专利名称：：猪细小病毒lamp检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
：本发明涉及猪细小病毒LAMP诊断试剂盒及其检测方法，属于兽用生物制品领域中的疫病诊断技术。
背景技术：
：猪细小病毒(porcineparvovirus,PPV)，可引起母猪的细小病毒病，造成母猪的繁殖障碍并感染胚胎，导致胚胎死亡。PPV分布广泛，通过水源、食物、交配、胎盘等途径对猪只感染，并能在外界环境长时间存活且对大部分消毒剂不敏感，难于防治。给养猪业带来巨大危害。一旦PPV传入阴性猪场，于3个月内几乎100%的猪只都会受到感染，在本病发生后，猪场可能连续几年不断地出现母猪繁殖失败。环介导的等温核酸扩增技术(LAMP)是由T.Notomi等发明的一种新型核酸扩增技术(Notomi,T.,etal.,Loop-mediatedisothermalamplificationofDNA.NucleicAcidsRes.2000,28,e63.)，该技术依赖4条特异设计的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下可以高效、高特异地扩增靶序列。近年来，国外已将该技术广泛应用于病原体检测。Masakilmai等人(2007)针对四种香酒酵母的ITS序列设计了LAMP特异性引物，建立了高效的LAMP检测体系。LAMP还可以检测其他与人类相关的病毒，如病毒性出血性败血病(VHS)、巨细胞病毒(CMV)、埃博拉病毒(EB0V)、慢性伯基特淋巴瘤病毒(EBV)、彩虹病毒、人类疱疹病毒8型、造血组织坏死病毒(I朋NV)、番茄斑萎病毒、番莉黄化曲叶病毒等。目前国内外均未见有用于检测猪细小病毒的LAMP试剂盒及在猪细小病毒检测中的应用。
发明内容本发明的目的是采用环介导的等温核酸扩增技术(LAMP)建立检测猪细小病毒的LAMP检测方法，并提供一种用于以上目的的猪细小病毒LAMP检测试剂盒。猪细小病毒LAMP检测方法的原理及技术路线本发明是利用环介导等温扩增技术(Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)建立针对猪细小病毒的检测方法。本方法具有多引物同时扩增，并在两端形成了带有引物功能的环状结构，这种多引物结合和可自产生引物的原理使其具有了灵敏度高、特异性强等特点，由于LAMP反应在同管中进行简化了操作步骤及反应产物中包含大量核酸和焦磷酸镁的沉淀，可以用荧光剂显色观察反应结果，适用于各种实验条件下检测工作的使用。本发明的方法具体实施1猪细小病毒LAMP检测方法的建立和验证(1)反应用试剂的制备1)引物设计根据GenBank公布的PPV8个毒株序列为模板，设计以下两对引物，引物序列为F3:ACTAATCCATCAGACGCCB3:GTCTGTTTCTGAGAGTTTTGGFIP:TCAGCTGCTGAGAAGTAGAAGTATGGCAGCAAAAGAACACGACBIP:TTCATAAAAGAAACTGAACACGCAACACGCTTTGCTCTGAAGA2)反应体系中溶液的配制(50个反应量)①引物混合液(PB):取2.5pl100pmol/nlF3、2.5pllOOpmol/plB3、20^1lOOpmol/plFIP，20nllOOpmol/pl段P混合后加灭菌去离子水5pl，总体系5(Hil，装至无核酶的塑料容器中。②反应缓冲混合液(RB):取4mmol/nl硫酸镁取50ial、1.6mol/nl甜菜碱50pl、lOmmol/pldNTPs5(Vl，溶于475^PCR级水中定溶至625pl，装至无核酶的塑料容器中。③反应酶混合液(EB):取8U尔1Bst大片段DNA聚合酶48|^1，0.1pmo11DTT2^1，装至无核酶的塑料容器中。④显色剂取1plSYBRgreenl(购自Invitrogen公司)溶于49plPCR级水，装至无核酶的塑料容器中。