专利名称：连续灌注生物反应器/罐袋系统制备干细胞装置和方法
技术领域：
本发明涉及一种生物工程领域的连续灌注生物反应器及培养瓶/袋系统制备干 细胞的装置及方法，尤其涉及一种连续灌注生物反应器及培养瓶/袋系统制备具重要价值 但较难生长的干细胞的装置及方法。
背景技术：
从当前组织工程进展来看，利用干细胞的治疗组织器官的损伤、坏死是最有前途 的治疗方法，其医疗效果及经济回报期望是相当可观的。迄今为止，干细胞(例如间充质类 干细胞)为代表的治疗用细胞培养制备方法，传统上是将干细胞提取后接种于平皿或T瓶， 置于37°C、饱和湿度、5%二氧化碳培养箱中进行静态非连续供液培养。但是，用这种传统 细胞培养工艺制备干细胞存在以下弊端(1)静态非连续供液培养往往因为营养消耗而不 足，细胞代谢废物无法排除，因此造成代谢产物积累，逐渐增加细胞毒性等缺陷，由此导致 细胞生长缓慢，最高生长速率和最终细胞浓度有限的问题；( 不能有效地模拟体内的循 环动态过程和保持细胞恒定生长活力，使对微环境敏感而又处于变化中的“动态”干细胞不 能被高质量地扩增制备；C3)培养周期受到限制，总体细胞承载数量有限，难于进行工程放 大；(4)整体监控能力有限，缺少对正常生长细胞量、分化或未分化态细胞比例等有效的在 线或离线监控。因此，利用连续灌注生物反应器结合有效的监控方式能将传统细胞培养方 式进行全新改进，快速、高效、连续地扩增以干细胞为首选的治疗用细胞。经对现有技术文献的检索发现，Majd H等人在《Stem Cells)) 2009Jan ；27(1) 200-9.发表的《A Novel Method of Dynamic Culture Surface ExpansionImproves Mesenchymal Stem Cell Proliferation and Phenotype))中针对干细胞(hMSC)在静态非 连续供液培养中数量逐步扩增而贴附表面及相应营养供给有限的问题，采用了高弹性可伸 缩橡胶作为动态贴附面的方法，建立了实验室用的小型动态制备人骨髓间充质干细胞的装 置及方法。但类似研究，都只集中于干细胞扩增过程中单项因素有限的问题而加以解决，都 未能够采用连续灌注生物反应器结合有效的监控方式能对干细胞进行高效、连续、可控、可 工程放大地扩增制备。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种用于实验室或医疗机构、细胞制备应用工 业界的高效、高质量扩增制备干细胞或其他治疗用细胞的连续灌注生物反应器及培养瓶/ 袋系统的装置和操作方法，使实验室、医院或工厂能安全规模化地高效率和高质量地制备 获得类干细胞的治疗用细胞。本发明是通过以下技术方案实现的本发明所涉及的连续灌注生物反应器及培养瓶/袋系统制备干细胞的装置和方 法，至少包括培养液贮罐或袋、可监控生物反应器、中央细胞培养仓、废液收获容器、生物反 应器理生化指标探测头组、中央细胞培养仓入仓理生化指标探测头组、中央细胞培养仓出仓理生化指标探测头组、在线监控系统、一号流体控速推动器、二号流体控速推动器和经由 流体控速推动器控速的管道体系。培养液贮罐或袋通过可控速管道体系经一号流体控速推 动器与可监控生物反应器连接，可监控生物反应器通过控速管道体系经二号流体控速推动 器与中央细胞培养仓连接，中央细胞培养仓出口通过可控速管道体系连接废液罐或收获罐 或袋；或者可监控生物反应器通过控速管道体系先直接与中央细胞培养仓连接，再经二号 流体控速推动器连接废液或收获罐或袋。