类抗人rBPI23单克隆抗体；纯化后抗体含量为 3.88g/L,以人BPl55标准品为抗原，用间接ELISA法测效价为 1.02xl06。
本领域技术人员可将本发明单克隆抗体制成各种检测或诊断试 剂，例如利用荧光标记抗体制成免疫荧光试剂，用于荧光免疫组化分 析，再如将可检测抗原、抗体或抗抗体与单克隆抗体组装成免疫检测 试剂盒。
基于上述单克隆抗体，本发明进一步提供包含所述单克隆抗体的 检测试剂盒，所述单克隆抗体与固相载体相结合，并进一步包括可检 测抗体，或可与所述单克隆抗体特异结合的可检测抗原，所述可检测 抗体与固相载体上结合的单克隆抗体分别针对rBPI23不同的抗原决 定簇；所述可检测抗原可以是荧光标记rBPl23 (或荧光标记人BPl55) 或酶标记rBPl23 (或酶标记人BPl55)，所述可检测抗体可以是酶标记 抗体或荧光标记抗体。
此外，还可将抗原或抗抗体与固相载体结合，所述抗原可与所述 单克隆抗体特异结合，当与固相载体结合的为抗原时，所述试剂盒还 包括可检测抗抗体；当与固相载体结合的为抗抗体时，所述试剂盒还 包括可检测抗原，所述抗原可与所述单克隆抗体特异性结合。所述抗 原可以是rBPI23(或人BPI55 )，所述可检测抗原可以是荧光标记rBPI23 (或荧光标记人BPI55)或酶标记rBPI23 (或酶标记人BPI55)，所述 可检测抗抗体可以是酶标记抗体或荧光标记抗体。
为方便检测，上述试剂盒中还可进一步包括纯化的rBPl23 (或人 BPIs5)作为标准品，以及相关的各种工作液等等。
上述酶标记物中所用的酶可以是本领域技术人员所熟知的辣根 过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化物酶和P-半乳糖苷酶等。用酶 作标记时，还可在试剂盒中进一步提供相应的底物显色液，以及相应的反应终止试剂等等。例如使用辣根过氧化物酶作为标记酶时，显色 剂可由显色液A液和显色液B液组成，显色液A液为过氧化氢或过
氧化脲，所述显色液B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，终止液为l 2mol/L的硫酸或盐酸缓冲液；碱性磷酸酶作为标记酶时，显色液为 对硝基磷酸盐缓冲液、终止液为1 2mol/L氢氧化钠溶液。
用本发明试剂盒对人BPI55的最低检测限可达2ng/ml，与小鼠 BPl25和人LBP以及其它蛋白未见交叉反应。本发明为rBPI23与 rBPI2rFcYl融合蛋白的研究，以及人BPI定量检测和BPI在人组织 细胞中的定位研究奠定了基础。


图1显示的是Western-blot对纯化抗体特异性鉴定，其中M蛋白 分子量标准；泳道l、 2、 3是以rBPl23为抗原，以1B4 、 9C12、 2H 纯化单克隆抗体为一抗分别进行杂交；泳道4、 5、 6是以人BPIs5标 准品为抗原，以1B4、 9C12、 2Hu纯化单克隆抗体为一抗分别进行杂 交；泳道7、 8、 9是以小鼠BPl25为抗原，以1B4、 9C12、 2H 纯化 单克隆抗体为一抗分别进行杂交；泳道IO、 11、 12是以人LBP标准 品为抗原，以1B4 、 9C12、 2Hu纯化单克隆抗体为一抗分别进行杂交。
图2显示的是纯化抗体还原后的SDS-PAGE电泳图，其中M为 蛋白分子量标准，泳道1、 2和3分别是还原后的9C12、 2Hn和1B4 单克隆抗体。
具体实施例方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的 限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或 条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟 知的常规手段。实施例l单克隆抗体的制备
