专利名称：：猪流感病毒rt-lamp检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
：本发明涉及一种猪流感病毒RT-LAMP检测试剂盒及其检测方法，属于兽用生物制品领域中疫病诊断技术。技术背景猪流感病毒(Swineinfluenzavirus,SIV)属正黏病毒科，它可引起猪的一种急性、高度接触性呼吸道传染病——猪流感。猪在禽-猪-人的流感病毒跨种属障碍而感染新宿主的过程流感种间传播过程中，起着中间宿主及多重宿主的作用。由于猪上皮细胞具有唾液酸a-2，3半乳糖苷(SAa-2,3-Gal)和唾液酸a-2，6半乳糖苷(SAct-2,6-Gal)，人流感病毒可与前者结合，而禽流感病毒与后者结合。因此，猪上皮细胞就能够被人流感病毒和禽流感病毒感染，而成为毒株间基因重排的活载体。由于流感病毒可直接感染人，导致人类患病或死亡，其公共卫生意义日渐显著。在临床中，猪流感病毒常见以H1、H3亚型为主(李海燕等.部分省市猪群猪流感的血清学调査及猪流感病毒的分离与鉴定[J]动物医学进展，2003,03)，后来又有从猪体分离到H5N1、H9N2亚型流感毒株的报道(李海燕等.中国猪源H5N1和H9N2亚型流感病毒的分离鉴定[J]中国预防兽医学报，)。在SIV的检测工作当中，目前多使用病毒分离、HI、ELASA和RT-PCR方法。由于这些方法检测周期长、特异性与敏感性方面存在一定局限性，限制了在基层的推广使用。环介导的等温核酸扩增技术(LAMP)是由T.Notomi等发明的一种新型核酸扩增技术(Notomi,T.，etal.,Loop-mediatedisothermalamplificationofDNA.NucleicAcidsRes.2000,28,e63.)，该技术依赖4条特异设计的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下可以高效、高特异地扩增耙序列。近年来，国外己将该技术广泛应用于病原体检测。MasakiImai等人(2007)针对四种香酒酵母的ITS序列设计了LAMP特异性引物，建立了高效的LAMP检测体系。LAMP还可以检测其他与人类相关的病毒，如病毒性出血性败血病(VHS)、巨细胞病毒(CMV)、埃博拉病毒(EBOV)、慢性伯基特淋巴瘤病毒(EBV)、彩虹病毒、人类疱疹病毒8型、造血组织坏死病毒(IHHNV)、番茄斑萎病毒、番茄黄化曲叶病毒等。目前国内外均未见有用于检测猪流感病毒的RT-LAMP试剂盒及RT-LAMP方法在猪流感病毒检测中的应用的报道。
发明内容本发明的目的是建立检测猪流感病毒的RT-LAMP检测方法，并提供一种用于以上目的的RT-LAMP试剂盒。本发明的技术方案本发明的原理及技术路线新型的核酸扩增(LAMP)技术在检测工作中具有速度快、特异性强、敏感度高的优势，但是由于猪流感病毒不同亚型间的基因序列差异比较大，难以设计猪流感病毒不同亚型通用的RT-LAMP检测引物，对LAMP技术在SIV的检测中应用造成了很大的困难。本发明人为解决RT-LAMP在猪流感通用检测上存在的困难，在猪流感病毒PA基因上截取长300bp相对保守的序列基因设计SIVRT-LAMP的工作引物，并进行了简并处理，增加了引物对不同亚型SIV中存在的目的序列扩增的敏感性。建立针对SIV的环介导等温扩增技术(Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)检测方法，本方法具有多引物同时扩增，并在两端形成了带有引物功能的环状结构，这种多引物结合和可自产生引物的原理使其具有了灵敏度高、特异性强等特点，由于RT和LAMP反应在同管中同时进行简化了操作步骤，同时因为RT-LAMP反应的产物中包含大量核酸和焦磷酸镁的沉淀，可以用荧光剂显色肉眼来判定，适用于各种实验条件下检测工作的使用。本发明的方法具体实施1SIVRT-LAMP检测方法的建立和验证(1)反应用试剂的制备1)SIVRT-LAMP引物设计根据GenBank公布的SIV包括多种亚型HA和NA序列共54株，利用DNAMAN5.9和DNAstar5.0进行序列分析。在54株SIV毒株的比对中发现其PA序列中550nt780nt之间的突变较少，其长度适合RT-LAMP实验要求。