可监控生物反应器通过生物反应器理生化指标探 测头组连接在线监控系统，在线监控系统同时分别与中央细胞培养仓进口和出口的入仓探 头组和出仓探头组相连；所有装置间的连接都是由可控速管道体系连接构成。所述生物反应器与中央细胞培养仓分离，以利于最大限度地降低生物反应器对培 养液的监控调节对细胞可能造成的各种负面影响。所述培养液贮罐或袋用以盛放供细胞培养用的无菌培养液，其可包括密封无菌的 各式罐、瓶或袋系统，其出口与可控速管道体系密封无菌连接。所述培养液贮罐或袋、废液/收获液收集容器若为不可缩瘪变形的罐或瓶系统， 其罐或瓶体上必须具有通过无菌滤膜过滤器连通大气的气孔。所述可监控生物反应器是普通商用具在一定的自动监控功能的生物反应器也可 以是各种特制或自制的生物反应器，其可根据需要在无菌条件下更换不同储液接口，以使 不同液流进入本培养系统；其一般可装载插入反应器内部培养液的多个理生化指标探测 头，可以具备监控反应器内培养液面高低或培养液重量大小、检测细胞浓度、取样检测、搅 拌混合培养液、控制培养液酸碱度、溶氧浓度、温度等功能；具有气体输入通道。所述中央细胞培养仓为密封无菌系统，上游和下游分别具有进出通道。其特征是 具有适合细胞生长的各种结构和培养细胞的各种功能。例如针对贴壁细胞，其可能包含单 层刚性贴附平面培养结构、多层刚性贴附平面培养结构、单层薄膜培养结构、多层薄膜培养 结构、复合多室体培养结构、可移动载体培养结构、培养袋结构等。所述理生化指标探测头组至少包括可监控生物反应器探头组和中央细胞培养仓 出、入口的探头组。理生化指标探测头为无菌插或接入生物反应器或管道内的监控目标液 内以监控各种物生化指标。所述理生化指标探测头为普通商用溶液物化指标理生化指标探 测头或其他特殊或自制理生化指标探测头，通过传感器连接计算机，可包括溶氧探测头、PH 探测头、细胞浓度探测头等。所述可控速管道体系由细胞培养硅胶管或其他适合细胞培养用管以及流体控速 推动器组成本体，并且任何两子装置之间管道体系本体上都带普通滑动控速夹或普通控速 阀门，滑动控速夹或控速阀门位于装置出口处。连接中央细胞培养仓的出口和入口的可控 速管道体系可以串联理生化指标探测头仓，供入仓探测头组和出仓探测头组连入，以检控 流入中央细胞培养仓和流出培养仓的培养液混合物的物化指标。所述流体控速推动器为各种无菌输送液体装置，例如常用的蠕动泵，其作用是在 推动液体传递的同时，也起到控速甚至截留的作用。一号流体控速推动器和二号流体控速推动器、可控速管道体系中滑动控速夹、普 通控速阀门可分别连接在线监控系统，通过在线监控系统监控的结果来控制液体的传递方 向和速度，能达到精确控制的效果。当然，这一块也可以人为控制，根据在线监控系统监控 的情况来控制。
本发明所涉及的连续灌注生物反应器及培养瓶/袋系统制备干细胞或其他治疗 用细胞的培养方法，在使用时，连接装置，灭菌，采用无菌培养液或无菌PBS缓冲液循环一 定时段；然后接种细胞，细胞接种后根据细胞情况，静止培养一定时段；在开始灌注培养液 时，开启培养液贮罐出口管道开关和可监控生物反应器出口管道开关，启动2个流体控速 推动器，培养液贮罐中的培养液被输送到可监控生物反应器中，经生物反应器调控后，培养 液具携了最适细胞生长的特征，包括最适的溶氧浓度、溶二氧化碳浓度、温度、酸碱度等，进 入中央细胞培养仓进行连续灌注细胞培养；根据实际细胞生长等情况，培养液灌注流速在 细胞培养过程中实时监控和即时调节。记录细胞生长各项生化指标。