专利名称：用于检测人类K-ras基因突变的引物、探针及其使用方法
技术领域：
本发明涉及基因突变检测引物及该引物的使用方法，具体地涉及一种能检测人类K-ras基因7个热点突变的引物及其使用方法。
背景技术：
肿瘤发生发展的重要因素是细胞增殖、分化失控，细胞凋亡障碍及血管生成通路异常，它是一个多基因改变的积累过程。近年来研究显示K-ras基因活性物与细胞增殖、凋亡之间关系密切。突变K-ras基因使本应正常死亡的细胞的生存期延长，K-ras基因过度表达还能增加抗药物和紫外光诱导的凋亡，可能的机制是K-ras基因增强了细胞分解过氧化氢的能力从而抑制凋亡。K-ras基因能够根据激活信号的强度和质量、细胞类型和代谢环境诱导细胞抗凋亡通道，因此对K-ras基因突变的检测将有助于控制肿瘤细胞生长和凋亡制定出有效的治疗方案。
K-ras基因在调节细胞生长和分化方面具有重要作用，大约70％的肿瘤在不同程度上都与12、13位密码子突变有关，其它密码子突变在59、61位上。K-ras基因在骨肉瘤、软骨肉瘤、骨巨细胞瘤中均有高表达，K-ras基因激活与促进恶性骨肿瘤细胞的浸润及转移有关。而K-ras基因活化又与IV型胶原酶的高表达有密切联系，因此认为这种改变可能是K-ras基因促进肿瘤细胞侵润转移的分子调节机制之一。
K-ras基因在燕麦细胞癌中突变率占33％，结肠癌占44％，胰腺癌占90％。如果这些患者服用相关药物如Cetuximab(爱必妥)和Panitumumab(帕尼单抗)等药物，治疗效果不明显，如果样品为野生型，这些靶向药物对某些人群疗效非常好，但是价格昂贵，如果病人携带有K-ras突变而服用此类药物，不仅耽误病情还造成巨额药费的浪费。因此，在用药前筛查检测病人是否携带有K-ras基因突变显得尤为重要，也是未来肿瘤个体化治疗的发展方向。所以，如何快速准确地检测这些与药物反应性有关的K-ras基因突变成为人们亟待解决的问题。
建立对肿瘤病人K-ras基因突变检测方法不同于检测一般性的遗传突变，一般的遗传性突变即便是杂合性突变(异质性)和野生比例永远是1/1，靠一般的探针技术就可以对突变和野生进行很好的区分。然而，这些K-ras突变都是体细胞突变，提取模板中存在大量野生型DNA，突变所占比例不确定，直接来自手术切除的样品，突变比例高，可能达到20％以上，或许突变含量只有0.1％。虽然可以通过显微激光捕获样品中的肿瘤细胞，提高样品中肿瘤细胞的比率。不过即便是肿瘤细胞，也不是100％的肿瘤细胞都带有此类突变，处于不同肿瘤组织部位的细胞或许不太一样。如果是来自血液的样品突变含量或许会更低。这就是稀有突变检测的难点一面要具有高灵敏的检测能力——个位数甚至单个突变拷贝，另外必须保证极高的特异性——面对上千倍上万倍的野生型模板的干扰，不出现假阳性。
目前检测K-ras基因稀有突变的方法有多种，检测能力在1％～20％。主要有两大类，一类是非实时PCR，主要有测序和DHPLC，检测能力仅为20％和5％，而且需要PCR后处理，步骤繁琐，耗时长，容易污染；另一类是实时PCR，虽然都是基于实时PCR的技术平台，但是为了提高检测方法的选择能力，不同学者所用策略不尽相同。主要有完全依赖DNA序列自身识别特异性和依赖酶识别特异性两大类策略，有TaqMan探针、高分辨熔解曲线分析、竞争性抑制实时PCR方法，检测能力5％～20％之间，DxS蝎子引物法检测能力可达1％。
近年来，研究发现在病人的外周血液中能够检测到癌细胞逸出的突变DNA，成为良好的肿瘤早期诊断、治疗预后的生物标记。Kimura等(2006年)报道能够在循环血血清中检测到K-ras突变。认为检测这些外周血液中的突变DNA，可以知道靶向药物靶标位点的分子学特征，从而判断哪个药物对病人最有效。但是，外周血液中癌细胞的突变DNA是存在于大量野生型基因背景下的极为稀少的突变基因，其存在比率一般小于0.2％，即便是手术切除的肺癌组织中也混杂了大量的正常细胞，而且并不是所有的肿瘤细胞都带有突变。上述方法不能满足越来越多的无创的突变检测需要，因此能否准确无创地检测这类稀有突变对现有检测技术提出了挑战。
发明内容
为了克服现有技术检测能力有限，现提供一种荧光PCR检测K-ras基因突变的方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是针对K-ras基因的7个热点突变，设计的突变型引物以及特殊探针对待测样品分8个PCR管进行检测，其包括以下步骤 (1)根据K-ras基因12和13密码子的野生型基因序列和7种突变基因序列，设计多对高特异性简并引物和多个特异性双环探针。
(2)配制荧光PCR扩增突变基因序列的反应体系 (3)用步骤(1)的各种特异性简并引物和特异性双环探针分别扩增待测的7种点突变基因序列。
(4)利用双环探针与扩增产物的杂交，检测反应体系的荧光强度，以达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为结果判断的标准，Ct值为0或35阴性；Ct小于28阳性。
