专利名称：一种二价血红素肽铁的纯化方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物制品及其制备方法，具体而言是提供一种二价血红素肽-铁的制作及 其分离纯化方法。应用领域为补铁胶囊、补铁冲剂、补铁口服液或补铁饮料。
背景技术：
铁是绝大生物体内不可缺少的营养素，在成人体内约含4-5克，仅占体重的万分之一， 比例极低，人体中大多数铁是存在细胞内以血红蛋白(76%)和铁蛋白(23%)形式存在的。但其 作用却非常重要。铁是机体生成血红蛋白、肌红蛋白及含铁酶类的基础原料，是人体必需的 微量元素，在体内参与氧和二氧化碳的运输，是细胞色素氧化酶、过氧化酶等组织呼吸酶的 组成部分。因此铁代谢的重要性已远远超过了红细胞和血红蛋白的范围。
膳食中若长期缺铁或铁吸收障碍，则可引起缺铁性贫血(IDA)，影响红细胞的代谢，降低 人体免疫功能，并对青少年儿童的生长发育和智力发育造成严重影响。据统计，在我国营养 性贫血中有95.65%是因为缺铁性贫血所致，而7岁以下儿童中，缺铁性贫血大约为20% 70%。目前传统补铁剂，如硫酸亚铁、富马酸亚铁等均为无机铁，在体内利用率低，吸收率 大约在5% 8%，而且副作用大，常会引起恶心、腹胀、消化不良、腹泻、便秘等症状，此 外，还有特殊的铁腥味。肽铁螯合物中的铁较硫酸亚铁更易利用和吸收。
缺铁性贫血是世界范围内特别是发展中国家普遍存在的营养缺乏病。目前世界上的各种 口服铁剂多达近百种，如硫酸亚铁、葡萄糖酸亚铁、柠檬酸亚铁等。治疗IDA，国内外多采 用铁剂疗法，尽管这些产品有一定的疗效，但存在如下问题(l)生物利用率低如流行了200 多年的硫酸亚铁，就难以被人体吸收，吸收率约为1.6%，其他无机态的铁剂和有机态的铁剂， 吸收率也在3%-5%之间。(2)副作用大这些铁剂产品，均破坏人体金属离子的平衡，引起 胃肠道不良反应，为了减轻胃肠道不适的副作用，要求饭后服用，此时膳食中的磷酸、植酸 因抑制铁吸收，而使其吸收率更为下降。(3)口感差，不易坚持这些产品常有一定的铁锈味， 口感不好，加之治疗IDA常需长达数月(2-6个月)的疗程，更难以坚持。
补铁剂存在的上述问题，也正是长期以来，IDA在全球范围内没有得到根本改善的主要 原因。
补铁剂有三种态型即无机态，如硫酸亚铁；有机态，如葡萄糖酸亚铁；生物态，如血红素肽铁。就三种态型的铁剂对人体的益处而言，其顺序为生物态铁>有机态铁>无机态 铁。
科学家对铁剂的吸收试验证实，血红素肽铁在小肠内的吸收率可从23-27%,而非血红素
肽铁(蔬菜、水果、豆类等植物性食品中所含的铁)的吸收率仅为3-6%。所谓的二价血红素肽 铁(Hemepeptide-iron)是一种生物铁，能被小肠黏膜细胞直接吸收，不会直接产生任何消化 特征刺'激'性症状，且吸收率高达91%。研究表明，二价状态的铁较三价状态的铁更有利于人 体的吸收，有机态铁比无机态铁对肠胃刺激性小，且易于吸收，血红素肽铁较非血红素肽铁 易于吸收。
可见，二价状态的血红素肽铁是最易被人体吸收的生物态铁剂，是生物态铁剂的最佳利 用态，其生物利用率最高。