在细胞生长初始阶 段，可适当调小一号流体控速推动器和二号流体控速推动器速度，在细胞扩增平台期，将一 号流体控速推动器和二号流体控速推动器调节至理想转速；二号流体控速推动器的输液速 度一般由细胞状态和收获液等情况决定；而一号流体控速推动器的输液速度一般通过对生 物反应器内培养液面高低或培养液重量大小的监控而自动调节。其操作方法以下第一步，连接装置，灭菌，采用无菌培养液或无菌PBS缓冲液循环一定时段；在工 作时，接种细胞，细胞接种后根据细胞情况，静止培养一定时段；第二步，开始连续灌注培养液时，开启培养液贮罐出口管道开关和可监控生物反 应器出口管道开关，调节监控系统启动两个流体控速推动器，培养液贮罐中的培养液被输 送到可监控生物反应器中，经生物反应器调控后，培养液具携了最适细胞生长的特征，包括 最适的溶氧浓度、溶二氧化碳浓度、温度、酸碱度等，进入中央细胞培养仓进行连续灌注细 胞培养；根据实际细胞生长等情况，培养液灌注流速在细胞培养过程中实时监控和即时调 节。记录细胞生长各项理生化指标。第三步，在细胞生长初始阶段，可适当调小一号流体控速推动器和二号流体控速 推动器速度，在细胞扩增平台期，将一号流体控速推动器和二号流体控速推动器调节至理 想转速；二号流体控速推动器的输液速度一般由细胞状态和收获液等情况决定；而一号流 体控速推动器的输液速度一般通过对生物反应器内培养液面高低或培养液重量大小的监 控而自动调节。本发明采用了连续灌注的思想，将生物反应器与培养瓶/袋系统结合，将无细胞 区培养基的混合前处理、细胞区的瓶、袋方式连续灌注连接为统一完整的持续流程，整个过 程对细胞的检测无侵入损伤，所有流程都在可监控的流水线反应系统中进行。用开启关闭 不同罐、室、袋出口管道开关的方式替代人工换液，不断输入新鲜反应液体，带走细胞代谢 产物，步骤柔和，兼于在线及离线的监测系统，确保各项指标无剧增剧减变化发生。与传统间歇培养扩增干细胞的方法相比，本发明从长期培养来看不但降低了染菌 风险，大幅度提升了细胞生长速率，通过灌注流液不断补充新鲜养料，及时带走代谢产物， 替代人工手动换液过程，节省人力，对培养细胞的影响降到最低，并极大限度提升了可供总 体培养的周期，能在短期内高效获得均一、优良的干细胞产品。本专利装置系统操作简便， 集约化程度高，占地面积小，应用于国内国际干细胞治疗、组织修复、自体移植等领域具有 较强的可实践性。另外，生物反应器与中央细胞培养仓分离，以利于最大限度地降低生物反应器对 培养液的监控调节对细胞可能造成的各种负面影响。
也就是说，本发明涉及的装置和方法是一种更完备的细胞制备扩增的反应器系 统，基于该系统对工程参数的监控，可进一步探索建立更完善的SOP体系，全方位的将各种 因素(包括营养的提供和代谢废物的清除)都以动态连续思想统筹控制，通过连续灌注生 物反应器及培养瓶/袋系统对干细胞等治疗用细胞进行高效制备以满足当前的紧迫需求。
附图1为本发明装置的结构示意图。图中1为培养液贮罐、2为可监控生物反应器、3为中央细胞培养仓、4为废液/收 获液收集容器、5为生物反应器理生化指标探测头组、6为细胞培养仓入仓理生化指标探测 头组、7为细胞培养仓出仓理生化指标探测头组、8为在线监控系统、9为一号流体控速推动 器、10为二号流体控速推动器，其间连接11为可控速管道体系。