荧光PCR的反应体系为 1×PCR缓冲液、ddH2O MgCl2 5.0～10.0mmol dNTP各 0.8～1.5mmol 各对引物0.1~1.0μmol 各条探针0.5~1.0μmol Taq酶 2.0～3.0U 模板4.0～6.0μl 总体积 20～30μl 所述荧光PCR的反应条件是96℃预变性3分钟，15个循环95℃变性15秒，64℃退火25秒，72℃延伸10秒，35个循环95℃变性15秒，60℃退火25秒，72℃延伸10秒，35个循环，后35个循环在退火时检测FAM和HEX或ROX荧光信号。
所述的K-ras基因突变具体相见表1 表1K-ras基因12和13密码子的7种热点突变 所述特异性引物和特异性探针如下 1、根据K-ras基因12密码子第2位核苷酸由G突变为A而设计的一对上下游引物。其序列如下 K-ras-M1-FTGGTAGTTGGAGCTGA(SEQ ID NO1) K-ras-M1-RCTGCACCAGTAATATG(SEQ ID NO2) 2、根据K-ras基因12密码子第2位核苷酸由G突变为C而设计的一对上下游引物。其序列如下 K-ras-M2-FTGGTAGTTGGAGCTGC(SEQ ID NO3) K-ras-M2-RCTGCACCAGTAATATG(SEQ ID NO4) 3、根据K-ras基因12密码子第2位核苷酸由G突变为T而设计的一对上下游引物。其序列如下 K-ras-M3-FTGGTAGTTGGAGCTGT(SEQ ID NO5) K-ras-M3-RCTGCACCAGTAATATG(SEQ ID NO6) 4、根据K-ras基因12密码子第1位核苷酸由G突变为A而设计的一对上下游引物。其序列如下 K-ras-M4-FTGGTAGTTGGAGCTA(SEQ ID NO7) K-ras-M4-RCTGCACCAGTAATATG(SEQ ID NO8) 5、根据K-ras基因12密码子第1位核苷酸由G突变为C而设计的一对上下游引物。其序列如下 K-ras-M5-FTGGTAGTTGGAGCTC(SEQ ID NO9) K-ras-M5-RCTGCACCAGTAATATG(SEQ ID NO10) 6、根据K-ras基因12密码子第1位核苷酸由G突变为T而设计的一对上下游引物。其序列如下 K-ras-M6-FTGGTAGTTGGAGCTT(SEQ ID NO11) K-ras-M6-RCTGCACCAGTAATATG(SEQ ID NO12) 7、根据K-ras基因13密码子第2位核苷酸由G突变为T而设计的一对上下游引物。其序列如下 K-ras-M7-FTGGTGGAGCTGGTGA(SEQ ID NO13) K-ras-M7-RCTGCACCAGTAATATG(SEQ ID NO14) 8、与目标核酸扩增而得到的扩增产物杂交的双环探针序列及其修饰如下K-ras-PFAM-5’TCAAGGCGTGCCTTGACGATACAGCTCTGTAT 3’-TAMRA(SEQ ID NO15) 9、包括以HGH基因作为扩增模板的一对内控引物，分别命名为HGH-F、HGH-R，序列如下 HGH-F5′-GCCTTCCCAACCATT-3′(SEQ ID NO16) HGH-R5′-CATTCCCCAAGAGCTTAC-3′(SEQ ID NO17) 10、以一段HGH基因作为杂交对象的一对内控双环探针，其序列如下HGH-PHEX-5’TTGTCATTGACAACGCTATGCTCCATAGC 3’-TAMRA(SEQ ID NO18) 所述实时荧光PCR检测K-ras基因12和13密码子的7种突变的方法不包括对待测样品处理和模板提取步骤，但对于来自甲醛固定石蜡包埋的样品和来自血浆的样品所提的短片段DNA依然具有与新鲜组织样品DNA同样的扩增和检测能力。
本发明的有益效果是本发明在特异性引物和双环探针技术的基础上，建立了多重实时PCR检测7种K-ras基因12和13密码子的突变检测方法，此方法(1)灵敏度高，5-10拷贝的突变即可检出；(2)特异性强，10ng野生型基因组DNA不会有非特异信号；(3)选择性能力强，可以在10ng野生型基因组DNA背景下检出0.1％～1％的突变DNA；(4)检测速度快，整个检测过程需要90分钟。
图1为本发明实时荧光PCR检测7种K-ras基因突变的检测曲线图， (a)为本发明检测阴性对照检测曲线图； (b)为本发明检测7种K-ras基因突变的其中一种检测曲线图； 图2为实施例1中实时荧光PCR检测K-ras基因突变的检测曲线图，其中 (a)为样本中不含K-ras基因GGT＞GAT突变的荧光PCR扩增仪测定的荧光强度曲线； (b)为样本中含有K-ras基因GGT＞GAT突变的荧光PCR扩增仪测定的荧光强度曲线； (c)为灵敏度分析试验结果曲线图； (d)为选择性试验结果曲线图； 图3为实施例2中实时荧光PCR检测K-ras基因突变的检测曲线图，其中 (a)为样本中不含K-ras基因GGT＞AGT突变的荧光PCR扩增仪测定的荧光强度曲线； (b)为样本中含有K-ras基因GGT＞AGT突变的荧光PCR扩增仪测定的荧光强度曲线； (c)为灵敏度分析试验结果曲线图； (d)为选择性试验结果曲线图； 图4为实施例3中实时荧光PCR检测K-ras基因突变的检测曲线图，其中 (a)为样本中不含K-ras基因GGC＞GAC突变的荧光PCR扩增仪测定的荧光强度曲线； (b)为样本中含有K-ras基因GGC＞GAC突变的荧光PCR扩增仪测定的荧光强度曲线； (c)为灵敏度分析试验结果曲线图； (d)为选择性试验结果曲线图；