(2)病毒DNA提取试剂(LBBI-DNA)配制1)DA:将1%2-巯基乙醇溶液10ml、10mmol/mLTris-HCL(pH8.0)3ml、10mmol/mlEDTAlml溶于灭菌双蒸水，定溶至30ml，装入无核酶塑料容器中。2)DB:200mmol/ml15mlNaOH、1%SDS溶液15ml混合后，用去离子水定溶至30ml,装入无核酶塑料容器中。3)DC:75ml无水乙醇，pH4.8200mmol醋酸钠(NaAc)lml混合后装入塑料容器中。4)DD:50uRNAseA溶于100ml无核酶水(DEPC)，装入无核酶塑料容器中。(3)DNA的提取样品DNA使用本发明配制的LBBI-DNA试剂提取，10(Hil样品中加入500nlDA试剂，涡旋10s，加入RB250W后，剧烈震荡lmin后加入等体积的DC，涡旋10s,离心lmin,弃去上清液，室温放置5min后加入DD1(^1溶解。取lixl利用分光光度仪测定总DNA量。利用LBBI-DNA试剂对PPV7909毒株、NADL-2毒株、SX分离株、PCV2、PRV(本实验室保存)及采集地方养殖场20份疑似PPV的发病猪的组织样品(本发明人采集)提取样品总DNA，利用分光光度仪测定提取DNA模板量在10~90ng之间(见表1)。表1LBBI-DNA试剂提取部分样品总DNA模板量<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(4)反应进行PBl単RB12.5nl，EBl羊，样品DNA5.5pl将以上各成分加入反应管中混合后，置于65。C恒温水浴中等温扩增45min，反应结束后加入l.O^il配制好的显色剂混匀后观察结果。(5)检测结果的验证1)PPVLAMP产物的Tubidimeterreal-time吸光度鉴定结果禾U用LAMPTubidimeterLA-320仪(日本荣源株式会社生产)可实时监测LAMP反应管中进行的LAMP反应情况，以图文的形式显示记反应过程中各反应管中反应速率和时间。图1显示了PPVLAMP产物的Tubidimeterreal-time吸光度检测鉴定结果。1、2分别为PPVSX分离株和7909毒株，3、4为阴性对照。2)PPVLAMP产物的可视化鉴定结果反应结束后，在PPVLAMP反应体系中加入1Hl的显色剂，肉眼观察LAMP反应液颜色变化。阴性反应的反应液颜色呈橘红色，阳性样品的反应液呈绿色(见图2)，与图l鉴定结果、预期相符，表明所呈现的颜色反应具有特异性。3)PPVLAMP特异性试验结果采用LBBI-DNA试剂抽提PPV毒株、PRV(狂犬病病毒)、PCV2(圆环病毒2型)等病毒基因组核酸，按照所建立的PPVLAMP检测方法，进行特异性试验。以PPV作为阳性对照，DEPC处理的水作为阴性对照，检测经LBBI-DNA试剂提取病毒DNA模板验证所建立LAMP方法的特异性，结果阳性对照和阴性对照成立，PPV呈阳性，其它试验样品呈阴性(见图3)，表明该方法对PPV具有很强特异性。4)PPVLAMP敏感性试验结果用建立的PPVLAMP方法扩增经LBBI-DNA试剂提取的约103TCID5QPPVSX株病毒细胞培养物的总DNA模板(23ng/W)，按1~10—4进行10倍梯度稀释，从图4的PPVLAMPTubidimeterLA-320曲率分析结果可以看出，随着模板浓度的降低，阳性反应速率斜率不变，反应峰值出现的时间延迟，至稀释度10"4时能快速有效的扩增，证明PPVLAMP方法可扩增经LBBI-DNA试剂快速提取后稀释至2.3pg的总DNA模板中的PPV基因序列。在反应中，当反应产物量达到可被判定的临近值时到产物最终被判定为阳性的时间差在5min8min之间。5)PPVLAMP田间应用结果对临床采集20份疑似PPV的发病猪病料，按照LBBI-DNA试剂提取方法抽提采集20份样品的总DNA，用建立的PPVLAMP方法检测和PK-15细胞分离鉴定、PCR检测进行结果比对。