具体实施例方式如图所示，连续灌注生物反应器及培养瓶/袋系统制备干细胞的装置及方法，包 括培养液贮罐/袋1、可监控生物反应器2、中央细胞培养仓3、废液/收获液收集容器4、生 物反应器理生化指标探测头组5、细胞培养仓入仓理生化指标探测头组6、细胞培养仓出仓 理生化指标探测头组7、在线监控系统8、一号流体控速推动器9、二号流体控速推动器10、 可控速管道体系11。其连接关系为培养液贮罐/袋1通过可控速管道体系11，经一号流 体控速推动器9与可监控生物反应器2连接；可监控生物反应器2通过控速管道体11，经 二号流体控速推动器10与中央细胞培养仓3连接；中央细胞培养仓3出口通过可控速管道 体系11，连接废液/收获液收集容器4 ；或者，可监控生物反应器2通过控速管道体系11， 先直接与中央细胞培养仓3连接，再经二号流体控速推动器10，连接废液/收获罐/袋4。 可监控生物反应器2通过生物反应器理生化指标探测头组5，连接在线监控系统8 ；在线监 控系统8分别与中央细胞培养仓3进口和出口的入仓探头组6和出仓探头组7相连。所有 装置间的连接都是由可控速管道体系11连接构成。所述生物反应器2与中央细胞培养仓3分离，以利于最大限度地降低生物反应器 对培养液的监控调节对细胞可能造成的各种负面影响。所述培养液贮罐/袋1用以盛放供细胞培养用的无菌培养液，其可包括密封无菌 的各式罐、瓶/袋系统。在本实例中，培养液贮罐/袋1主要是泛指贮培养液的容器，并不 是特别限定于罐或瓶，也就是说，本发明并不局限于罐或瓶，包括贮培养液的一切容器。其 出口与可控速管道体系11密封无菌连接。所述培养液贮罐/袋1、废液/收获液收集容器4若为不可缩瘪变形的罐或瓶系 统，其罐或瓶体上必须具有通过无菌滤膜过滤器连通大气的气孔。所述可监控生物反应器2可以是普通商用具在一定的自动监控功能的生物反应 器也可以是各种特制或自制的生物反应器，其可根据需要在无菌条件下更换不同储液接 口，以使不同液流进入本培养系统；其一般可装载插入反应器内部培养液的多个理生化指 标探测头，可以具备监控反应器内培养液面高低或培养液重量大小、检测细胞浓度、取样检 测、搅拌混合培养液、控制培养液酸碱度、溶氧浓度、温度等功能；具有气体输入通道。所述中央细胞培养仓3为密封无菌系统，上游和下游分别具有进出通道。其特征是具有适合细胞生长的各种结构和培养细胞的各种功能。例如针对贴壁细胞，其可能包含 单层刚性贴附平面培养结构、多层刚性贴附平面培养结构、单层薄膜培养结构、多层薄膜培 养结构、复合多室体培养结构、可移动载体培养结构、培养袋结构等。中央细胞培养仓3可 根据具体的培养干细胞的需要选择对应种类的中央细胞培养仓3。所述理生化指标探测头组至少包括但不局限于可监控生物反应器理生化指标探 测头组5和中央细胞培养出仓理生化指标探测头组7、入仓理生化指标探测头组6。理生化 指标探测头为无菌插或接入生物反应器或管道内的监控目标液内以监控各种物化参数。所 述理生化指标探测头为普通商用溶液物化指标理生化指标探测头或其他特殊或自制理生 化指标探测头，通过传感器连接在线监控系统8的计算机，类型可包括但不局限于氧理生 化指标探测头、PH理生化指标探测头、细胞浓度探测头等。所述可控速管道体系11由细胞培养硅胶管或其他适合细胞培养用管以及流体控 速推动器组成本体，并且任何两子装置之间管道体系本体上都带普通滑动控速夹或普通控 速阀门，滑动控速夹或控速阀门位于装置出口处。连接中央细胞培养仓3的出口和入口的 可控速管道体系11可以串联理生化指标探测头仓，供入仓理生化指标探测头组6和出仓理 生化指标探测头组7连入以检控流入中央细胞培养仓11和流出培养仓11的培养液混合物 的物化指标。