畜禽血液资源十分丰富，中国是肉类生产大国，改革开放20多年来我国的禽畜产量持续 增长，肉类总产量年均递增11%。在畜禽屠宰副产品骨血的深加工方面发展也比较迟缓，利 用率不至!J 10%，除部分以血豆腐和血粉、骨粉等初级加工形式利用外，相当一部分以污水的 形式排方夂或丢弃，致使大量宝贵营养资源流失，且造成严重的环境污染。有些加工产品还属 于饲料级，食品级的还需要从国外进口，血浆蛋白粉和血球蛋白粉生产技术上与国外还有一 定差距。如血浆蛋白粉中免疫球蛋白的变性率较高，红血球破壁技术没有得到有效的解决， 血球蛋白粉的消化吸收较差等。畜禽骨血的综合利用中一些关键技术薄弱，综合利用率低。
二〈介血红素肽-铁主要是利用畜禽血液为原料，经抗凝、血红蛋白降解等工艺加工而来。 以猪为伊J，猪血约占生猪体重的5.0% 6.0%,血液中蛋白质含量高达17% 20%，其中2% 为具有生理活性的免疫球蛋白。猪血蛋白中含人体所需的8种必需氨基酸，其组成平衡，是 一种优质蛋白质。血液中的免疫球蛋白、转移因子等活性物质在被动免疫功能等方面有显著 的作用，猪血中铁含量达2.1 g/kg 2.2g/kg，是一种天然有机铁(卟啉铁)，卟啉铁为铁的有 机形式，有利于人体吸收，无任何不良反应，可有效补充人体铁质。适应于人体某时期需铁 增加(女口婴儿和孕妇)、肉类及肝脏摄取不足以及各种缺铁性贫血，是一种良好的天然补血剂。
血红素肽铁在食品、医药方面的应用发展很快，其制备方法也较多，如冰醋酸法。碱基 物一有机溶剂法，离子交换纤维素法等。但它们都有一定的局限性和缺陷，影响产品的得 率和质量。中国专利CN1094618A公开了"一种从畜血中提取血红素与蛋白质粉的方法"，其 工艺过禾呈是先将畜血制成合格的血粉，再将血粉在无水条件下用吡啶为主的混合溶剂抽提血 红素，^由提后的血粉经乙醇洗涤后成为蛋白质粉，抽提液减压蒸干即得血红素。该工艺过程 较为复杂，有效成份有一定损失因而收率不太高，耗用大量化学试剂，成本高，提取的血红 素极不稳、定。加之使用吡啶为主的混合溶剂进行抽提血红素，具有一定的毒性和异味，污染
5环境，危害健康。因此其应用受到较大的限制。中国专利CN1362525公开了一种利用超滤、 酶解法制备小肽血红素的方法，虽然该方法较少的引入化学试剂，但全过程过于繁琐(12步 骤)，并且在超滤过程中血红素损失过多，所加入的酶制剂成本过高，因此仍然不能满足应用 要求。
因此，需要一种避免过多使用化学试剂、过程简单且能利用禽畜废弃血源的成本低廉的 分离纯化血红素肽铁的方法。
发明内容
本发明原理是利用目前尚未大规模开发的畜禽血液为原料，在真空环境条件下，结合高 频率脉冲电场，利用蛋白酶降解血红蛋白，经金属螯合亲和层析或电磁分离等方法分离出二 价血红素肽铁，其纯度达90°/。以上，应用领域为补铁胶囊、补铁冲剂、补铁口服液或补铁饮 料。
因此，本发明第一个目的是提供一种二价血红素肽铁的制备方法，包括:
(1) 从畜禽血液中分离血红细胞，并加入抗凝剂处理；
(2) 分散血红细胞，并离心收集红细胞沉淀物；
(3) 超声波破壁血红细胞，释放出血红蛋白后，根据所用的降解酶调节pH;
(4) 添加降解酶溶液，并在真空室中进行高频脉冲处理，使得酶充分降解血红蛋白，释放 二价血红素肽铁；
(5) 高温灭活酶后，离心收集上清液；
(6) 将上清液通过金属螯合亲和层析或电磁分离，纯化收集二价血红素肽铁。
