表达醛糖-1-差向异构酶的微生物的制作方法

专利名称：表达醛糖-1-差向异构酶的微生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物。特别地，本发明涉及经转化微生物，其能够(i)以比转化前的等同微生物要更高 的速率将戊醛糖转变成戊酮糖；和/或(ii)在戊醛糖存在下实现比转化前的等同微生物要 更高的生长速率；和/或(iii)比转化前的等同微生物要更高的戊醛糖代谢。本发明进一步涉及用于制备经转化微生物的方法，所述经转化微生物能够(i) 生成戊糖衍生化合物；和/或(ii)以比转化前的等同微生物要更高的速率将戊醛糖转变成 戊酮糖；和/或(iii)在戊醛糖存在下实现比转化前的等同微生物要更高的生长速率；和/ 或(iv)实现比转化前的等同微生物要更高的戊醛糖代谢；所述方法包括用编码醛糖-1-差 向异构酶的核苷酸序列转化微生物的步骤，其中所述经转化微生物能够将戊醛糖转变成戊 酮糖。另外，本发明涉及包含依照本发明的微生物或通过依照本发明的方法制备的微生 物的接种物和培养液(culture medium)。本发明另外涉及用于生成生物燃料和/或戊糖衍生化合物的方法，包括培养依照 本发明的微生物或通过依照本发明的方法制备的微生物。另外，本发明涉及通过本发明的方法获得的生物燃料和/或戊糖衍生化合物。另外，本发明涉及依照本发明的或通过本发明的方法制备的微生物用于生成戊酮 糖和/或生物燃料和/或戊糖衍生化合物的用途。
背景技术：
作为用于运输，加热和能量供给的化石燃料的绿色的和可持续的替代品，正在开 发生物燃料。上涨中的石油价格使得生物燃料生产在经济上更加可行，而且化石燃料的可 得性最终是有限的。生物乙醇，一种生物燃料，一般被认为是与基于石油的运输燃料相比要 更(X)2中性得多。另外，有可能使用生物乙醇作为部分以及全部汽油替代品，而对发动机技 术没有剧烈改变。典型地，通过自农业饲料-诸如甘蔗、甜菜、玉蜀黍和谷类(诸如小麦和玉米)-它 们是富含淀粉和富含糖的植物材料(这些植物材料的剩余物称作农业废物)衍生的糖的发 酵来生成生物乙醇。然而，与使用这些材料的工艺有关的一个问题在于它们利用在其它情 况中用于人的食物和动物饲料的材料。这样做的一个后果在于可得的食物和动物饲料的量 减少，这继而提高食品的价格。事实上，有预测说，即使将美国的全部玉蜀黍作物用于乙醇生产，它也不可能满足 美国未来的需求。例如，在2008年春季，美国农业部估算，根据美国播种玉蜀黍的土地量， 2008年美国会收获约120亿蒲式耳的玉蜀黍。使用本领域当前可得的技术，自1蒲式耳玉 蜀黍平均生成2. 8加仑乙醇。如此，如果全部2008年美国玉蜀黍收获制成乙醇，那么会获 得330亿加仑的乙醇。然而，根据美国内源信息管理局的统计，美国2007年有1420亿加仑 的汽油用作客车和货车的燃料。假设2008年美国的汽油需求没有显著下降，那么来自玉蜀 黍的汽油替代品乙醇的供给不能满足需求。
如此，富含淀粉的和富含糖的植物材料的来源的可得性是生物燃料生产的限速因素。例如，甘蔗、甜菜、高粱、大豆、玉蜀黍、和谷类(诸如小麦和玉米)的所谓的农业废 物材料主要包含木质纤维素材料。木质纤维素材料主要包含长链糖。一般地，这些长链糖 中约三分之二的糖是己糖(特别是葡萄糖)，它们主要是纤维素的形式，而且这些长链糖中 约三分之一的糖是戊糖(特别是木糖和阿拉伯糖)，它们主要以阿拉伯糖基木聚糖聚合物 的形式存在。纤维素水解后，能通过传统的基于酵母的方法来发酵己糖。