所述流体控速推动器9或10为各种无菌输送液体装置，例如常用的蠕动泵，其作 用是在推动液体传递的同时，也起到控速甚至截留的作用。流体控速推动器包括不局限于 一号流控速推动器和二号流控速推动器。在具体的系统中，可根据具体的情况，增设或减少 流控速推动器。一种连续灌注生物反应器及培养瓶/袋系统制备干细胞的装置和方法，其特征在 于包括以下步骤第一步，连接装置，灭菌，采用无菌培养液或无菌PBS缓冲液循环一定时 段；在工作时，接种细胞，细胞接种后根据细胞情况，静止培养一定时段；第二步，开始连续 灌注培养液时，开启培养液贮罐出口管道开关和可监控生物反应器出口管道开关，启动2 个流体控速推动器，培养液贮罐中的培养液被输送到可监控生物反应器中，经生物反应器 调控后，培养液具携了最适细胞生长的特征，包括最适的溶氧浓度、溶二氧化碳浓度、温度、 酸碱度等，进入中央细胞培养仓进行连续灌注细胞培养；根据实际细胞生长等情况，培养液 灌注流速在细胞培养过程中实时监控和即时调节。记录细胞生长各项生化指标。第三步， 在细胞生长初始阶段，可适当调小一号流体控速推动器和二号流体控速推动器速度，在细 胞扩增平台期，将一号流体控速推动器和二号流体控速推动器调节至理想转速；二号流体 控速推动器的输液速度一般由细胞状态和收获液等情况决定；而一号流体控速推动器的输 液速度一般通过对生物反应器内培养液面高低或培养液重量大小的监控而自动调节。以上公开的仅为本发明的几个具体实施例，但本发明并非局限于此，任何本领域 的技术人员能思之的变化，都应落在本发明的保护范围内。
权利要求
1.一种连续灌注生物反应器及培养瓶/袋制备干细胞的系统，其特征在于，包括培养 液贮罐/袋、可监控生物反应器、中央细胞培养仓、废液收获容器、生化指标探测头组、在线 监控系统、包括一号流体控速推动器和二号流体控速推动器的若干流体控速推动器和经由 流体控速推动器控速的管道体系，培养液贮罐/袋通过可控速管道体系经一号流体控速推 动器与可监控生物反应器连接，可监控生物反应器通过控速管道体系经二号流体控速推动 器与中央细胞培养仓连接，中央细胞培养仓出口通过可控速管道体系连接废液收获容器； 或者可监控生物反应器通过控速管道体系先直接与中央细胞培养仓连接，再经二号流体控 速推动器连接废液收获容器；生化指标探测头组连接在线监控系统，所有装置间的连接都 是通过可控速管道体系连接，在线监控系统监控细胞生长各项生化指标，以控制培养液灌 注流速在细胞培养过程中的实时监控和即时调节。
2.如权利要求1所述的系统，其特征在于，生化指标探测头组包括设置在生物反应器 的生物反应器理生化指标探测头组。
3.如权利要求1或2所述的系统，其特征在于，生化指标探测头组分别包括设置在中央 细胞培养仓入仓处的中央细胞培养仓入仓理生化指标探测头组和设置在在中央细胞培养 仓出仓处的中央细胞培养仓出仓理生化指标探测头组。
4.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述培养液贮罐/袋用以盛放供细胞培养用 的无菌培养液，其可包括密封无菌的各式罐、瓶/袋系统，其出口与可控速管道体系密封无 菌连接。
5.如权利要求3所述的系统，其特征在于，所述培养液贮罐/袋、废液收获液容器为不 可缩瘪变形的罐或瓶系统，其罐或瓶体上必须具有通过无菌滤膜过滤器连通大气的气孔。