1材料与方法 1.1材料
骨髓瘤细胞SP2/0购自协和医科大学细胞中心；雌性6~10周龄 Balb/c小鼠购自军事医学科学院；人BPl55标准品购自American Research Products;人脂多糖结合蛋白(LBP )购自Proteintech Group; 小鼠BPl25参考文献制备(文献冯颖，李丽，龙军，范宜强，刘振
龙，孔庆利，吕哲，王炜，安云庆.小鼠BPl36-259抗菌蛋白在原核细
胞中的表达及其抗血清的制备.首都医科大学学报，2008, 29(2): 184-189.注:小鼠BPI36—259抗菌蛋白即小鼠BPI25); HRP标记羊抗 鼠lgG抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司；兔抗人BPI抗体购 自HBT;鼠源单克隆抗体类和亚类检测试剂盒、蛋白A抗体纯化试 剂盒及TMB底物显色液购自Sigma公司；Western-Blot发光试剂盒 购自北京天来生物医学科技有限公司；BCA蛋白检测试剂盒购自北 京天来生物医学科技有限公司。
1.2制备rBPI"
(1)重组蛋白在E.ColiDH5oc中的表达
将含有pBV22()-synBPI6()()重组质粒的E.Coli DH5a (文献章璐， 靖学芳，安云庆.提高重组抗菌蛋白BPl23在Ecoli中表达水平和复性 率的研究.中日友好医院学报，2005， 19(5):291-295 )细菌分区划线接 种于LB氨节抗性固体培养基上，37。C培养过夜后挑取单个菌落接种 于内含50mlLB氨苄抗性液体培养基的三角瓶中。30°C 275rpm培养 12h后，按1 : 100的比例接种于总量为5000mL的LB氨苄抗性液体 培养基中，继续培养至菌液OD,值达到0.4时，将温度调至42TH秀 导表达，6h后(C 10000rpm离心10min收集菌体，用生理盐水洗3 次备用。(2)重组蛋白包涵体的提取、洗涤及溶解
按每克湿菌加10倍体积Buffer A吹打混悬细菌，加溶菌酶(lg/L ) 混匀，冰浴30min后超声裂菌(超5s,歇5s,共20min), 4°C 12000rpm 离心10min收集包涵体沉淀；用2mol/L尿素的包涵体洗涤液重悬沉 淀，超声裂菌，离心收集沉淀；用含4mol/L尿素的包涵体洗涤液重 悬沉淀，超声裂菌，离心收集上清和沉淀；将沉淀加入5倍体积的 8mol/L尿素变性溶解液中，于37t:条件下振摇溶解30min, 4°C ， 12000rpm离心15min，除去不溶杂质，上清再经0.22um的微孔滤膜 过滤，即为含有目的重组蛋白(rBPI23)的变性液。 1.3免疫动物
取人rBPl23与弗氏完全佐剂形成的乳化抗原(每只0.2mL，即50吗) 在小鼠腹部皮下和足垫多点注射进行初次免疫；3周后用人rBPI23与 弗氏不完全佐剂形成的乳化抗原腹腔注射(每只0.2mL，即50昭)对小 鼠加强免疫； 一周后从小鼠内眦静脉丛取血，用间接ELISA法测抗 体效价达到1: 105时，再经一周尾静脉注射人出？123抗原(每只0.2mL， 即50吗)进行冲击免疫，72h后取小嚴脾细胞备用。
1.4杂交瘤细胞株的建立
釆用小鼠淋巴细胞杂交瘤技术，在PEG 4000作用下使小鼠骨髓瘤 细胞与免疫小鼠的脾细胞融合，并接种于96孔细胞培养板；37°C、 C02孵箱培养7 10日后取细胞培养上清液，用间接ELISA法和 Western- blot方法筛选和鉴定分泌抗人rBPl23和人BPIs5抗体的杂交 瘤细胞株；采用有限稀释法将上述杂交瘤细胞连续亚克隆三次后，获 得稳定高效分泌抗人rBPI23和人BPI55标准品抗体的杂交瘤细胞株。
1.5单克隆抗体类、型和亚类的鉴定
按鼠源单克隆抗体类、型和亚类检测试剂盒的操作说明，对杂交