结果显示采用LBBI-DNA试剂处理的20份样品中有6份样品检测到PPV抗原为阳性(见图6)，与PK-15细胞分离培养、PCR(刘业兵等.猪细小病毒PCR检测方法的建立和初步应用。中国动物检疫2008，24(8)20-22)验证综合结果吻合率为100%(见表3)。表2.三种方法对20份病料中6个PPV阳性样品的鉴定结果(阳性+/阴性-)样品名称LAMPPCR细胞培养分离鉴定HB1+++HB2++—HB3+++HN1+—+HN2+++TJ1+++PPV阳性对照+++阴性对照———2.试剂盒的制备和组装按以下各种组分的配方配制成各种组分(50个反应量)，并分装到玻璃或塑料小容器中并用相应的塞子密封(1)LBBI-DNA:1)DA:将1%2-巯基乙醇溶液lOml、10mmol/mLTris-HCL(pH8.0)3ml、10腿ol/mlEDTAlml溶于灭菌双蒸水，定溶至30ml，装入无核酶塑料容器中。2)DB:200mmol/ml15mlNaOH、1%SDS溶液15ml混合后，用去离子水定溶至30ml，装入无核酶塑料容器中。3)DC:75ml无水乙醇，pH4.8200mmo1醋酸钠lml混合后装入塑料容器中。4)DD:50uRNAseA溶于100ml无核酶水(DEPC)，装入无核酶塑料容器中。(2)反应体系中溶液的配制1)PB:取2.5pllOOpmol/plF3、2.5^1lOOpmol/plB3、20pllOOpmol/plFIP，20|^1100pmol/pl班P混合后加灭菌去离子水5^1，总体系50W，装至无核酶的塑料容器中。2)RB:取4mmol/^il硫酸镁取50pl、1.6mol/nl甜菜碱50pl、10mmol/nldNTPs50pl，溶于475plPCR级水中定溶至625pl，装至无核酶的塑料容器中。3)EB:取8U/plBst大片段DNA聚合酶48^1，0.1pmol/nlDTT2pl，装至无核酶的塑料容器中。(3)显色剂取1plSYBRgreenl(购自Invitrogen公司)溶于49PCR级水，装至无核酶的塑料容器中。3试剂盒的使用(1)样品DNA的提取100^1被检样品中加入50(^1DA,涡旋15s，12000g离心lmin,取上清置于新管中；300pl的DB溶液加到上清液中，涡旋或剧烈震荡90s;加入等体积的DC溶液，涡旋lmin,12000g离心lmin。弃去上清液；室温中放置5min，待沉淀物干燥后加入10^1DD并将其溶解成样品DNA。(2)反应液的配制本试剂盒的使用采用的反应系统为20^1反应系统。取PB1.0pl、RB12.5pl和EBl.Opl,，置于小反应管中，再加入样品DNA5.5pl.混匀。(3)反应的进行当LAMPTubidimeter温度到达65'C后，将加入各成分的反应管置于65'C恒温水浴中等温扩增45min。(4)结果判定反应结束后，加入配制好的显色剂(SYBRgreenI)l.OW。肉眼观察阴性反应的反应液的颜色呈现橘红色，阳性样品的反应液呈现绿色。图1:PPVLAMP产物的Tubidimeterreal-time吸光度鉴定柱形图1道PPVSX分离株，2道PPV7909毒株，3、4道水对照图2:LAMP反应体系显色结果1、3.PPV病毒阳性样品，2、4PPV病毒阴性性样品图3:特异性试验PPVLAMPTubidimeterLA-320分析图l道PPV，2、3道PCV2，4道DEPCH20，5、6道PRV图4:PPV10"10-4梯度稀释LAMPTubidimeterLA-320分析(4-l为反应曲线；4-2为定性结果柱状图)。图5:PPV-LAMP对采集的20份病料样品检测6份样品阳性结果LAMPTubidimeterLA-320仪分析柱形16道为样品；7道阳性对照；8道为阴性对照；本发明的积极意义在于根据GenBank公布的猪细小病毒(PPV)序列，在其保守序列区域设计了PPVLAMP引物。