参考H1N1型SIV序列设计引物。将设计的引物和54株SIV的序列再次进行比对，将引物靠近5'端和3'处各亚型SIV中存在差异的序列采取简并处理(图l)，按照RNALAMPkit的说明建立SIVRT-LAMP的反应体系对各套引物进行试验筛选，通过试验筛选结果的分析，确定以下这套引物为本方法的工作引物，序列l、2、3、4、5和6如下序列1(F3-PA):AGGGGTCTATGGGATTCCTT序歹!J2(B3-PA):GAAAGCTTGCCCTCAATG序列3(FIP-PA):WCGCATGGTTCCTGCGATTTCATCGTCAGTCCGAAAGAGGC序列4(BIP-PA):RRCTTGCCGACCAAAGTCTCTCGGTTCGAATCCATCCACA序歹!j5(LF-PA):AATCTTTCTTCAATTGTGTC序列6(LB-PA):CCGAACTTCTCCAGCCTTGA2)RT-LAMP反应体系中试剂的配制(50个反应量)①引物混合液PM:取lOOpmol/^ilF3-PA2.5pl、100pmol/|ilB3-PA2.5(il、lOOpmol/plFIP-PA20.0(il，100pmol/plBIP-PA20.0|al、100pmol/plLF-PAlO.Opl、100pmol/plLB-PA10.0pl混合，灭菌去离子水定容至总体系75.0pl。每个反应需取1.5^1PM。②反应缓冲混合液RM:取4mmol4d硫酸镁取50nl、1.6mol4il甜菜碱50nl、10mmol/pldNTPs50nl，溶于475ialPCR级水中定溶至625nl。每个反应需取12.5(alRM。③反应酶混合液EM:取16U/plBst大片段DNA聚合酶24^1，400U/plAMV反转录酶24nl，l|amol/nlDTT2pl。每个反应需要取1^1EM。④显色剂，取1plSYBRgreenl(购自Invitrogen公司)溶于49plPCR级水。每个反应加lpl。(2)样品RNA的制备1)RNA提取试剂(LBBII-RNA)RA:取1%2-巯基乙醇0.60ml、l%Tris-HCL(pH8.0)0.60ml、10mmo1/mlEDTAlml溶于5.0ml灭菌双蒸水中。RB:6mmol/ml异硫氰酸胍35ml.RC:无水乙醇15ml。RD:1OOu尔1DNAseA20^1溶于1OmlDEPCH20。2)样品RNA的提取取100pl细胞培养物(或鼻腔拭子浸出样品)，经反复冻融3次后，按如下步骤进行操作样品中加入样品等体积RA,涡旋15s，12000g离心lmin,取上清置于新管中；在1中上清液中加入3倍的RB溶液，涡旋或剧烈震荡90s,静置3min;加入1/3体积的RC溶液，涡旋lmin，12000g离心lmin。弃去上清液；放置5min后样品干燥，再加入llnlRD，溶解沉淀，即为样品RNA，作为扩增用的RNA模板。(3)样品检测1)本发明的反应体系为2(V16①配制RT-LAMP反应液RM12.5^x1,EMl.Onl，PM1.5pl;②取5.0pl样品RNA加到①项配制的RT-LAMP反应液中；③混和后在63°C恒温水浴锅中作用45min。结果判定反应结束后在SIVRT-LAMP反应产物中加入1^L的显色剂，肉眼观察反应液颜色变化。阴性反应的反应液呈现橘红色，阳性样品的反应液呈绿色。(4)反应结果的验证1)SIVRT-LAMP产物的Tubidimeterreal-time的鉴定按照以上本发明确定的引物及建立的反应体系，对不同亚型SIV毒株的RT-LAMP产物进行Tubidimeterreal-time吸光度鉴定，图2为SIVRT-LAMP产物的Tubidimeterreal-time吸光度鉴定曲线图和柱形图。其中CH1为阴性对照，27分别为各亚型SIV毒株，CH8水为模版扩增对照，图2显示结果与预期相符。CH27各亚型SIV毒株RNA模版SIVRT-LAMP反应达到阳性判定值时最快耗时23min，全部反应结束共用时45min。2)SIVRT-LAMP特异性试验图3为TubidimeterLA-320LAMP反应的柱形结果图，横轴数字表示18为样品，纵轴为反应产物吸光度值。