具体实施例方式 本发明以K-ras基因12和13密码子的7种突变为检测对象，通过特异引物的优化组合以及使用双环探针，从而实现快速准确、简单地检测7种突变，而且检测突变的能力高达0.1％~0.1％。
野生型细胞系H460的基因组DNA为野生型模板，以细胞系SW480为K-ras-M4(Gly12Ser)模板，其他6种缺失突变以经过基因工程构建的突变质粒作为突变模板，建立实时荧光PCR检测K-ras基因7种突变的反应体系，并将此体系用于K-ras基因突变的快速检测。此方法主要包括以下步骤 (1)根据Cosmic数据公布的K-ras基因12和13密码子的野生型基因序列和7种突变基因序列，设计多对高特异性简并引物和特异性双环探针。
(2)待测样品处理和模板提取。
(3)荧光PCR扩增。
(4)检测荧光信号，以达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为结果判断的标准。
步骤(1)中根据Cosmic数据公布的K-ras基因12和13密码子的野生型基因序列和7种突变基因序列，设计多对高特异性简并引物和特异性双环探针，详见表2。
其中步骤(2)样品处理和模板提取，样品适用范围包括新鲜肿瘤组织、石蜡组织块、石蜡组织玻片、血液、血浆等标本。对于样本的处理参照市场上相应的DNA提取试剂盒的操作说明。
步骤(3)的荧光PCR扩增的反应体系为 1×PCR缓冲液 MgCl2 7.0mmol dNTP各 1.0mmol 各对引物0.1~1.0μmol 各条探针0.5~1.0μmol Taq酶 1.0U 模板5μl 总体积 25μl 以上试剂组分Taq酶和dNTP购自TaKaRa生物公司。反应条件是96℃预变性3分钟，15个循环95℃变性15秒，64℃退火25秒，72℃延伸10秒，35个循环95℃变性15秒，60℃退火25秒，72℃延伸10秒，35个循环，后35个循环在退火时检测FAM和HEX或ROX荧光信号。
步骤(4)检测荧光信号的Ct值，是采用MX3000P荧光PCR扩增仪退火阶段检测荧光，一次可检测96份样品(包括阴阳性质控)。根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断结果Ct值为0或35表示呈阴性；Ct小于28表示呈阳性；Ct在28~35之间时，样品需重新检测。检测过程所需时间约为90分钟。
实施例1 以试剂盒中的试剂来检测临床采集的石蜡组织样本K-ras基因GGT＞GAT突变为例。根据Cosmic数据公布的K-ras基因12外显子的野生型基因序列和突变基因序列比较分析，设计一对引物和探针分别为K-ras-M1-F、K-ras-M1-R、K-ras-P。根据Cosmic数据公布的HGH基因的野生型基因序列分析，设计一对引物和探针分别为HGH-F、HGH-R、HGH-P。根据Cosmic数据公布的人类基因外显子4的野生型基因序列分析，设计一对引物和探针分别为EX-4-F、EX-4-R、 K-ras-M1-FTGGTAGTTGGAGCTGA K-ras-M1-RCTGCACCAGTAATATG K-ras-M2-FTGGTAGTTGGAGCTGC K-ras-M2-RCTGCACCAGTAATATG K-ras-M3-FTGGTAGTTGGAGCTGT K-ras-M3-RCTGCACCAGTAATATG K-ras-M4-FTGGTAGTTGGAGCTA K-ras-M4-RCTGCACCAGTAATATG K-ras-M5-FTGGTAGTTGGAGCTC K-ras-M5-RCTGCACCAGTAATATG K-ras-M6-FTGGTAGTTGGAGCTT K-ras-M6-RCTGCACCAGTAATATG K-ras-M7-FTGGTGGAGCTGGTGA K-ras-M7-RCTGCACCAGTAATATG K-ras-PFAM-5’TCAAGGCGTGCCTTGACGATACAGCTCTGTAT 3’-TAMRA(SEQ ID NO15) HGH-F5′-GCCTTCCCAACCATT-3′ HGH-R5′-CATTCCCCAAGAGCTTAC-3′ HGH-PHEX-5’TTGTCATTGACAACGCTATGCTCCATAGC 3’-TAMRA EX-4-FGACTCTGAAGATGTACCTATG EX-4-RTTGCTAAGTCCTGAGC EX-4-PHEX-5’-AAGGCATGATTTGCCTTCTAGAACAGTAGTGTTCTA-3’-TAMRA 利用上述荧光PCR体系检测临床采集的石蜡组织样本K-ras基因GGT＞GAT突变的方法包括以下步骤 (1)样品处理和模板提取接收来自临床的石蜡组织样品，样品切成5-10μm，加入1ml二甲苯脱蜡，离心收集沉淀，加入1ml无水乙醇到沉淀中，室温或37℃晾干，加入蛋白酶K和Buffer ATL，56℃消化裂解1小时，90℃孵化1h，加入200ml Buffer AL混匀再加入200μl无水乙醇充分混匀，将上清小心转移到QIA 2ml离心柱中，6000×g(8000rpm)离1min，加入500μl Buffer AW1，6000×g(8000rpm)离1min，小心打开盖子加入500μl Buffer AW2，6000×g(8000rpm)离1min，空管离心20000×g(14000rpm)离3min，加入100μl Buffer ATE于膜中央，温育5分钟，20000×g(14000rpm)离1min。取3μl测OD值，将提取的样品DNA稀释到2ng/μl，取5μl进行PCR反应。
(2)荧光PCR扩增，其反应体系为 1×PCR缓冲液、ddH2O MgCl27.0mmol dNTP各 1.0mmol K-ras引物0.5~1.0μmol K-ras探针0.5~1.0μmol HGH引物 0.5~1.0μmol HGH探针 0.5~1.0μmol Taq酶1.0U 模板 5μl 总体积 25μl 实时PCR反应条件是96℃预变性3分钟，15个循环95℃变性15秒，64℃退火25秒，72℃延伸10秒，35个循环95℃变性15秒，60℃退火25秒，72℃延伸10秒，35个循环，后35个循环在退火时检测FAM和HEX荧光信号。
(3)检测采用MX3000P实时PCR扩增仪(SRATGENE公司)退火阶段检测荧光，将含反应液的PCR管逐一放到荧光PCR扩增仪进行检测。根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断结果Ct值为0或35阴性；Ct值小于28阳性；Ct在28-35之间样品需重新检测，仪器检测时间为90分钟。
图2(a)为样本中不含K-ras基因GGT＞GAT突变的荧光PCR扩增仪测定的荧光强度曲线；图2(b)为样本中含有K-ras基因GGT＞GAT突变的荧光PCR扩增仪测定的荧光强度曲线； 共采收集100份临床样本，用前述的荧光PCR进行检测，同时采用传统的测序法进行验证。荧光PCR方法与传统测序检测方法结果的符合率为100％，荧光PCR灵敏度高于传统测序方法。见表3。
表3传统测序方法与荧光PCR检测方法的比较
(4)特异性分析 特异性检测以SW48细胞的DNA作为对照，对收集的样品进行K-ras基因GGT＞GAT突变检测，特异性分析结果表明，只有含有K-ras基因GGT＞GAT突变的样品有荧光信号，作为对照的SW48细胞DNA无荧光信号，同时采集血站100例血液样品，进一步证明荧光PCR的特异性。结果表明血站采集的血液样品DNA进行荧光PCR检测无荧光信号。
(5)灵敏度分析 以合成的含有K-ras基因GGT＞GAT突变的质粒DNA进行定量分析，取经定量后浓度为1000个拷贝数的样品DNA，进行10倍稀释，共做3个稀释度，然后依次取4个稀释度的5μl，8个平行组进行荧光PCR反应。本发明的荧光PCR方法灵敏度高，1-10copys/μl即可检出。见图2(c)。
(6)选择性试验 以合成的含有K-ras基因GGT＞GAT突变的质粒DNA的1000、100、10、1个拷贝数在10ng的背景下进行荧光PCR检测。本发明的荧光PCR方法选择性好。见图2(d)。
(7)重复性试验 分别取10例经传统测序方法验证为阳性和阴性的样品，重复10次进行荧光PCR扩增，10次Ct值相差不0.1个循环。
实施例2 以试剂盒中的试剂来检测临床采集的石蜡组织样本K-ras基因GGT＞AGT突变为例。根据Cosmic数据公布的K-ras基因12外显子的野生型基因序列和突变基因序列比较分析，设计一对引物和探针分别为K-ras-M4-F、K-ras-M4-R、K-ras-P。根据Cosmic数据公布的HGH基因的野生型基因序列分析，设计一对引物和探针分别为HGH-F、HGH-R、HGH-P。根据Cosmic数据公布的人类基因外显子4的野生型基因序列分析，设计一对引物和探针分别为EX-4-F、EX-4-R、K-ras-M1-FTGGTAGTTGGAGCTGA K-ras-M1-RCTGCACCAGTAATATG K-ras-M2-FTGGTAGTTGGAGCTGC K-ras-M2-RCTGCACCAGTAATATG K-ras-M3-FTGGTAGTTGGAGCTGT K-ras-M3-RCTGCACCAGTAATATG K-ras-M4-FTGGTAGTTGGAGCTA K-ras-M4-RCTGCACCAGTAATATG K-ras-M5-FTGGTAGTTGGAGCTC K-ras-M5-RCTGCACCAGTAATATG K-ras-M6-FTGGTAGTTGGAGCTT K-ras-M6-RCTGCACCAGTAATATG K-ras-M7-FTGGTGGAGCTGGTGA K-ras-M7-RCTGCACCAGTAATATG