其中，在一个实施方案中，步骤4中是通过200kHz脉冲频率作用4小时进行高频脉冲 处理。在一个具体实施方案中，步骤4中的高频脉冲的电场参数为T广500.0us、 T2500.0us、 A1.000ms、 fl.000KHz、 V山88v、 V2-120mv、 h20.3、脉冲波型为双向方波，电极间距为1.2cm， 脉冲频率为200kHz。在另一个具体实施方案中，步骤4中将真空室内的真空度在1分钟时间 内降至为0.01MPa，接通电源将真空室内的温度恒定为37。C，维持4小时，在真空和高频脉 冲电场环境条件下，利用蛋白酶降解血红蛋白。
其中，在另一个实施方案中，步骤6中经过电磁分离器的血红蛋白降解液流速为 1 2cm7min，回流处理3~4次，再在去离子蒸馏水洗漆5min，解除磁性，释放出的柱内壁物 即为二价血红素肽铁。在一个具体实施方案中，电磁铁中心磁场为1.2T，磁场中心安装一根 直径为5mm，长为200mm的玻璃柱，玻璃柱外围用130m长、直径为5um的含300种合金 组成的不锈钢丝绕制成磁性玻璃柱，电磁分离所用的直流电源电流量不少于20A，电压不少于50V。在另一个具体实施方案中，将血红蛋白降解液以40 120ml/h的流速均匀的沿管内壁 自上往下流经电磁铁中心，玻璃柱管与电磁铁中心横切面的角度为15Q。接通电源，电流达到 20A。当流出液达到20ml后，即可切断电源，解除电磁，用细胞分离缓冲液冲洗管内物质， 即为二价血红素肽铁。
还在前述的实施方案中，步骤4中添加6000U/mL胰蛋白酶；步骤5中通过将真空度维 持在0.01MPa、升高真空室温度至95'C、 10-30分钟，以高温灭火酶。
在一个具体实施方案中，步骤1中使用0.2%柠檬酸三钠和0.15%的柠檬酸钠混合物作抗 凝剂，按血液重量的5%添加到血液中；步骤2中按10%血液重量添加2。/。D-葡萄糖、0.85% NaCl、 0.05%拧檬酸、0.08%拧檬酸钠，配制成细胞分散液，静置5分钟，在5000r/min转速 离心30分钟，弃去上清液，收集沉淀物。在一个具体实施方案中，步骤3中使用胰蛋白酶则 调节pH值至8.0，使用中性蛋白酶则调节pH至7.0，以防止血红蛋白中铁离子发生氧化反应。 本发明第二个目的是提供一种二价血红素肽铁补血饮料的制备方法，包括
(1) 按照上述任一方案纯化收集二价血红素肽铁；
(2) 加入西红柿汁红枣汁、甘草汁、当归汁、黄芪汁、生地汁、甜菊糖、蛋白糖、卡拉胶、 海藻酯钠进行调配，并用超纯净水调节至1L,而后用柠檬酸、磷酸氢二钾或磷酸二氢 钾调节pH至4.0;
(3) 将调配的混合液，加热至65。C， 0.18MPa真空度下真空脱气，然后用均质机在30MPa 下均质二次；
(4) 高温杀菌后，进行灌装，即得二价血红素肽铁补血饮料。 本发明第三个目的是提供由上述方法所制备的二价血红素肽铁补血饮料。 在一个实施方案中，所制备的饮料组成包括5g/L 二价血红素肽-铁、38mL/L西红柿汁、
28 mL/L红冬汁、8 mL/L甘草汁、6.5mL/L当归汁、4.0mL/L黄芪汁、2.7mL/L生地汁、1.5g/L 甜菊糖、1.0g/L蛋白糖、0.8g/L卡拉胶、0.5g/L海藻酯钠，用超纯净水调节至1L，用柠檬酸、 磷酸氢二钾或磷酸二氢钾调节pH至4.0;或者，
血红素肽-铁5g/L、西红柿汁100ml/L、红枣汁160ml/L、甘草汁150ml/L、蜂蜜45 ml/L、 黄贫30mL/L、党参120mL/L、枸杞40mL/L、 CMCNa0.3g/L，海藻酸钠0.2g/L，维生素C O.lg/L , 苋菜红0.035mg/L，用柠檬酸0.85g/L调节pH至4.0;或者