然而，纤维素是一 种结实的结构，其对提取和酶促水解的抗性很高。阿拉伯糖基木聚糖比较易于提取和水解 以大体释放戊糖；但是所释放的糖不能被已知的微生物以足够高的浓度发酵成乙醇。自废物植物材料高效生成乙醇的两项障碍是与纤维素解聚有关的困难和能为大 规模生产将戊糖代谢成乙醇的合适微生物的缺乏。理论上，获得此类合适生物体的一种方式是将代谢戊糖的能力自天然戊糖代谢生 物体转移入已知的高效乙醇生成体。这已经成为最近15-20年期间多个研究小组的多项工 作的主题。但是凭借戊糖，不可能获得与使用葡萄糖时获得的速率相当的代谢速率。提高 这种低代谢速率已经成为且仍然是讨论和正在进行的研究的主题，而且仍然是在自戊糖发 酵乙醇中使用例如工程化酿酒酵母的一项主要障碍。发明概述惊人地，我们发现，通过修饰微生物来表达和/或过表达醛糖-1-差向异构酶，戊 醛糖更快地转变成戊酮糖得到推动(在与修饰前的等同微生物相比时)。那样，能获得如下 的微生物，其能够在与修饰前的等同微生物相比时更快地将戊糖(优选戊醛糖)转变成生 物燃料(优选包含乙醇的生物燃料)，这对于大规模工业生物燃料生产是特别有利的。木酮糖-5-磷酸是一种中间体(其可以自D-木糖、L-阿拉伯糖或甚至D-来苏糖 衍生)，其进入戊糖磷酸途径并在厌氧条件下被进一步代谢成乙醇。木糖变成乙醇的完整代 谢途径显示于图4。核酮糖-5-磷酸是一种中间体(其可以自D-核糖衍生)，其进入戊糖磷酸途径并 在厌氧条件下被进一步代谢成乙醇。一方面，本发明提供能够以比转化前的等同微生物要更高的速率将戊醛糖转变成 戊酮糖的经转化微生物。另一方面，本发明提供能够在戊醛糖存在下实现比转化前的等同微生物的要更高 的生长速率的经转化微生物。本发明还提供能够实现比转化前的等同微生物要更高的戊醛糖代谢的经转化微 生物。本发明进一步提供如下的微生物，其中所述微生物包含编码外源醛糖-1-差向异 构酶的核苷酸序列。另一方面，本发明提供如下的微生物，其中所述微生物能够表达外源醛糖-1-差 向异构酶。又一方面，本发明提供如下的微生物，其中所述微生物包含编码外源醛糖-1-差 向异构酶的核苷酸序列，且其中所述微生物能够表达所述外源醛糖-1-差向异构酶；且其 中所述微生物能够将戊醛糖转变成戊酮糖。
另外，本发明提供如下的微生物，其包含编码醛糖-1-差向异构酶的表达载体，其 中所述微生物能够将戊醛糖转变成戊酮糖。另一方面，本发明提供如下的经转化微生物，其中所述微生物能够表达醛 糖-ι-差向异构酶且其中所述微生物能够将戊醛糖转变成戊酮糖。又一方面，本发明提供用于制备能够生成戊酮糖的经转化微生物的方法，所述方 法包括用编码醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列转化微生物的步骤，且其中所述经转化微 生物能够将戊醛糖转变成戊酮糖。又一方面，本发明提供用于制备能够生成戊糖衍生化合物的经转化微生物的方 法，所述方法包括用编码醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列转化微生物的步骤，且其中所 述经转化微生物能够将戊醛糖转变成戊酮糖。又一方面，本发明提供用于制备能够以比转化前的等同微生物要更高的速率产生 戊糖衍生化合物的经转化微生物的方法，所述方法包括用编码醛糖-1-差向异构酶的核苷 酸序列转化微生物的步骤，其中所述经转化微生物能够将戊醛糖转变成戊酮糖。另一方面，本发明提供用于制备能够以比转化前的等同微生物要更高的速率将戊 醛糖转变成戊酮糖的经转化微生物的方法，所述方法包括用编码醛糖-1-差向异构酶的核 苷酸序列转化微生物的步骤，其中所述经转化微生物能够将戊醛糖转变成戊酮糖。