K-ras-PFAM-5’TCAAGGCGTGCCTTGACGATACAGCTCTGTAT 3’-TAMRA(SEQ ID NO15) HGH-F5′-GCCTTCCCAACCATT-3′ HGH-R5′-CATTCCCCAAGAGCTTAC-3′ HGH-PHEX-5’TTGTCATTGACAACGCTATGCTCCATAGC 3’-TAMRA EX-4-FGACTCTGAAGATGTACCTATG EX-4-RTTGCTAAGTCCTGAGC EX-4-PHEX-5’-AAGGCATGATTTGCCTTCTAGAACAGTAGTGTTCTA-3’-TAMRA 利用上述荧光PCR体系检测临床采集的石蜡组织样本K-ras基因GGT＞AGT突变的方法包括以下步骤 (1)样品处理和模板提取接收来自临床的石蜡组织样品，样品切成5-10μm，加入1ml二甲苯脱蜡，离心收集沉淀，加入1ml无水乙醇到沉淀中，室温或37℃晾干，加入蛋白酶K和Buffer ATL，56℃消化裂解1小时，90℃孵化1h，加入200ml Buffer AL混匀再加入200μl无水乙醇充分混匀，将上清小心转移到QIA 2ml离心柱中，6000×g(8000rpm)离1min，加入500μl Buffer AW1，6000×g(8000rpm)离1min，小心打开盖子加入500μl Buffer AW2，6000×g(8000rpm)离1min，空管离心20000×g(14000rpm)离3min，加入100μl Buffer ATE于膜中央，温育5分钟，20000×g(14000rpm)离1min。取3μl测OD值，将提取的样品DNA稀释到2ng/μl，取5μl进行PCR反应。
(2)荧光PCR扩增，其反应体系为 1×PCR缓冲液、ddH2O MgCl2 7.0mmol dNTP各 1.0mmol K-ras引物 0.5~1.0μmol K-ras探针 0.5~1.0μmol HGH引物0.5~1.0μmol HGH探针0.5~1.0μmol Taq酶 1.0U 模板 5μl 总体积 25μl 实时PCR反应条件是96℃预变性3分钟，15个循环95℃变性15秒，64℃退火25秒，72℃延伸10秒，35个循环95℃变性15秒，60℃退火25秒，72℃延伸10秒，35个循环，后35个循环在退火时检测FAM和HEX荧光信号。
(3)检测采用MX3000P实时PCR扩增仪(SRATGENE公司)退火阶段检测荧光，将含反应液的PCR管逐一放到荧光PCR扩增仪进行检测。根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断结果Ct值为0或35阴性；Ct值小于28阳性；Ct在28-35之间样品需重新检测，仪器检测时间为90分钟。
图3(a)为样本中不含K-ras基因GGT＞GAT突变的荧光PCR扩增仪测定的荧光强度曲线；图3(b)为样本中含有K-ras基因GGT＞GAT突变的荧光PCR扩增仪测定的荧光强度曲线； 共采收集100份临床样本，用前述的荧光PCR进行检测，同时采用传统的测序法进行验证。荧光PCR方法与传统测序检测方法结果的符合率为100％，荧光PCR灵敏度高于传统测序方法。见表4。
表4传统测序方法与荧光PCR检测方法的比较
(4)特异性分析 特异性检测以SW48细胞的DNA作为对照，对收集的样品进行K-ras基因GGT＞AGT突变检测，特异性分析结果表明，只有含有K-ras基因GGT＞AGT突变的样品有荧光信号，作为对照的SW48细胞DNA无荧光信号，同时采集血站100例血液样品，进一步证明荧光PCR的特异性。结果表明血站采集的血液样品DNA进行荧光PCR检测无荧光信号。
(5)灵敏度分析 以合成的含有K-ras基因GGT＞AGT突变的质粒DNA进行定量分析，取经定量后浓度为1000个拷贝数的样品DNA，进行10倍稀释，共做3个稀释度，然后依次取4个稀释度的5μl，8个平行组进行荧光PCR反应。本发明的荧光PCR方法灵敏度高，1-10copys/μl即可检出。见图3(c)。
(6)选择性试验 以合成的含有K-ras基因GGT＞GAT突变的质粒DNA的1000、100、10、1个拷贝数在10ng的背景下进行荧光PCR检测。本发明的荧光PCR方法选择性好。见图3(d)。
(7)重复性试验 分别取10例经传统测序方法验证为阳性和阴性的样品，重复10次进行荧光PCR扩增，10次Ct值相差不0.1个循环。