血红素肽-铁5g/L、西红柿汁200ml/L、红枣汁140ml/L、甘草汁50 ml/L、蜂蜜25 ml/L、 CMCNa0.3g/L,海藻酸钠0.2g/L， Vc O.lg/L，用柠檬酸、磷酸氢二钾或磷酸二氢钾调节pH至 4.0。
7有益效果
1. 本发明的方法步骤简单，所用的化学试剂均为可食用的添加剂，避免了化学试剂残留毒性 和异味；
2. 所用的酶制剂为工业上廉价的酶制剂，成本低廉；
3. 通过超声波处理血细胞，可最大量地释放出血红蛋白；
4. 通过电场高频脉冲处理，可实现实时自动化操作，联合酶制剂降解后，可完全释放出血红 素肽铁成分；
5. 通过电磁分离，避免了超滤或层析分离导致的有效成分丧失，从而获得更高的产率。
6. 本方法纯化的二价血红素肽-铁，纯度可达卯％以上，完全满足血红素肽-铁功能食品或饮 料的生产需求。
具体实施方案
实施例h畜禽血液的红细胞分离
(1) 血液收集
经检验合格的健康畜禽，绝食静养24小时(期间只喂水)，运送到屠宰车间，用管式真 空采血刀迅速收集血液于可密封的容器(无毒塑料袋、无毒塑料瓶、不锈钢等容器)中。
(2) 抗凝处理
采血前3 5分钟，将0.2%柠檬酸三钠和0.15%的柠檬酸钠混合物作抗凝剂，按采血量的 5%添加到血液收集容器中，按100r/min与血液一起搅拌3分钟。
(3) 红细胞分离
在经抗凝处理的血液中添加血液量的10%的2%0-葡萄糖、0.85% NaCl、 0.05%柠檬酸、 0.08%拧檬酸钠配制成细胞分散液，静置5分钟，在5000r/min转速离心30分钟，弃去上清 液，收集沉淀物，重复操作二次。
实施例2:红细胞破壁
(1) 红细胞破壁
按红细胞沉淀物量的2倍添加蒸馏水，放置在超声波处理器内处理2分钟，红细胞破壁， 释放出血红蛋白。
(2) 调节血红蛋白溶液pH调节血红蛋白溶液pH值，使之符合蛋白酶最佳降解的pH值，如使用胰蛋白酶，则调节 pH值至8.0，采用中性蛋白酶，则调节pH至7.0，调节pH时间在2分钟内完成，主要是防 止血红蛋白中铁离子发生氧化反应。
实施例3:在真空高频脉冲环境条件下，蛋白酶降解血红蛋白 (1)对真空高频脉冲蛋白酶解血红蛋白设备的要求
真空室真空室可承受0.01MPa以下的真空度，维持6小时真空度变化在±0.2 3以内。 高频脉冲脉冲电场参数为Ti-500.0us、 T2500.0us、 M.000ms、 fl.OOOKHz、 Vil.88v、 V2-120mv、 h20.3、脉冲波型为双向方波，电极间距为1.2cm，脉冲频率为200kHz。
(2) 添加蛋白酶
在经破壁、调节血红蛋白溶液pH的溶液，添加6000U/mL的蛋白酶液，50r/min搅拌2 分钟，密封容器，并置于真空室内。
(3) 插入脉冲电极
将已与脉冲信号发生器连接好的脉冲电极插入盛有血红蛋白溶液的密闭容器内，两极距 离为1.2cm，检査真空泵、脉冲信号发生器管道及线路是否接好，关闭真空室门，开启真空 泵抽真空。
(4) 调节真空室温度和真空度
将真空室内的真空度在1分钟时间内降至为O.OlMPa，接通电源将真空室内的温度恒定 为37'C，维持4小时，在真空和高频脉冲电场环境条件下，利用蛋白酶降解血红蛋白。
实施例4:终止蛋白酶活性
(1) 灭酶
切断脉冲信号发生器电源，将真空室内的温度升高至95°C，维持IO分钟。加热期间真 空室内真空度仍维持在O.OlMPa。