采用本发明人设计并配制的病毒DNA提取试剂提取PPV病毒DNA，使用本发明建立的PPVLAMP反应体系进行LAMP反应，反应结束后加入显色剂判定结果，结果显示在63'C45min，PPV病毒DNA获得了高效的特异性扩增。通过敏感性试验证明本方法可对2.3pgPPV病毒的DNA模板进行高效扩增，显示出本方法高度的敏感性，通过特异性实验和临床样品的PPV的检测，结果显示本发明的方法及试剂盒具有特异、敏感、简单、快速、又不需要特殊仪器设备等特点，适合用于PPV的检测工作。实施例以下实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。实施例l1)引物设计根据GenBank公布的PPV8个毒株序列为模板，设计以下两对引物，引物序列F3:ACTAATCCATCAGACGCCB3:GTCTGTTTCTGAGAGTTTTGGFIP:TCAGCTGCTGAGAAGTAGAAGTATG-GCAGCAAAAGAACACGACBIP:TTCATAAAAGAAACTGAACACGCAA國CACGCTTTGCTCTGAAGA实施例2试剂盒内组分的配制按以下各种组分的配方(50个反应量)配制成各种组分并分装到玻璃或塑料小容器中并用相应的塞子密封1.LBBI-DNA:(1)DA:将1%2-巯基乙醇溶液10ml、10mmol/mLTris-HCL(pH8.0)3ml、10腿ol/mlEDTAlml溶于灭菌双蒸水，定溶至30ml，装入无核酶塑料容器中。(2)DB:200mmol/ml15mlNaOH、1%SDS溶液15ml混合后，用去离子水定溶至30ml，装入无核酶塑料容器中。(3)DC:75ml无水乙醇，pH4.8200mmo1醋酸钠lml混合后装入塑料容器中。(4)DD:50uRNAseA溶于100ml无核酶水(DEPC)，装入无核酶塑料容器中。2.反应体系中溶液的配制(1)PB:取2.5pl100pmol/nlF3、2.5pl訓pmol/nlB3、20^1lOOpmol/plFIP，20nl10Opmol/^BIP混合后加灭菌去离子水5^，总体系5(Hd，装至无核酶的塑料容器中。10(2)RB:取4mmol4il硫酸镁取50^U、1.6mol/^甜菜碱50pl、10mmol/pldNTPs50^1，溶于475nlPCR级水中定溶至625pl，装至无核酶的塑料容器中。(3)EB:取8U/plBst大片段DNA聚合酶48pl，O.lpmo,DTT2nl，装至无核酶的塑料容器中。显色剂SYBRgreenI荧光素(购自Invitrogen公司)。取1nlSYBRgreenl溶于49nlPCR级水，装至无核酶的塑料容器中。实施例3PPVLAMP试剂盒的使用本试剂盒的使用采用的反应系统为20pl反应系统1.样品DNA的提取100(^1被检样品中加入500WDA，涡旋15s，12000g离心lmin，取上清置于新管中；30(^1的DB溶液加到上清液中，涡旋或剧烈震荡90s;加入等体积的DC溶液，涡旋lmin、再经12000g离心lmin，弃去上清液，室温中放置5min待沉淀物干燥后加入10^1DD并将其溶解成样品DNA。2.反应液的配制取PBL5pl、RB12.5^1和EBl.Opl，置于小反应管中，再加入样品DNA5.5^1.混匀。3.反应的进行当LAMPTubidimeter温度到达65'C后，将加入各成分的反应管置于65。C恒温水浴中等温扩增45min。4.结果判定反应结束后，加入配制好的显色剂1W。肉眼观察阴性反应的反应液的颜色呈现橘红色，阳性样品的反应液呈现绿色。