又一方面，本发明提供用于制备能够以比转化前的等同微生物要更高的速率将戊 醛糖转变成戊酮糖的经转化微生物的方法，所述方法包括转化微生物使得醛糖-ι-差向异 构酶的表达上调的步骤，其中所述经转化微生物能够将戊醛糖转变成戊酮糖。另外，本发明提供用于制备能够在戊醛糖存在下实现比转化前的等同微生物要更 高的生长速率的经转化微生物的方法，所述方法包括用编码醛糖-ι-差向异构酶的核苷酸 序列转化微生物的步骤，其中所述经转化微生物能够将戊醛糖转变成戊酮糖。又一方面，本发明提供用于制备能够在戊醛糖存在下实现比转化前的等同微生物 要更高的生长速率的经转化微生物的方法，所述方法包括转化微生物使得醛糖-1-差向异 构酶的表达上调的步骤，其中所述经转化微生物能够将戊醛糖转变成戊酮糖。本发明还提供用于制备能够实现比转化前的等同微生物要更高的戊醛糖代谢的 经转化微生物的方法，所述方法包括用编码醛糖-ι-差向异构酶的核苷酸序列转化微生物 的步骤，其中所述经转化微生物能够将戊醛糖转变成戊酮糖。又一方面，本发明提供用于制备能够实现比转化前的等同微生物要更高的戊醛糖 代谢的经转化微生物的方法，所述方法包括转化微生物使得醛糖-ι-差向异构酶的表达上 调的步骤，其中所述经转化微生物能够将戊醛糖转变成戊酮糖。又一方面，本发明提供用于生成戊糖衍生化合物的方法，其中所述方法包括在培 养基中培养依照本发明的微生物或通过本发明的方法制备的微生物。又一方面，本发明提供用于生成戊糖衍生化合物的方法，其包括下述步骤(a)用编码醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列转化微生物，其中所述经转化微生 物能够将戊醛糖转变成戊酮糖；并(b)在培养基中培养该经转化微生物。又一方面，本发明提供用于生成戊酮糖的方法，其中所述方法包括在培养基中培 养依照本发明的微生物或通过本发明的方法制备的微生物。
又一方面，本发明提供用于生成戊酮糖的方法，其包括下述步骤(a)用编码醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列转化微生物，其中所述经转化微生 物能够将戊醛糖转变成戊酮糖；并(b)在培养基中培养该经转化微生物。本文所述戊酮糖可以在细胞内被进一步代谢，推动一系列产物的生成，包括但不 限于乙醇，乳酸，琥珀酸，乙酸，乙醛，衣康酸，甲酚，3-羟基丙酸，聚-3-羟基链烷酸盐/ 酯，原儿茶酸，焦儿茶酚，愈创木酚，藜芦醚，香草醛，香草酸，香草醇，己二烯二酸，己二酸， 4-羟基苯甲酸，4-羟基苯甲醛，4-甲氧基苯甲酸，4-氨基苯甲酸盐/酯，4-羟基苯胺，4-甲 氧基苯胺，对苯二酚，苯甲醚，酚，邻氨基苯甲酸，3-羟基邻氨基苯甲酸盐/酯，2，3- 二羟基 苯甲酸，2-氨基苯酚，1，4_环己二酮和芳香族氨基酸。另一方面，本发明提供用于生成生物燃料的方法，其中所述方法包括在培养基中 培养依照本发明的微生物或通过依照本发明的方法制备的微生物的步骤。另一方面，本发明提供用于制备能够在培养基中以比转化前的等同微生物要更高 的速率生成生物燃料的经转化微生物的方法，所述方法包括用编码醛糖-ι-差向异构酶的 核苷酸序列(优选在编码它的表达载体中)转化微生物的步骤，其中所述经转化微生物能 够将戊醛糖转变成戊酮糖。