(2) 冷却
关闭真空室加热电源，使真空室内温度达到室温时，关闭真空泵电源，解除真空室内真 空度，取出盛有血红蛋白降解液的密闭容器。
(3) 离心
将血红蛋白降解液迅速倒入能密闭的离心管内，加入量为离心管高度的3/4，迅速密闭 离心管，放入离心机内，在5000r/min离心15分钟。收集上清液于密闭容器内密封，如要放 置时间在4小时以上时，必须在-18t:冻藏。实施例5: 二价血红素肽铁的分离
(1)金属螯合亲和层析(IMAC)分离二价血红素肽铁
亲和层析柱填充料的制备称取30克琼脂粉，按lg琼脂粉加50ml缓冲液的比例加入 pH4.0、 0.04mol/L醋酸钠缓冲液搅拌抽提，抽提后过滤沉淀物，水洗3次。再按照上述比例 用pH9.0、 0.05mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液抽提，搅拌6小时，水洗至中性，沥干，得到 湿琼脂粉。湿琼脂粉加入150ml、 1.6mol/L氢氧化钠溶液，于25'C边搅拌边加入57ml丙酮和 28.5ml环氧氯丙垸，反应12小时后，用去离子水洗净至中性。然后再加入520ml、 O.lmol/L 碳酸钠溶液(含9%亚氨基二乙酸)，用6 mol/L氢氧化钠调pH至11， 25'C搅拌反应12小时。 取50g反应物，加入80ml、 5Ommol/L、 pH6.0磷酸钠缓冲液(含5mg/ml氯化铜、lmol/L氯 化钠)，25'C搅拌反应12小时，用去离子水充分洗净沥干，即得到亲和层析柱填充料。
装柱准备一根直径025cm,长为100cm的层析柱，垂直固定在滴定试管支架上，关闭 旋钮，注入管长的1/4的蒸馏水，将准备好的亲和层析柱填充料用1倍量的蒸馏水溶解，缓 缓注入层析柱内，流速为2cm/min，填充料高度离层析柱口 3cm时，填充结束，用蒸馏水平 衡30分钟。
层析安装柱层析分离系统，将紫外检测吸收峰调至410nm，自动收集分离液。 (2)电磁分离二价血红素肽铁
电磁分离设备由超导体材质的电磁铁、内充液态氦的真空瓶和由不锈钢丝环绕的塑料胶 管构成。真空瓶内充入液态氦；电磁铁高度一般设计为25cm，，内径50mm，外径200mm， 电磁铁中心磁场为L0 1.5T;塑料胶管中心外侧绕有5cm长的40um的不锈钢丝，密度为 150cm2/cm，以增强中心的电磁强度。
直流电源直流电源电流量不少于20A，电压不少于50V。
电磁分离血红蛋白降解液以4(M20ml/h的流速均匀的沿管内壁自上往下流经电磁铁中心， 玻璃柱管与电磁铁中心横切面的角度为150。接通电源，电流达到20A。当流出液达到20ml后， 即可切断电源，解除电磁，用细胞分离缓冲液冲洗管内物质，即为二价血红素肽铁水溶液。
实施例6: 二价血红素肽铁浓縮干燥及低温保藏
所得的二价血红素肽铁在4小时以内利用，需冷却保存；如在4小时以后利用，则需冷冻 保藏或冷冻干燥。
(1)浓縮干燥
经金属螯合亲和层析(IMAC)及电磁分离的二价血红素肽铁，置于真空冷冻干燥箱内，在-40。C，真空度0.018mPa下干燥处理10小时，即获得浓缩千燥的二价血红素肽铁。 (2)低温保藏
将浓縮干燥后的二价血红素肽铁，经真空包装后(也可放入能密封的玻璃容器内)在-18 'C冻藏。
实施例7: 二价血红素肽铁纯度及分子质量的测定
(1) 二价血红素肽铁纯度的测定