图3表明以SIV参考株H1N1、H3N2作为阳性对照，DEPC处理的水作为阴性对照，检测按本发明提出的方法提取的RRSV、CHLV、PRV、PPV、PCV2核酸模板,验证所建立LAMP方法的特异性，结果阳性、阴性对照成立，SIV两个亚型参考毒株RNA模版RT-LAMP反应呈阳性，其它试验样品呈阴性，说明该引物及建立的SIVRT-LAMP方法具有很高的特异性3)SIV-RT-LAMP敏感性试验用建立的SIVRT-LAMP方法扩增按本发明提出的提取SIV参考毒株(H1N1)的RNA模板(10ngAU)，稀释成1~1(T5稀释度，用TubidimeterLA-320分析结果。结果见图4，表明按照45分钟作为判定时限，100TCID5o的SIV病毒RNA模板稀释到10"4时仍能快速有效的扩增。通过敏感性试验的曲线分析图(图5)发现，随着模版的稀释度增加只反应起点时间延长，而反应的速率和峰值变化很小。4)SIV-RT-LAMP检测应用实验结果对临床采集19份疑似SIV的发病猪病料，按照本发明提出的方法抽提样品的总RNA，用建立的SIVRT-LAMP方法检测同RT-PCR、鸡胚分离鉴定进行比较，其中的阳性样品用基因芯片分型鉴定(委托韩雪清博士鉴定HanXueqing，LinXiangmei,etal..SimutaneouslysubtypingofallinfluenzaAvirusesusingDNAmicroarrays.JournalofVirologicalMethods,2008,152117-121)，结果见表3。表3.几种方法对19份病料部分检测结果比较(阳性+/阴性-)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>采用SIVRT-LAMP方法对19份疑似SIV的发病猪病料检测，结果显示其中检测出有5份样品检测到病料中SIV核酸为阳性，与RT-PCR、鸡胚分离综合结果一致，经基因芯片分型鉴定结果为4中不同亚型，验证结果符合率为100%。2试剂盒的制备(50个反应量/盒)(1)提取样品RNA的所需试剂LBBII-RNA的配制RA:取1%2-巯基乙醇0.6ml、pH8.0l%Tris-HCL0.6ml、10mmo1/mlEDTAlml溶于5.0ml灭菌双蒸水中，装至无核酶的塑料容器中。RB:6mmol/ml异硫氰酸胍35ml，装至无核酶的塑料容器中。RC:无水乙醇15ml，装至无核酶的塑料容器中。RD:100u/iilDNAseA20nl溶于10mlDEPCH2O，装至无核酶的塑料容器中。(2)反应用试剂的制备1)SIVRT-LAMP引物的扩增将本发明设计的如下序列引物分别扩增后备用f3-pa:aggggtctatgggattccttb3-pa:gaaagcttgccctcaatgfip-pa:wcgcatggttcctgcgatttcatcgtcagtccgaaagaggcbip-pa:rrcttgccgaccaaagtctctcggttcgaatccatccaca:lf-pa:aatctttcttcaattgtgtcLB-PA:CCGAACTTCTCCAGCCTTGA2)RT-LAMP反应体系中试剂的配制①PM:取100pmol/plF3-PA2.5pl、濯pmo，B3-PA2.5^1、lOOpmo,FIP墨PA20.0|il，100pmol/plBIP-PA20.0nl、100pmol"lLF-PA10.0^1、100pmol/plLB-PAlO.(Hd，加灭菌去离子水定容至总体系75.0nl。每个反应需取1.5plPM。②RM:取4腿ol/nl硫酸镁取50nl、1.6mol/nl甜菜碱50nl、10mmol/^ddNTPs50^1，溶于475plPCR级水中定溶至625pl，装至无核酶的塑料容器中。③EM:取16UlBst大片段DNA聚合酶2一l，400U/nlAMV反转录酶24nl，lpmol/plDTT2nl，装至无核酶的塑料容器中。④显色剂取1plSYBRgreenl(购自Invitrogen公司)溶于49plPCR级水，装至无核酶的塑料容器中。3.