专利名称：胰腺癌标记物及其检测方法、试剂盒和生物芯片的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及人血清/血浆中微小核糖核酸分子的分离、定性 和定量分析，同时也涉及胰腺癌的各种临床指征。具体来说，本发明是一种检测胰腺癌病人 血清/血浆中微小核糖核酸的方法，通过胰腺癌病人血清/血浆中微小核糖核酸的变化，在 体外诊断胰腺癌与慢性胰腺炎，判断胰腺癌发病过程，预测胰腺癌并发症的发生和胰腺癌 复发的几率、以及胰腺癌的预后，并分析药效和疗效。
背景技术：
胰腺癌是一种死亡率极高( 99. 9%，确诊后)的肿瘤。美国发病率2005年估计 新发病例32，180例，占所有新发癌症的2% ；美国死亡率2005年1年估计死亡病例31，800 例，分别占男女所有癌症相关死亡原因的第4和第5位，占所有癌症死亡原因的5% -6%0 欧盟发病率2002年估计新发病例55100例，欧盟死亡率2002年1年估计死亡病例59300 例，在不同性别和种族中差异不明显，通常来说患者的预后较差。2002年全球胰腺癌发病和 死亡的统计如表1所示，其中发病人数是指2002年发现患胰腺癌的人数，死亡人数是指直 至2002年为止确诊为胰腺癌并且在2002年死亡的人数。表12002年全球胰腺癌发病和死亡的统计
权利要求
一种胰腺癌标记物，其特征在于，所述标记物包括以下在人体血清/血浆中稳定存在且可检测的微小核糖核酸成熟体中的一种或多种miR 27a，miR 27b，miR 29a，miR 29c，miR 30a，miR 30d，miR 33a，miR 92a，miR 100，miR 101，miR 103，miR 125b，miR 130b，miR 140 3p，miR 148a，miR 192，miR 199a，miR 199a 3p，miR 222，miR 210，miR 215，miR 223，miR 320，miR 361 5p，miR 378，miR 411，miR 483 5p，miR 20a，miR 21，miR 24，miR 25，miR 26a，miR 99，miR 122，miR 185和miR 191。
2.根据权利要求1所述的标记物，其特征在于，所述标记物包括以下在人体血清/血 浆中稳定存在且可检测的微小核糖核酸成熟体中的一种或多种miR-20a，miR-21, miR-24, miR-25, miR-99, miR-185 和 miR-191。
3.一种胰腺癌标记物，其特征在于，所述标记物包括以下在人体血清/血浆中稳定 存在且可检测的微小核糖核酸成熟体中的两种或两种以上miR-27a，miR-27b, miR-29a, miR-29c, miR-30a, miR-30d, miR-33a, miR-92a, miR-100, miR-101, miR-103, miR-125b, miR-130b, miR-140-3p, miR-148a, miR-192, miR-199a, miR-199a-3p, miR-222, miR-210, miR-215,miR-223,miR-320,miR-361-5p,miR-378,miR-411,miR-483-5p,miR-20a,miR-21, miR-24, miR-25, miR_26a，miR-99, miR-122, miR-185 和 miR-191。
4.根据根据权利要求3所述的标记物，其特征在于，所述标记物包括以下在人体血清/ 血浆中稳定存在且可检测的微小核糖核酸成熟体中的两种或两种以上miR-20a，miR-21, miR-24, miR-25, miR-99, miR-185 和 miR-191。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的标记物，其特征在于，所述血清/血浆来源于人 体活体、组织、器官和/或尸体。
6.权利要求1至5中任一项所述的标记物的检测方法，其特征在于，所述检测方法选自 反转录聚合酶链式反应方法、实时荧光定量聚合酶链式反应方法、Northern印迹杂交方法、 核糖核酸酶保护分析方法、Solexa测序技术和生物芯片方法中的一种或多种；优选地，所述检测方法为RT-PCR方法，例如包括以下步骤的RT-PCR方法1)提取受试者的血清/血浆总RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；或者收集受 试者的血清/血浆样本，以血清/血浆作为缓冲液进行逆转录反应来制备cDNA样品；2)用微小核糖核酸设计引物进行PCR反应；3)进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；4)EB染色后在紫外灯下观察结果；或者优选地，所述检测方法为Real-time PCR方法，例如包括以下步骤的Real-time PCR方法1)提取受试者的血清/血浆总RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；或者收集受 试者的血清/血浆样本，以血清/血浆作为缓冲液进行逆转录反应来制备cDNA样品；2)用微小核糖核酸设计引物；3)加入荧光探针进行PCR反应；4)检测并比较血清/血浆样本相对于正常血清/血浆中微小核糖核酸的量的变化。
7.权利要求1至5中任一项所述的标记物在制备预测、诊断、鉴别和/或评价胰腺癌的 试剂或工具中的用途。
8.一种用于检测胰腺癌标记物的微小核糖核酸探针组合，其特征在于，所述组合包括以下核苷酸序列所示的探针中的一种或多种
9.根据权利要求8所述的探针组合，其特征在于，所述所述组合包括以下核苷酸序列所示的探针中的一种或多种
10. 一种用于检测胰腺癌标记物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含检测权利要求 1至5中任一项所述的标记物的工具。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述工具包括权利要求8或9所述的 探针组合；优选地，所述工具还包括聚合酶和/或脱氧核糖核苷酸。
12.一种用于检测胰腺癌标记物的生物芯片，其特征在于，所述生物芯片包含检测权利 要求1至5中任一项所述的标记物的元件。
13.根据权利要求12所述的生物芯片，其特征在于，所述生物芯片的元件包括权利要 求8或9所述的探针组合。
全文摘要
本发明提供一种胰腺癌标记物及其检测方法、试剂盒和生物芯片。本发明所提供的胰腺癌标记物包含受试者血清/血浆中稳定存在且可检测的36种微小核糖核酸。本发明还提供了包括检测该胰腺癌标记物的工具或元件的试剂盒和生物芯片。本发明所提供的组合、方法、试剂盒和生物芯片能够用于辅助胰腺癌的诊断与鉴别诊断、疾病并发症的发生和复发的预测、疗效评价，以及药物活性成分的筛选、药效评价等方面，具有检出谱系广、灵敏度高、检测成本低、取材方便、样本易存放等优点，该方法可广泛用于胰腺癌普查等相关工作，改进单一的标记物所难以克服的个体差异所带来的低特异性和低灵敏度，显著提高胰腺癌的临床检出率，成为早期诊断胰腺癌的有效手段。
文档编号C12N15/11GK101942502SQ20091024401
公开日2011年1月12日 申请日期2009年12月24日 优先权日2009年12月24日
发明者刘锐, 巴一, 张春妮, 张辰宇, 曾科, 王成 申请人:北京命码生科科技有限公司