利用高效凝胶色谱、Native—PAGE电泳、紫外可见扫描三种方式测定二价血红素肽铁纯度。
① 高效凝胶色谱方法色谱柱选择葡萄糖凝胶-200 (SephaCrylTmS-200);流动相超纯 净水，流速0.5ml/min;检测器温度25'C。取猪血红蛋白酶解产物用0.5pm微孔滤膜过滤， 取50pl注入色谱仪，测定结果为在300nm处只有一个明显吸收峰。
② Native—PAGE电泳方法非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)是在不加入SDS 疏基乙醇等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，可以使生物大 分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷，因而可以得到较高的分辨率，对于生物大分子 的鉴定有重要意义。非变性聚丙烯酰胺凝胶和变性SDS-PAGE电泳在操作上基本上是相同的， 只是非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制和电泳缓冲液中不能含有变性剂如SDS等，从 Natve-PAGE蛋白质凝胶电泳图中只发现一条明显色带。
③ 紫外可见扫描方法用紫外分光光度计对样品在200-800nm范围内进行扫描，观察有 无特征吸收峰。
(2) 二价血红素肽铁分子质量的测定
① 二价血红素肽铁含量的测定
采用三波段扫描方法。在525、545、565和575nm下测定其吸光度值，按血红素肽(mmol/L) 含量=(一0.166Ri+0.086R2+0.088R3+0.099) xA525，其中R] =A575/A525、 R2=A565/A525、 R3 =A545/A525，计算其含量。
② 二价血红素肽铁分子质量的测定
采用基质辅助激光解析串联飞行时间质谱方法先点1^L的样品于MALDI靶板上，自 然干燥后，再点上1^L饱和基质CHCA (a-氰基-4-羟基肉桂酸)溶液，在室温下自然干燥。 用autoflex III smartbean串联飞行时间质谱仪进行质谱分析，激光源为335 nm波长的Smart beam固态激光，加速电压为20 kV，采用正离子模式收集数据。样品的肽质量指纹图谱(PMF) 质量扫描范围为3000-20000 Da，测定二价血红素肽铁分子质量为7529.0968 Da。
11铁离子测定 采用原子吸收分光光度计方法原子吸收工作参数波长248.3nm，狭缝0.2 nm，灯 电流3mA， 空气-乙炔1.5L/min，氩气流量6.5L/min。量取5mg血红素肽-铁置于锥形瓶 中，加入硝酸、高氯酸(4: l)lO.OmL ，于电热板上加热至不冒黄烟，取下冷却，加5%盐酸 2.0mL,继续加热除酸至冒白烟止。冷却，用5%盐酸少量多次洗涤、定容至50mL容量瓶 中，即得待测溶液。在设定好的原子吸收分光光度计的工作参数条件下，测得血红素肽铁中铁的含量为1013.500 ug/L。(3)中试生产的血红素肽铁收率及纯度 经中试生产出二价血红素肽铁的收率及纯度见下表。表1血红素肽-铁中试生产的收率新鲜血液分离后的低温干燥物纯度 (%)批次重量 (kg)血红蛋白含量 (%)干燥物重量 (kg)水分 (%)110017.66. 