试剂盒的使用1)使用LBBII-RNA提取样品RNA取IOOW细胞培养物(或血清、组织研磨样品)，经反复冻融3次后，按如下步骤操作样品中加入样品等体积RA，涡旋15s，12000g离心lmin，取上清置于小管中；在上清液中加入3倍的RB溶液，涡旋或剧烈震荡90s，静置3min;加入1/3体积的RC溶液，涡旋lmin,12000g离心lmin。弃去上清液；待样品干燥后加入RD，溶解沉淀，即为样品RNA。2)RT-LAMP反应①配制RT-LAMP反应液RM12.5|nl，EMl.Opl，PM1.5pl;②取5.0nl样品RNA加到①项配制的反应液中③混和后在63。C恒温水浴锅中作用45min。3)结果判定反应后在SIVRT-LAMP反应产物中加入1nL的显色剂，肉眼观察反应液颜色变化。阴性反应的反应液呈现橘红色，阳性样品的反应液呈绿色。图l:简并引物设计图示R=A/G，W=A/T图2:为SIVRT-LAMP产物的Tubidimeterreal-time吸光度鉴定曲线图(2-1)和柱形图(2-2)其中CH1为阴性对照，CH27分别为各亚型SIV毒株，CH8水为模版扩增对照，。图3:特异性试验SIVRT-LAMPTubidimeterLA-320柱形图CHI:SIVH1N1，9CH2:PRRSV，CH3:SIVH3N2，CH4:CHLV，CH5:PRV，CH6:PPV，CH7:PCV2，CH8:DEPCH20(横轴数字表示18为样品，纵轴为反应产物吸光度值)。图4:SIVH1N1参考毒株的敏感度试验TubidimeterLA-320结果分析柱形图其中CH1为水对照，CH2为10"，CH3为l(T2，CH4为l(T3，CH5为l(T4，CH6为l(T5。图5:SIVH1N1参考毒株的敏感度试验TubidimeterLA-320结果分析曲线图其中LINE1为10"，LINE2为10'2，LINE3为l(T3，LINE4为l(T4。图6:SIV-RT-LAMP反应产物混合显色剂后显色图例。1:阳性样品，2:阴性样品本发明的积极意义本发明涉及一种猪流感病毒RT-LAMP检测试剂盒及其检测方法。根据GenBank公布的SIV不同亚型的基因序列，针对PA序列相对保守区域设计了SIVRT-LAMP简并引物6条，以猪流感H1、H3、H5、H9亚型毒株为模板，建立了可以检测所有亚型猪流感毒的RT-LAMP方法。利用LA-320LAMPTubidimeter仪分析反应过程并判定结果，显示在LA-320LAMPTubidimeter仪中63'C反应45min，所有实验用的4种亚型SIV样品RNA均获得了高效的特异性扩增。通过敏感性试验证明本方法可对lOOTCIDsoSIV样品RNA进行10""稀释后仍可高效扩增，显示出本方法高度的敏感性；通过特异性实验和19份临床样品的SIV病原的RT-LAMP检测，有5份样品检测到病料中SIV核酸为阳性，与RT-PCR、鸡胚分离结果一致，经基因芯片分型鉴定验证，综合结果符合率为100%。显示本方法特异、敏感、快速，适合用于各种试验条件下SIV的检测。实施例以下实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。实施例lSIVRT-LAMP引物设计与筛选根据GenBank公布的SIV包括多种亚型HA和NA序列共54株，利用DNAMAN5.9和DNAstar5.0进行序列分析。在54株SIV毒株的比对中发现其PA序列中550nt780nt之间的突变较少，长度适合RT-LAMP实验的要求。参考H1N1型SIV序列设计引物。将设计的引物和54株SIV的序列再次进行比对，将引物靠近5'端和3'处各亚型SIV中存在差异的序列采取简并处理(图l)，按照RNALAMPkit的说明建立SIVRT-LAMP的反应体系对各套引物进行试验筛选，通过试验筛选结果的分析，确定以下这套引物为本方法的工作引物，序列如下:F3-PA:AGGGGTCTATGGGATTCCTTB3-PA:GAAAGCTTGCCCTCAATGFIP-PA:WCGCATGGTTCCTGCGATTTCATCGTCAGTCCGAAAGAGGCBIP-PA:RRCTTGCCGACCAAAGTCTCTCGGTTCGAATCCATCCACALF-PA:AATCTTTCTTCAATTGTGTCLB-PA:CCGAACTTCTCCAGCCTTGA并确定以上引物在引物混合液(PrimerMix，PM)各成分的比例取100pmol尔lF3-PA2.5pl、lOOpmol/^ilB3-PA2.5^1、100pmol/nlFIP-PA20.0W，100pmol/nlBIP-PA20.0nl、lOOpmol/plLF-PAlO.Opl、100pmol/|alLB-PA10.0pl混合，总体系75.0|il。