序列表<110>中国兽医药品监察所〈120〉猪细小病毒LAMP诊断试剂盒及其制备方法<歸4〈210〉1〈211>18〈212>腿<213〉ForwardOuterF3<223〉人工序列<400>1ACTAATCCATCAGACGCC18〈210〉2〈211>21〈212〉DNA<213>ReverseOuterB3:〈223>人工序列〈400〉2GTCTGTTTCTGAGAGTTTTGG21〈210〉3〈211>43〈212〉DNA〈213〉ForwardInnerFIP:〈223>人工序列<400〉3TCAGCTGCTGAGAAGTAGAAGTATGGCAGCAAAAGAACACGAC43<210>4〈211>43〈212〉腿<213>ReverseI匿rBIP〈223〉人工序列<400>4TTCATAAAAGAAACTGAACACGCAACACGCTTTGCTCTGAAGA4权利要求1.一种猪细小病毒LAMP检测试剂盒，其特征在于是由病毒DNA提取试剂和LAMP反应体系试剂以下两部分组成。2.如权利要求1所述一种猪细小病毒LAMP检测试剂盒，其特征在于其中的病毒DNA提取试剂组分的配方如下1)DA:1%2-巯基乙醇溶液lOml、pH8.0lOmmol/mLTris-HCL3ml、10mmol/mlEDTAlml，灭菌双蒸水加至30ml;2)DB:200mmol/mlNaOH15ml、1%SDS溶液15ml，终体积为30ml;3)DC:无水乙醇75ml，pH4.8200mmol醋酸钠lml;4)DD:RNAseA50u、无核酶水加至lOOml。3.如权利要求1所述一种猪细小病毒LAMP检测试剂盒，其特征在于其中的LAMP反应体系试剂组分的配方如下1)引物混合液PB:100pmol/WF3引物2.5rt、100pmol/WB3引物2.5^1、100pmol/rtBIP引物20W，100pmol/WFIP引物20W、灭菌去离子水5^1，终体积为2)反应缓冲混合液RB:4咖olAil硫酸镁50W、1.6molA4甜菜碱50W、10mmolAildNTPs50rt，475WPCR级水，终体积为625W;3)反应酶混合液EB:8U/HlBst大片段DNA聚合酶48W，0.lMmolA4DTT2W，终体积为50W;4)显色剂SYBRgreenI1W、PCR级水49W，终体积为5(H4。4.如权利要求l，3所述一种猪细小病毒LAMP检测试剂盒，其特征在于其中的LAMP反应体系试剂中所使用的一组引物是F3:ACTAATCCATCAGACGCCB3:GTCTGTTTCTGAGAGTTTTGGFIP:TCAGCTGCTGAGAAGTAGAAGTATG-GCAGCAAAAGAACACGACBIP:TTCATAAAAGAAACTGAACACGCAA-CACGCTTTGCTCTGAAGA5.—种猪细小病毒LAMP检测试剂盒的检测方法，其特征在于其中的病毒DNA提取方法10(Hil被检样品中加入500nlDA，涡旋15s，12000g离心lmin，取上清置于新管中；300|al的DB溶液加到上清液中，涡旋或剧烈震荡90s;加入等体积的DC溶液，涡旋lmin、再经12000g离心lmin，弃去上清液，室温中放置5min待沉淀物干燥后加入DD并将其溶解成样品DNA。全文摘要本发明涉及一种猪细小病毒LAMP检测试剂盒及其检测方法。根据GenBank公布的猪细小病毒(PPV)序列，在其保守序列区域设计了PPVLAMP引物；采用本发明人设计并配制的病毒DNA提取试剂提取PPV病毒DNA，使用本发明建立的PPVLAMP反应体系进行检测，反应结束后加入显色剂判定结果，结果显示在63℃45min，PPV病毒DNA获得了高效的特异性扩增。通过敏感性试验证明本方法可对2.3pgPPV病毒的DNA模板进行高效扩增，显示出本方法高度的敏感性，通过特异性实验和临床样品的PPV的检测，结果显示本发明的方法及试剂盒适合用于PPV的检测工作。文档编号C12Q1/70GK101575651SQ200910087100公开日2009年11月11日申请日期2009年6月24日优先权日2009年6月24日发明者刘业兵,宁宜宝,磊张申请人:中国兽医药品监察所