实施例3 以试剂盒中的试剂来检测临床采集的石蜡组织样本K-ras基因GGC＞GAC突变为例。根据Cosmic数据公布的K-ras基因13外显子的野生型基因序列和突变基因序列比较分析，设计一对引物和探针分别为K-ras-M7-F、K-ras-M7-R、K-ras-P。根据Cosmic数据公布的HGH基因的野生型基因序列分析，设计一对引物和探针分别为HGH-F、HGH-R、HGH-P。根据Cosmic数据公布的人类基因外显子4的野生型基因序列分析，设计一对引物和探针分别为EX-4-F、EX-4-R、K-ras-M1-FTGGTAGTTGGAGCTGA K-ras-M1-RCTGCACCAGTAATATG K-ras-M2-FTGGTAGTTGGAGCTGC K-ras-M2-RCTGCACCAGTAATATG K-ras-M3-FTGGTAGTTGGAGCTGT K-ras-M3-RCTGCACCAGTAATATG K-ras-M4-FTGGTAGTTGGAGCTA K-ras-M4-RCTGCACCAGTAATATG K-ras-M5-FTGGTAGTTGGAGCTC K-ras-M5-RCTGCACCAGTAATATG K-ras-M6-FTGGTAGTTGGAGCTT K-ras-M6-RCTGCACCAGTAATATG K-ras-M7-FTGGTGGAGCTGGTGA K-ras-M7-RCTGCACCAGTAATATG K-ras-PFAM-5’TCAAGGCGTGCCTTGACGATACAGCTCTGTAT 3’-TAMRA(SEQ ID NO15) HGH-F5′-GCCTTCCCAACCATT-3′ HGH-R5′-CATTCCCCAAGAGCTTAC-3′ HGH-PHEX-5’TTGTCATTGACAACGCTATGCTCCATAGC 3’-TAMRA EX-4-FGACTCTGAAGATGTACCTATG EX-4-RTTGCTAAGTCCTGAGC EX-4-PHEX-5’-AAGGCATGATTTGCCTTCTAGAACAGTAGTGTTCTA-3’-TAMRA 利用上述荧光PCR体系检测临床采集的石蜡组织样本K-ras基因GGC＞GAC突变的方法包括以下步骤 (1)样品处理和模板提取接收来自临床的石蜡组织样品，样品切成5-10μm，加入1ml二甲苯脱蜡，离心收集沉淀，加入1ml无水乙醇到沉淀中，室温或37℃晾干，加入蛋白酶K和Buffer ATL，56℃消化裂解1小时，90℃孵化1h，加入200ml Buffer AL混匀再加入200μl无水乙醇充分混匀，将上清小心转移到QIA 2ml离心柱中，6000×g(8000rpm)离1min，加入500μl Buffer AW1，6000×g(8000rpm)离1min，小心打开盖子加入500μl Buffer AW2，6000×g(8000rpm)离1min，空管离心20000×g(14000rpm)离3min，加入100μl Buffer ATE于膜中央，温育5分钟，20000×g(14000rpm)离1min。取3μl测OD值，将提取的样品DNA稀释到2ng/μl，取5μl进行PCR反应。
(2)荧光PCR扩增，其反应体系为 1×PCR缓冲液、ddH2O MgCl2 7.0mmol dNTP各1.0mmol K-ras引物 0.5~1.0μmol K-ras探针 0.5~1.0μmol HGH引物 0.5~1.0μmol HGH探针 0.5~1.0μmol Taq酶 1.0U 模板 5μl 总体积 25μl 实时PCR反应条件是96℃预变性3分钟，15个循环95℃变性15秒，64℃退火25秒，72℃延伸10秒，35个循环95℃变性15秒，60℃退火25秒，72℃延伸10秒，35个循环，后35个循环在退火时检测FAM和HEX荧光信号。
(3)检测采用MX3000P实时PCR扩增仪(SRATGENE公司)退火阶段检测荧光，将含反应液的PCR管逐一放到荧光PCR扩增仪进行检测。根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断结果Ct值为0或35阴性；Ct值小于28阳性；Ct在28-35之间样品需重新检测，仪器检测时间为90分钟。
图4(a)为样本中不含K-ras基因GGC＞GAC突变的荧光PCR扩增仪测定的荧光强度曲线；图4(b)为样本中含有K-ras基因GGC＞GAC突变的荧光PCR扩增仪测定的荧光强度曲线； 共采收集100份临床样本，用前述的荧光PCR进行检测，同时采用传统的测序法进行验证。荧光PCR方法与传统测序检测方法结果的符合率为100％，荧光PCR灵敏度高于传统测序方法。见表4。
表4传统测序方法与荧光PCR检测方法的比较
(4)特异性分析 特异性检测以SW48细胞的DNA作为对照，对收集的样品进行K-ras基因GGC＞GAC突变检测，特异性分析结果表明，只有含有K-ras基因GGC＞GAC突变的样品有荧光信号，作为对照的SW48细胞DNA无荧光信号，同时采集血站100例血液样品，进一步证明荧光PCR的特异性。结果表明血站采集的血液样品DNA进行荧光PCR检测无荧光信号。
(5)灵敏度分析 以合成的含有K-ras基因GGC＞GAC突变的质粒DNA进行定量分析，取经定量后浓度为1000个拷贝数的样品DNA，进行10倍稀释，共做3个稀释度，然后依次取4个稀释度的5μl，8个平行组进行荧光PCR反应。本发明的荧光PCR方法灵敏度高，1-10copys/μl即可检出。见图4(c)。
(6)选择性试验 以合成的含有K-ras基因GGT＞GAT突变的质粒DNA的1000、100、10、1个拷贝数在10ng的背景下进行荧光PCR检测。本发明的荧光PCR方法选择性好。见图4(d)。