852.592.5115017.810, 723, 194. 2140017. 530. 653.395.7实施例8: 二价血红素肽铁补血饮料 (1)原料分离出的二价血红素肽铁、西红柿、红枣(干)、甘草、甜味剂、增稠剂。 (2)取汁西红柿采用榨汁方法提取汁液将经挑选符合加工需要的西红柿用置于清水池内浸泡30分钟，再用流动清液清洗15分钟，沥干水分，放入螺旋式榨汁机内搾汁。红枣(干)采用保温浸提方法提取汁液将无病虫害，无霉变的干红枣，用流动清水清洗3分钟，鼓风机鼓风吹干。再放入面火为15(TC，底火为120。C的远红外电烤箱内，焙 烤15分钟。取出，并加入红枣重量8倍的纯净水，在85"条件下保温8小时。然后，放 入板式压榨机里压榨取汁。 甘草汁的提取选用肉质淡黄色，粉质足的浆果类甘草，经粉碎后，按甘草重15倍添加 蒸馏水，在100'C下煮沸30分钟，过滤即得甘草汁。 (3)调配根据不同地区人群消费对产品感官要求不同，设计了三种配方。1L二价血红素肽-铁补血口服液配方一5g/L 二价血红素肽-铁、38mL/L西红柿汁、28mL/L红零汁、8 mL/L甘草汁、6.5mL/L当归汁、4.0mL/L黄甚汁、2.7mL/L生地汁、1.5g/L甜菊糖、1.0g/L蛋白糖、0.8g/L卡拉胶、0.5g/L海藻酯钠，用超纯净水调节至1L，用柠檬12酸、磷酸氢二钾或磷酸二氢钾调节pH至4.0;1L二价血红素肽-铁补血口服液配方二血红素肽-铁5g/L、西红柿汁100ml/L、红枣汁160 ml/L、甘草汁150 ml/L、蜂蜜45 ml/L、黄芪30mL/L、党参120mL/L、枸杞40mL/L、CMCNa0.3g/L， 海藻酸钠0.2g/L，维生素C0.1g/L ，苋菜红0.035mg/L，用柠檬酸0.85g/L调节pH至4.0;1L二价血红素肽-铁补血口服液配方三血红素肽-铁5g/L、西红柿汁200ml/L、红枣汁140 ml/L、甘草汁50ml/L、蜂蜜25 ml/L、 CMCNa0.3g/L，海藻酸钠0.2g/L， Vc0.1g/L，用柠檬酸、 磷酸氢二钾或磷酸二氢钾调节pH至4.0。(4) 均质将调配的混合液，加热至65'C， 0.18MPa真空度下真空脱气15分钟，用均质机在30MPa 下均质二次。(5) 杀菌在100。C条件下，加热20分钟。(6) 灌装用lOmL装的玻璃瓶灌装。实现工业化生产，整个操作过程均在无菌条件下进行全自动控制生产。 本发明饮料产品服用量小、口感好、便于携带、保存和服用。成品经灭菌处理，密封包装，质量稳定，不易变质口感好，易为人们所接受。能被小肠黏膜细胞直接吸收，不会直接产生任何消化特征刺激性症状，且吸收率高。
权利要求
1、一种二价血红素肽铁的纯化方法，包括(1)从畜禽血液中分离血红细胞，并加入抗凝剂处理；(2)分散血红细胞，并离心收集红细胞沉淀物；(3)超声波破壁血红细胞，释放出血红蛋白后，根据所用的降解酶调节pH；(4)添加降解酶溶液，并在真空室中进行高频脉冲处理，使得酶充分降解血红蛋白，释放二价血红素肽铁；(5)高温灭活酶后，离心收集上清液；(6)将上清液通过金属螯合亲和层析或电磁分离，纯化收集二价血红素肽铁；其中，步骤4中是通过200kHz脉冲频率作用4小时进行高频脉冲处理；步骤6中经过电磁分离器的血红蛋白降解液流速为1～2cm/min，回流处理3～4次，再在去离子蒸馏水洗涤5min，解除磁性，释放出的柱内壁物即为二价血红素肽铁。