瘤细胞培养上清中抗体进行鉴定。样品A45。值大于阴性对照A45。值
2.1倍时判为阳性，反之则为阴性。1.6腹水的制备
取三次亚克隆后稳定高效分泌抗人rBPl23和人BPIs5标准品的杂交 瘤细胞扩大培养，收集对数生长期杂交瘤细胞(2><106个/只)腹腔 注射雌性Balb/c小鼠(两周前腹腔注射液体石蜡0.5mL/只)，10~14 天处死腹部膨大显著的小鼠，收集腹水。
1.7抗体的纯化、纯度鉴定和含量测定
釆用饱和硫酸铵沉淀法纯化IgM型抗体，方法简述如下取20mL 腹水与20mL生理盐水混合，在磁力搅拌器搅拌下逐滴加入饱和硫酸 铵40mL (使之成为50%的饱和度)，4。C静置60min， 3000rpm离心 20min，弃上清；取20mL生理盐水溶解沉淀，逐滴加入饱和硫酸铵 15mL(使之成为33%的饱和度),4。C静置35min,3000rpm离心20min， 弃上清，重复一遍；沉淀溶于15mL生理盐水，装入透析袋用pH7.4 的PBS透析2天，-7(TC保存备用。
按蛋白A抗体纯化试剂盒操作说明，纯化IgG型抗体。具体方法 如下
(1 )将经饱和硫酸铵沉淀法纯化的抗体用0.45pm的滤器过滤一 遍。
(2) 取2ml抗体溶液和4ml的结合缓冲液混匀。
(3) 用4ml的结合缓冲液平衡蛋白A柱子，流速lml/min。
(4 )上样，让6ml的样品混合液流过蛋白A柱子，流速0.5ml/min。 当样品全部进入蛋白A柱子后，用6ml的结合缓冲液冲洗柱子 一遍,流速lml/min。
(5) 将蛋白A柱子和脱盐柱子按说明书要求连接在一起。
(6) 取5ml的洗脱缓冲液通过蛋白A柱子，再依次流过脱盐 柱子，流速0.5ml/min。洗脱液中含有纯化的抗体，pH值为生 理条件下的pH值。
(7) 柱子的再生将蛋白A柱子和脱盐柱子拆开。取5ml的再生缓冲液洗涤蛋白A柱子除去杂蛋白，使蛋白A柱子再生；取 10ml的HEPES缓冲液洗涤脱盐柱子，使脱盐柱子再生。 (8 )若要长期保存柱子，可用含0.02%叠氮钠的PBS洗涤柱子， 然后把柱子的帽柠紧，2 8'C保存。 纯化抗体经还原后SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色后照相保存。
釆用BCA法测定抗体含量，按试剂盒操作说明，根据标准曲线计算
出待检蛋白浓度。
1.8抗体特异性鉴定和抗体效价测定
釆用Western-blot鉴定抗体的特异性人rBPl23、人BPIs5标准品 及小鼠BPI25和人LBP标准品溶液经SDS- PAGE电泳后转移到硝酸纤 维素膜上，用上述抗人rBPl23单克隆抗体作为一抗(1 :4000稀释)， HRP标记的羊抗鼠IgG ( 1 : 5000稀释)作为二抗，按Western- blot发 光试剂盒说明操作，胶片爆光显影，观察结果。
釆用间接ELISA法检测抗体效价用O.lmol/L碳酸盐缓冲液(pH 9.6)稀释的人rBPl23 (2mg/L)包被聚苯乙烯微量滴定板，上述抗人 rBPI23单克隆抗体倍比稀释后作为一抗，HRP标记的羊抗鼠抗体 (1 : 5000稀释)作为二抗进行测定。
1.9人粒细胞和单个核细胞中BPI的检测
细胞涂片的制备和免疫组化染色方法如下新鲜血液经破除红细 胞后1000rpm离心lOmin，弃上清并用PBS液洗涤细胞后两次离心， lOOOrpm, 10min;用PBS重悬细胞沉淀，取100^1滴加在载玻片上， 将其涂成2ci^大小的范围，室温自然干燥(过夜)；滴加4%多聚甲 醛室温固定15min, PBS洗三次；用PBS配置新鲜的3%H202,室温 封闭内源性过氧化物酶10分钟，PBS洗3次；用0.2%Triton X-100 溶液室温孵育15min, PBS洗三次；用5%BSA的PBS封闭液,室温孵 育30min;甩去封闭液后，滴加倍比稀释的鼠抗人rBPI23单克隆抗体 (2H 、 9C12)，同时设立阴性对照，4。C过夜后PBS洗三次；玻片上滴加HRP标记的山羊抗鼠IgG抗体(1:100稀释)，室温lh, PBS洗三次； 滴加DAB显色试剂，室温孵育10min， PBS洗三次；玻片经苏木素 轻度复染，逐级乙醇脱水至二甲苯透明后，用中型树脂封片，显微镜 下观察组织染色情况并照相。