(7)重复性试验 分别取10例经传统测序方法验证为阳性和阴性的样品，重复10次进行荧光PCR扩增，10次Ct值相差不0.1个循环。
序列表
<110>厦门艾德生物医药科技有限公司
<120>用于检测人类K-ras基因突变的引物、探针及其使用方法
<160>18
<210>1
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的K-ras-M1上游引物
<400>1
TGGTAGTTGG AGCTGA16
<210>2
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的K-ras-M1下游引物
<400>2
CTGCACCAGT AATATG16
<210>3
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的K-ras-M2上游引物
<400>3
TGGTAGTTGG AGCTGC 16
<210>4
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的K-ras-M2下游引物
<400>4
CTGCACCAGT AATATG 16
<210>5
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的K-ras-M3上游引物
<400>5
TGGTAGTTGG AGCTGT 16
<210>6
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的K-ras-M3下游引物
<400>6
CTGCACCAGT AATATG 16
<210>7
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的K-ras-M4上游引物
<400>7
TGGTAGTTG GAGCTA 16
<210>8
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的K-ras-M4下游引物
<400>8
CTGCACCAGT AATATG 16
<210>9
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的K-ras-M5上游引物
<400>9
TGGTAGTTG GAGCTC16
<210>10
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的K-ras-M5下游引物
<400>10
CTGCACCAGT AATATG 16
<210>11
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的K-ras-M6上游引物
<400>11
TGGTAGTTGG AGCTT15
<210>12
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的K-ras-M6下游引物
<400>12
CTGCACCAGT AATATG 16
<210>13
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的K-ras-M7上游引物
<400>13
TGGTGGAGC TGGTGA16
<210>14
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>化学合成的K-ras-M7下游引物
<400>14
CTGCACCAGT AATATG 16
<210>15
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>15
TCAAGGCGTG CCTTGACGAT ACAGCTCTGT AT32
<210>16
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>以HGH基因作为扩增模板的内控上游引物
<400>16
GCCTTCCCAA CCATT 15
<210>17
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>以HGH基因作为扩增模板的内控下游引物
<400>17
CATTCCCCAA GAGCTTAC18
<210>18
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>18
TTGTCATTGA CAACGCTATG CTCCATAGC29
权利要求
1、用于检测人类K-ras基因突变的引物及探针，其特征在于包括
以下序列的引物对
(1)TGGTAGTTGGAGCTGA(SEQ ID NO1)
CTGCACCAGTAATATG(SEQ ID NO2)
(2)TGGTAGTTGGAGCTGC(SEQ ID NO3)
CTGCACCAGTAATATG(SEQ ID NO4)