另一方面，本发明提供用于生成生物燃料的方法，其包括下述步骤(a)用编码醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列(优选在编码它的表达载体中)转 化微生物，其中所述经转化微生物能够将戊醛糖转变成戊酮糖；并(b)在包含戊醛糖的培养基中培养该经转化微生物。又一方面，本发明提供用于生成生物燃料的方法，其中所述方法包括在培养基中 培养微生物的步骤，其中所述微生物包含编码醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列且其中所 述微生物能够表达所述醛糖-1-差向异构酶；且其中所述微生物能够将戊醛糖转变成戊酮 糖。又一方面，本发明提供通过依照本发明的方法获得的或可获得的生物燃料。另一方面，本发明提供依照本发明的微生物或通过本发明的方法制备的微生物用 于生成戊酮糖的用途。另一方面，本发明提供依照本发明的微生物或通过本发明的方法制备的微生物用 于生成戊糖衍生化合物的用途。另外，本发明提供依照本发明的微生物或通过本发明的方法制备的微生物用于生 成生物燃料的用途。另一方面，本发明提供微生物用于生成生物燃料的用途，其中所述微生物包含编 码醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列，且其中所述微生物能够表达所述醛糖-1-差向异构 酶，且其中所述微生物能够将戊醛糖转变成戊酮糖。又一方面，本发明提供包含依照本发明的微生物或通过依照本发明的方法制备的 微生物的接种物。另外，本发明提供包含依照本发明的微生物或通过依照本发明的方法制备的微生 物的培养液。一些优点
有利地，通过使用依照本发明的微生物，能生成生物燃料(诸如乙醇)。另一个优点在于通过使用依照本发明的微生物，能有效使用戊糖生成生物燃料 (诸如乙醇)。不希望受理论束缚，修饰微生物以表达或过表达醛糖-1-差向异构酶容许提 高各戊醛糖异头物之间的互相转变和细胞内戊醛糖变成戊酮糖的转变的速率-换言之，它 减轻限速约束-这继而容许通过戊糖磷酸途径比修饰前的等同微生物要更快且更有效地 生成乙醇。更有利地，通过使用依照本发明的微生物，能自废物材料诸如农业废物(包括谷 类秆-诸如小麦秆；甜菜浆；甘蔗渣；秣(stover)-诸如高粱、大豆、玉蜀黍或玉米秣；和木 屑)生成生物燃料。凭借本发明，不需要(或需要降低)使用在其它情况中能用作人的食 物来源和/或动物饲料的材料(诸如甘蔗提取物、甜菜提取物、高粱淀粉、玉蜀黍淀粉、小麦 淀粉或玉米淀粉)。最有利地，本发明提供能够为大规模生产(诸如工业生产)将戊糖(诸如戊醛糖) 代谢成生物燃料(诸如包含乙醇的生物燃料)的微生物。有利地，依照本发明的微生物能够通过戊糖发酵最佳地使用通过木质纤维素材料 水解而释放的糖。本发明能够生成与基于石油的运输燃料相比要更(X)2中性的生物燃料。与生成典 型的基于石油的运输燃料(化石燃料)相比，凭借本发明，在依照本发明生成生物燃料时 CO2排放会较低(甚至更低)。惊人地，本发明显示转化微生物以表达醛糖-1-差向异构酶导致戊糖变成生物燃 料的转变速率升高。附图简述