2 实验结果
2.1杂交瘤细胞株的建立
融合细胞接种于96孔细胞培养板，7~10天后取培养上清用间接 ELISA法及Westem-blot检测方法初选分泌特异性抗人rBPI23和人 BPI55标准品的单克隆抗体的杂交瘤细胞，经有限稀释法对阳性克隆 孔进行三次亚克隆，最终获得多株分泌抗rBPl23单克隆抗体的杂交瘤 细胞株，其中三株(1B4、 9C12、 2H )能稳定高效分泌抗人rBPI23 也能特异性识别人BPI55标准品，特别是2H 综合性能显著优于其它 杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株已经进行了保藏。
2.2抗体类、型和亚类的鉴定
用鼠源单克隆抗体类、亚类分型试剂盒检测杂交瘤细胞培养上清， 结果显示1B4杂交瘤细胞可分泌k型IgM类抗人rBPI23单克隆抗体， 9C12和2HU杂交瘤细胞株分泌k型IgGl亚类抗人rBPI23单克隆抗体。
2.3抗体纯度鉴定及含量测定
纯化抗体溶液还原后SDS-PAGE电泳结果如图2所示9(312和 2H 杂交瘤细胞株分泌的抗体在凝胶25kD和50kD处各出现一条带， 与IgG的轻链和重链分子量相吻合；1B4杂交瘤细胞株分泌的抗体 在凝胶25kD和75kD处各出现一条带，与IgM的轻链和重链分子量 相吻合。
釆用BCA法测定蛋白浓度，根据标准蛋白曲线，计算得出1B4 杂交瘤细胞株分泌抗体浓度为0.208g/L; 9C,2杂交瘤细胞株分泌抗体 浓度为2.03g/L; 2Hn杂交瘤细胞株分泌抗体浓度为3.88g/L。2.4纯化抗体特异性鉴定结果
以本实验室制备的人rBPI23 、人BPI55标准品及小鼠BPI25和人LBP 标准品为抗原，通过Western-blot鉴定纯化抗体特异性，结果如图1 所示在l、 2、 3泳道均出现一条分子量约23kD的沉淀带；在4、 5、 6泳道均出现一条分子量约55kD的沉淀带；而在7、 8、 9和10、 11、 12泳道均未见任何沉淀带出现。表明这三株抗人rBPl23单克隆抗体 既可识别人rBPI23,也可识别人BPl55标准品，而对小鼠BPl25和人 LBP标准品均不识别。
2.5抗体效价的测定
间接ELISA法测腹水中抗体的效价1B4杂交瘤细胞株分泌的k 型IgM类抗体效价为6.4xl04; 9Cu杂交瘤细胞株分泌的k型IgGl 亚类抗体效价为1.28X105; 2Hn杂交瘤细胞株分泌的k型IgGl亚类 抗体效价为4.1xl06。纯化后2Hu效价为1.02xl06。 2.6人粒细胞和单个核细胞中BPI的检测结果
细胞免疫组化染色结果所示人粒细胞实验组出现特异性棕黄和 深棕色着染；单个核细胞实验组未出现特异性棕黄和深棕色着染；阴 性对照组细胞均未出现特异性染色。上述结果表明本发明制备的鼠 抗人rBPl23单克隆抗体能与人粒细胞中BPI蛋白特异性结合，可用于 人中性粒细胞内BPI蛋白的检测和定位。
实施例2双抗体夹心ELISA法试剂盒的组建
本例将抗人rBPI23的单克隆抗体与固相载体连接，组建成夹心 ELISA法试剂盒，其组成如下
1) 包被抗人rBPl23的单克隆抗体的酶标板；
2) 辣根过氧化物酶标记的兔抗人rBPl23多克隆抗体;
3) 单克隆抗体工作液；
4) rBPI23 (或人BPI55)标准品溶液6瓶，浓度分别为0吗/L、 0.2|ag/L、 0.6昭/L、 1.8ng/L、 5.4吗/L、 16.2|ag/L;5) 底物显色液，由A液和B液组成，底物显色液A液为过氧化 脲，底物显色液B液四甲基联苯胺；