每个反应需取1.5plPM。实施例2试剂盒内组分的配制按以下各种组分的配方(50个反应量)配制成各种组分并分装到玻璃或塑料小容器中并用相应的塞子密封1.LBBII-RNA，本试剂组由RA、RB、RC、RD四部分构成RA:取P/o2-巯基乙醇0.6ml、pH8.0l%Tris-HCL0.6ml、10腿ol/mlEDTAlml溶于5.0ml灭菌双蒸水中。RB:6mmol/ml异硫氰酸胍35ml。RC:无水乙醇15ml。RD:100u/nlDNAseA2(Hil溶于10mlDEPCH2O，2.RT-LAMP反应试剂1)PM:取100pmol/jilF3-PA2.5^1、100pmol/|ulB3-PA2.5^1、lOOpmol/plFIP-PA20.0(al，100pmol/plBIP-PA20.0^1、100pmol/nlLF-PAlO.Opl、lOOpmol/plLB-PA10.0^1，加灭菌去离子水定容至总体系75.(^1。每个反应需取1.5ialPM。2)RM:取4mmol4il硫酸镁取50^11、1.6mol4il甜菜碱50pl、10mmol/nldNTPs50W，溶于475plPCR级水中定溶至625pl。每个反应需取12.5^1RB。3)EM:取16U/ialBst大片段DNA聚合酶24nl，400U4dAMV反转录酶2化1，lpmolAilDTT2nl。每个反应需要取lpilEB。4)显色剂取1ialSYBRgreenI(购自Invitrogen公司)溶于49plPCR级水。每个反应加1^1。11实施例3SIVRT-LAMP试剂盒的使用1.使用LBBI1-RNA提取样品RNA取100^1细胞培养物(或拭子、组织研磨样品)，经反复冻融3次后，按如下步骤操作.-样品中加入样品等体积RA，涡旋15s，12000g离心lmin，取上清置于小管中；在上清液中加入3倍的RB溶液，涡旋或剧烈震荡90s，静置3min;加入1/3体积的RC溶液，涡旋lmin,12000g离心lmin。弃去上清液；待样品千燥后加入RD，溶解沉淀，即为样品RNA。2.SIVRT-LAMP反应①配制RT-LAMP反应液将RM12.5pl，EM1.0|al，PM1.5pl加到反应管中；②取5.0pl样品RNA加到①项配制的反应液的管中；③混和后将反应管置于63'C恒温水浴锅中作用45min。3结果判定反应后在SIVRT-LAMP反应产物中加入1的显色剂，肉眼观察反应液颜色变化。阴性反应的反应液呈现橘红色，阳性样品的反应液呈绿色。序列表<110>中国兽医药品监察所<120>猪流感病毒RT-LAMP检测试剂盒及其检测方法<160>4<210>1<211>20<212>DNA<213>引物F3-PA<223>人工序列<400>1AGGGGTCTATGGGATTCCTT20<210>2<211>18<212>DNA〈213〉引物B3-PA:<223>人工序列<400>2GAAAGCTTGCCCTCAATG18<210>3<211>42<212>DNA<213>引物FIP-PA:<223>人工序列<400>3AWCGCATGGTTCCTGCGATTTCATCGTCAGTCCGAAAGAGGC42<210>4<211>41<212>DNA<213>引物BIP-PA<223>人工序列<400>4ARRCTTGCCGACCAAAGTCTCTCGGTTCGAATCCATCCACA41<210>5<211>20<212>DNA<213>引物LF-PA:<223>人工序列<400>5AATCTTTCTTCAATTGTGTC20<210>6<211>20<212>DNA<213>引物LB-PA<223>人工序列<400>6CCGAACTTCTCCAGCCTTGA201权利要求1.