2、 权利要求1的方法，其中高频脉冲的电场参数为T广500.0us、 T2500.0us、 A1.000ms、 fl.000KHz、 V!1.88v、 V2-120mv、 h20.3、脉冲波型为双向方波，电极间距为1.2cm，脉冲频 率为200kHz。
3、 权利要求l的方法，其中将真空室内的真空度在l分钟时间内降至为0.01MPa，接通电源 将真空室内的温度恒定为37。C，维持4小时，在真空和高频脉冲电场环境条件下，利用蛋白 酶降解血红蛋白。
4、 权利要求1的方法，其中电磁铁中心磁场为1.2T，磁场中心安装一根直径为5mm，长为 200mm的玻璃柱，玻璃柱外围用130m长、直径为5um的含300种合金组成的不锈钢丝绕制 成磁性玻璃柱，电磁分离所用的直流电源电流量不少于20A，电压不少于50V。
5、 权利要求l的方法，其中将血红蛋白降解液以40 120ml/h的流速均匀的沿管内壁自上往 下流经电磁铁中心，玻璃柱管与电磁铁中心横切面的角度为15Q。接通电源，电流达到20A。 当流出液达到20ml后，即可切断电源，解除电磁，用细胞分离缓冲液冲洗管内物质，即为二 价血红素肽铁。
6、 权利要求l-5任一项的方法，其中步骤4中添加6000U/mL胰蛋白酶；步骤5中通过将真 空度维持在O.OlMPa、升高真空室温度至95。C、 10-30分钟，以高温灭火酶。
7、 权利要求6的方法，其中步骤1中使用0.2%柠檬酸三钠和0.15%的柠檬酸钠混合物作抗 凝剂，按血液重量的5%添加到血液中。
8、 权利要求6的方法，其中步骤2中按10%血液重量添加2。/。D-葡萄糖、0.85%NaCl、 0.05% 柠檬酸、0.08%柠檬酸钠，配制成细胞分散液，静置5分钟，在5000r/min转速离心30分钟， 弃去上清液，收集沉淀物。
9、 权利要求7的方法，其中步骤3中使用胰蛋白酶则调节pH值至8.0，使用中性蛋白酶则 调节pH至7.0，以防止血红蛋白中铁离子发生氧化反应。
10、 一种二价血红素肽铁补血饮料的制备方法，包括 (1) 按照上述权利要求1-9任一项的方法进行纯化收集二价血红素肽铁；(2) 加入西红柿汁红枣汁、甘草汁、当归汁、黄芪汁、生地汁、甜菊糖、蛋白糖、卡拉胶、 海藻酯钠进行调配，并用超纯净水调节至1L，而后用柠檬酸、磷酸氢二钾或磷酸二氢 钾调节pH至4.0;(3) 将调配的混合液，加热至65'C， 0.18MPa真空度下真空脱气，然后用均质机在30MPa 下均质二次；(4) 高温杀菌后，进行灌装，即得二价血红素肽铁补血饮料。
全文摘要
本发提供一种二价血红素肽-铁的纯化方法，包括从畜禽血液中分离出红细胞，加入二倍蒸馏水，结合超声波处理破壁，释放出血红蛋白，调节血红蛋白溶液pH，添加蛋白酶，置于真空干室内，通入脉冲电流作用4小时，经95℃、30分钟加热灭酶处理，再经过金属螯合亲和层析及电磁分离，获得纯度达90％以上的二价血红素肽铁。本发明还提供基于以上方法的二价血红素肽铁补血饮料的制备方法，所制备的饮料产品服用量小、口感好、便于携带、能被小肠黏膜细胞直接吸收，不会直接产生任何消化特征刺激性症状，且吸收率高。
文档编号C12P21/06GK101649342SQ200910170068
公开日2010年2月17日 申请日期2009年9月2日 优先权日2009年9月2日
发明者滨 张 申请人:滨 张