(3)TGGTAGTTGGAGCTGT(SEQ ID NO5)
CTGCACCAGTAATATG(SEQ ID NO6)
(4)TGGTAGTTGGAGCTA(SEQ ID NO7)
CTGCACCAGTAATATG(SEQ ID NO8)
(5)TGGTAGTTGGAGCTC(SEQ ID NO9)
CTGCACCAGTAATATG(SEQ ID NO10)
(6)TGGTAGTTGGAGCTT(SEQ ID NO11)
CTGCACCAGTAATATG(SEQ ID NO12)
(7)TGGTGGAGCTGGTGA(SEQ ID NO13)
CTGCACCAGTAATATG(SEQ ID NO14)和
以下序列的探针
FAM-5’TCAAGGCGTGCCTTGACGATACAGCTCTGTAT 3’-TAMRA(SEQ ID NO15)
以及内控引物对
5′-GCCTTCCCAACCATT-3′(SEQ ID NO16)
5′-CATTCCCCAAGAGCTTAC-3′(SEQ ID NO17)
和内控双环探针
HEX-5’TTGTCATTGACAACGCTATGCTCCATAGC 3’-TAMRA(SEQ ID NO18)
2、一种检测人类K-ras基因突变的方法，其特征在于，其步骤为
(1)提供权利要求1所述的引物及探针；
(2)配制荧光PCR扩增突变基因序列的反应体系
(3)用步骤(1)的引物和特探针分别扩增待测的7种点突变基因序列；
(4)利用双环探针与扩增产物的杂交，检测反应体系的荧光强度，以达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为结果判断的标准，Ct值为0或35阴性；Ct小于28阳性。
3、如权利要求2所述的一种检测人类K-ras基因突变的方法，其特征在于，其荧光PCR的反应体系为
1×PCR缓冲液
MgCl2 5～10mmol
dNTP各0.8～1.5mmol
各对引物 0.1～1.0μmol
各条探针 0.5～1.0μmol
Taq酶 0.8～1.5U
模板 4～6μl
总体积20～30μl
4、一种检测人类K-ras基因突变的检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒至少包括
以下序列的引物对
(1)TGGTAGTTGGAGCTGA(SEQ ID NO1)
CTGCACCAGTAATATG(SEQ ID NO2)
(2)TGGTAGTTGGAGCTGC(SEQ ID NO3)
CTGCACCAGTAATATG(SEQ ID NO4)
(3)TGGTAGTTGGAGCTGT(SEQ ID NO5)
CTGCACCAGTAATATG(SEQ ID NO6)
(4)TGGTAGTTGGAGCTA(SEQ ID NO7)
CTGCACCAGTAATATG(SEQ ID NO8)
(5)TGGTAGTTGGAGCTC(SEQ ID NO9)
CTGCACCAGTAATATG(SEQ ID NO10)
(6)TGGTAGTTGGAGCTT(SEQ ID NO11)
CTGCACCAGTAATATG(SEQ ID NO12)
(7)TGGTGGAGCTGGTGA(SEQ ID NO13)
CTGCACCAGTAATATG(SEQ ID NO14)和
以下序列的探针
FAM-5’TCAAGGCGTGCCTTGACGATACAGCTCTGTAT 3’-TAMRA(SEQ ID NO15)
5、如权利要求4所述的一种检测人类K-ras基因突变的检测试剂盒，其特征在于，还包括
作为内控的引物对
5′-GCCTTCCCAACCATT-3′(SEQ ID NO16)
5′-CATTCCCCAAGAGCTTAC-3′(SEQ ID NO17)
和内控双环探针
HEX-5’TTGTCATTGACAACGCTATGCTCCATAGC 3’-TAMRA(SEQ ID NO18)
6、如权利要求4或5所述的一种检测人类K-ras基因突变的检测试剂盒，其特征在于，进一步包括分装于PCR反应管中的PCR反应缓冲液及DNA聚合酶。
全文摘要
用于检测人类K-ras基因突变的引物、探针及其使用方法，涉及基因突变的检测。本发明将荧光定量PCR技术与荧光双环探针技术方法相结合，发展了一种可以快速检测基因突变的多重实时荧光PCR方法并设计了相关引物。将该方法用于检测K-ras基因第12位和第13位密码子发生的突变，分别采用针对其不同突变方式设计的突变型引物对待测样品进行检测，只有突变型样品能被顺利扩增出双链DNA产物，该产物才能与双链DNA探针结合，发出荧光信号从而被检测到。本发明可检测到样品中含量为1/1000的突变型基因。具有快速、简便、安全、高灵敏、高通量和低成本等优点，可用于大量临床样本的K-ras基因突变筛查。
文档编号C12N15/11GK101608241SQ20091011150
公开日2009年12月23日 申请日期2009年4月13日 优先权日2009年4月13日
发明者力 阮, 何东华, 郑立谋 申请人:厦门艾德生物医药科技有限公司