6.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述可监控生物反应器是普通商用具在一 定的自动监控功能的生物反应器也可以是各种特制或自制的生物反应器，其可根据需要在 无菌条件下更换不同储液接口，以使不同液流进入本培养系统；其一般可装载插入反应器 内部培养液的多个理生化指标探测头，可以具备监控反应器内包括培养液面高低或培养液 重量大小、取样检测、搅拌混合培养液、控制培养液酸碱度、溶氧浓度、温度在内的各项指 标；并具有气体输入通道。
7.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述中央细胞培养仓为密封无菌系统，上游 和下游分别具有进出通道，并具有适合细胞生长的各种结构和培养细胞的各种功能。
8.如权利要求3所述的系统，其特征在于，所述可控速管道体系由细胞培养硅胶管或 其他适合细胞培养用管以及流体控速推动器组成本体，并且任何两子装置之间管道体系本 体上都带普通滑动控速夹或普通控速阀门，滑动控速夹或控速阀门位于装置出口处，连接 中央细胞培养仓的出口和入口的可控速管道体系可以串联理生化指标探测头仓，供入仓探 测头组和出仓探测头组连入，以检控流入中央细胞培养仓和流出培养仓的培养液混合物的 理生化指标。
9.如权利要求8所述的系统，其特征在于，一号流体控速推动器和二号流体控速推动 器、可控速管道体系中滑动控速夹、普通控速阀门分别连接在线监控系统。
10.一种连续灌注生物反应器及培养瓶/袋系统制备干细胞的方法，其特征在于包括 以下操作方法第一步，连接装置，灭菌，采用无菌培养液或无菌PBS缓冲液循环一定时段；在工作时，接种细胞，细胞接种后根据细胞情况，静止培养预先设定的时段；第二步，开始连续灌注培养液时，开启培养液贮罐出口管道开关和可监控生物反应器 出口管道开关，调节控制装置以启动2个流体控速推动器，培养液贮罐中的培养液被输送 到可监控生物反应器中，经生物反应器调控后，培养液具有预先设定的最适细胞生长的特 征，包括最适的溶氧浓度、溶二氧化碳浓度、温度、酸碱度在内的各种指标，则进入中央细胞 培养仓进行连续灌注细胞培养；并根据实际细胞生长情况，培养液灌注流速在细胞培养过 程中实时监控和即时调节，另记录细胞生长各项生化指标。第三步，在细胞生长初始阶段，可调小一号流体控速推动器和二号流体控速推动器速 度，在细胞扩增平台期，将一号流体控速推动器和二号流体控速推动器调节至理想转速；二 号流体控速推动器的输液速度一般由细胞状态和收获液情况决定；而一号流体控速推动器 的输液速度一般通过对生物反应器内培养液面高低或培养液重量大小的监控而自动调节。
全文摘要
本发明所涉及的连续灌注生物反应器及培养瓶/袋系统制备干细胞的装置，包括培养液贮罐/袋、可监控生物反应器、中央细胞培养仓、废液/收获液收集容器、理生化指标探测头组、在线监控系统、以及无菌滤膜过滤器，其间用流体控速无菌推动器控速的管道体系连接而成。其连接关系为培养液贮罐或袋通过可控速管道体系与可监控生物反应器连接，可监控生物反应器通过控速管道体系与中央细胞培养仓进口连接，中央细胞培养仓出口通过可控速管道体系连接废液/收获液收集容器。可监控生物反应器通过反应器理生化指标探测头组连接在线监控系统，在线监控系统同时又分别与中央细胞培养仓进、出仓理生化指标探测头组相连。
文档编号C12N5/0775GK102071137SQ200910199070
公开日2011年5月25日 申请日期2009年11月19日 优先权日2009年11月19日
发明者李巍巍, 郑琛, 齐瀚实 申请人:上海坤巨科技发展有限公司