6) 终止液，2mol/L盐酸；
7) 浓缩洗涤液，含1.5%吐温20和0.5%硫柳汞防腐剂的磷酸盐
rBPl23的包被方法用0.1mol/L碳酸盐包被缓冲液(pH9.6)稀 释rBPl23至2mg/L,每孔加入4'C冰箱过夜；使用时将酶标板 中的液体弃去，用PBST洗三次。
实施例3试剂盒灵敏度的检测及标准曲线建立
将人BPI55标准品分别稀释为0.48吗/L、 0.97(ig/L、 1.95吗/L、 3.9|ig/L、 7.8|ig/L、 15.6吗/L、 31.2|ig/L、 62.5昭/L、 125吗/L、 250吗/L、 500(ig/L、 1000吗/L、 2000昭/L,按照ELISA双抗体夹心法检测不同 浓度人BPI55标准品与酶标记抗体反应的A450值，根据检测样品 A450值大于阴性对照A450值2.1倍为阳性结果的判读标准，确定 人BPI55标准品抗原的最低检出浓度为2吗/L。以人BPI55标准品蛋 白浓度为应变量，以检测孔A450值为自变量，通过SPSS 11.0统计 软件绘制标准曲线。
权利要求
1、抗人rBPI23单克隆抗体，其以rBPI23作为免疫原制备获得。
2、 如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆 抗体由杂交瘤细胞株2Hu分泌产生。
3、 杂交瘤细胞2Hu，其保藏号为CGMCCNo. 3131。
4、 含有权利要求1或2所述单克隆抗体的检测试剂。
5、 一种免疫检测试剂盒，其包括权利要求1或2所述单克隆抗体。
6、 如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述单克隆抗体 与固相载体相结合，所述试剂盒还包括可检测抗体，或可与所述单克 隆抗体特异结合的可检测抗原，所述可检测抗体与固相载体上结合的 单克隆抗体分别针对rBPI23不同的抗原决定簇。
7、 如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述可检测抗原 为荧光标记rBPl23、荧光标记天然BPI、酶标记rBPl23或酶标记天然 BPI，所述可检测抗体为酶标记抗体或荧光标记抗体。
8、 如权利要求5所述的试剂盒，其还包括与固相载体结合的抗 原或抗抗体，所述抗原可与所述单克隆抗体特异结合，当与固相载体 结合的为抗原时，所述试剂盒还包括可检测抗抗体；当与固相载体结 合的为抗抗体时，所述试剂盒还包括可检测抗原，所述抗原可与所述 单克隆抗体特异性结合。
9、 权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述抗原为rBPI23 或天然BPI。
10、 如权利要求1 9任一项所述的试剂盒，其还包括rBPl23或天 然BPI标准品。
全文摘要
本发明提供了抗人rBPI₂₃单克隆抗体，其是以rBPI₂₃作为免疫原制备获得的既能与rBPI₂₃特异结合、也能与人天然BPI(即nBPI₅₅)特异性结合的单克隆抗体。进一步本发明还提供了用于检测rBPI₂₃和天然BPI的免疫组化试剂以及用于检测样本中rBPI₂₃和天然BPI的免疫检测试剂盒。用本发明试剂盒对BPI的最低检测限可达2ng/ml，与小鼠BPI₂₅和人LBP以及其它蛋白未见交叉反应。本发明为rBPI₂₃与rBPI₂₃-Fcγ1融合蛋白的研究，以及人BPI定量检测和BPI在人组织细胞中的定位研究奠定了基础。
文档编号C12N5/20GK101575376SQ200910087489
公开日2009年11月11日 申请日期2009年6月23日 优先权日2009年6月23日
发明者安云庆, 胡智颖, 军 龙 申请人:首都医科大学