一种检测猪流感病毒的RT-LAMP检测试剂盒，其特征包含提取RNA试剂LBBII-RNA；含有序列1、2、3、4、5和6三对引物配制成引物混合液的RT-LAMP反应试剂两个组分。2.如权利要求l所述的一种检测猪流感病毒的RT-LAMP试剂盒，其特征在于所述的提取RNA试剂LBBII-RNA含有以下溶液组成RA:取1%2-巯基乙醇0.6ml、pH8.0l%Tris-HCL0.6ml、10mmol/mlEDTA1ml灭菌双蒸水5.0ml;RB:6mmol/ml异硫氰酸胍35ml;RC:无水乙醇15ml;RD:lOOu/plDNAseA20^1、10mlDEPCH2O。3.如权利要求l所述的一种检测猪流感病毒的RT-LAMP试剂盒，其特征在于所述的反应试剂含有引物混合液PM、反应缓冲混合液RM、反应酶混合液EM及显色剂，其中引物混合液所用的引物序列l、2、3、4、5和6及其在混合液中各自的浓度为F3-PA:AGGGGTCTATGGGATTCCTTB3-PA:GAAAGCTTGCCCTCAATGFIP-PA:WCGCATGGTTCCTGCGATTTCATCGTCAGTCCGAAAGAGGCBIP-PA:RRCTTGCCGACCAAAGTCTCTCGGTTCGAATCCATCCACALF-PA:AATCTTTCTTCAATTGTGTCLB-PA:CCGAACTTCTCCAGCCTTGA按总体系75.0pl含100pmol/^dF3-PA2.5pl、100pmol/nlB3-PA2.5|al、100pmol/jilFIP-PA20.0pl，lOOpmol/plBIP-PA20.0|il、lOOpmoLVlLF-PA10.0|_il、100pmol/nlLB-PA10.0|al，灭菌去离子水定容至75.0^1。4.一种检测猪流感病毒的RT-LAMP试剂盒的检测方法，其特征是包括以下步骤1)提取待测样品中的核酸；2)配制RT-LAMP反应液RM12.5^1，EMl.(Hil，PM1.5pl;3)取5.0ial样品RNA加到①项配制的RT-LAMP反应液中；4)混和后在63'C恒温水浴锅中作用45min;5)结果判定反应结束后在SIVRT-LAMP反应产物中加入1^L的显色剂，肉眼观察反应液颜色变化。阴性反应的反应液呈现橘红色，阳性样品的反应液呈绿色。5.—种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-LAMP试剂盒的检测方法，其特征是用LBBII-RNA提取样品RNA包括以下步骤取100pl细胞培养物或鼻腔拭子浸出样品，经反复冻融3次后，样品中加入样品等体积RA，涡旋15s，12000g离心lmin，取上清置于新管中；在上清液中加入3倍的RB溶液，涡旋或剧烈震荡90s，静置3min;加入1/3体积的RC溶液，涡旋lmin，12000g离心lmin，弃去上清液放置5min后样品干燥，再加入llplRD，溶解沉淀，即为样品RNA。全文摘要本发明涉及一种猪流感病毒RT-LAMP检测试剂盒及其检测方法。根据GenBank公布的SIV不同亚型的基因序列，针对PA序列相对保守区域设计了SIVRT-LAMP简并引物6条，以猪流感H1、H3、H5、H9亚型毒株为模板，建立了可以检测所有亚型猪流感毒的RT-LAMP方法。利用LA-320LAMPTubidimeter仪分析反应过程并判定结果，显示在LA-320LAMPTubidimeter仪中63℃反应45min，所有实验用的4种亚型SIV样品RNA均获得了高效的特异性扩增。通过敏感性试验证明本方法可对100TCID<sub>50</sub>SIV样品RNA进行10<sup>-4</sup>稀释后仍可高效扩增，显示出本方法高度的敏感性；通过特异性实验和19份临床样品的SIV病原的RT-LAMP检测，有5份样品检测到病料中SIV核酸为阳性，与RT-PCR、鸡胚分离结果一致，经基因芯片分型鉴定验证，综合结果符合率为100％。显示本方法特异、敏感、快速，适合用于各种试验条件下SIV的检测。文档编号C12Q1/70GK101629217SQ20091008756公开日2010年1月20日申请日期2009年6月30日优先权日2009年6月30日发明者刘业兵,宁宜宝,磊张,蕾陈申请人:中国兽医药品监察所