图1。代谢途径的示意图，详绘了两种最丰富的戊醛糖，D-木糖和L-阿拉伯糖的 代谢。这两种戊醛糖被转变成戊酮糖，并被进一步转变成D-木酮糖5-磷酸。不希望受理论 束缚，如图中所示，一种类型的途径(醛糖还原酶型)见于真菌，而另一种类型的途径(异 构酶型)见于细菌。在真菌途径类型中，第一种酶可以称作“D-木糖还原酶”和“L-阿拉伯 糖还原酶”，但是常常同一种酶能还原D-木糖和L-阿拉伯糖二者，而且可以然后服务于这 两种途径且称作不太特异性的名称“醛糖还原酶”。图2。不希望受理论束缚，图2显示一些不太丰富的戊糖(D-和L-来苏糖，D-核 糖)的真菌和细菌类型的代谢途径的示意图，详绘了初始代谢直至进入戊糖磷酸途径。图3。戊糖磷酸途径(PPP)的非氧化性部分的示意图。图4。戊糖磷酸途径(PPP)的示意图。在这里，可以自D-木糖或L-阿拉伯糖衍生 的戊酮糖木酮糖-5-磷酸在厌氧条件下被进一步代谢成乙醇。XI指木糖异构酶，而XK指木 酮糖激酶。显示了进入该过程的木糖净输入和离开该过程的乙醇净输出(净过程)。发明详述如本文中使用的，短语“能够以比转化前的等同微生物要更高的速率将戊醛糖转 变成戊酮糖的经转化微生物”涵盖经编码醛糖-ι-差向异构酶的核苷酸序列诸如包含所述 核苷酸序列的表达载体转化的微生物和经转化以上调醛糖-ι-差向异构酶表达(换言之过 表达醛糖-1-差向异构酶)的微生物。在一个实施方案中，微生物已经用引起微生物过表达醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列转化。例如，将启动子插入微生物的基因组，这使得微生物能够过表达编码醛 糖-ι-差向异构酶的内源核苷酸序列。在另一个实施方案中，微生物已经用编码醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列转 化。例如，微生物用包含可操作连接至调节序列的，编码醛糖-ι-差向异构酶的核苷酸序列 的表达载体转化。优选地，本文所述编码醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列在编码它的表达载体 中。优选地，本文所述表达载体包含能够过表达编码醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序 列的启动子。此类启动子的例子包括GPD启动子、TEF启动子和ADP启动子。可用于过表 达醛糖-ι-差向异构酶的优选启动子可以是任何控制编码涉及糖酵解和葡萄糖发酵的蛋 白质的核苷酸序列表达的调节元件。如本文中使用的，短语“能够以比转化前的等同微生物要更高的速率将戊醛糖转 变成戊酮糖的经转化微生物”中的术语“更高的速率”指经转化微生物能够降低培养液中戊 醛糖的量，使得在相同培养条件下培养指数生长期内的给定时间段时，培养液中戊醛糖的 量的降低比转化前的等同微生物要多至少5%UO^dOW或25%每细胞。术语“指数生长期”以本领域普通含义使用-例如微生物以恒定速率分裂，使得微 生物总数在每次分裂后加倍。技术人员能容易地为任何微生物为给定培养条件集确定延滞 期(细胞在指数生长开始前适应新环境的时段)、指数生长期、稳定期(细胞分裂速率等于 细胞死亡速率，因此存活细胞数保持恒定的时段)和死亡期(存活数下降的时段)。如本文中使用的，术语“转化前的等同微生物”指用编码醛糖-1-差向异构酶的核 苷酸序列转化前的或用引起醛糖-1-差向异构酶上调(例如过表达)的核苷酸序列转化前 的微生物。如本文中使用的，术语“戊醛糖转变成戊酮糖”指例如戊醛糖木糖转变成戊酮糖木 酮糖；戊醛糖阿拉伯糖转变成戊酮糖木酮糖；戊醛糖阿拉伯糖转变成戊酮糖核酮糖；戊醛 糖来苏糖转变成戊酮糖木酮糖；和戊醛糖核糖转变成戊酮糖核酮糖。在一个优选的方面，戊酮糖是木酮糖。如本文中使用的，术语“能够将戊醛糖转变成戊酮糖的经转化微生物”指包含编码 涉及戊醛糖转变成戊酮糖的一种或多种多肽的一种或多种多核苷酸序列的微生物。能够将 戊醛糖转变成戊酮糖的多肽的例子包括木糖异构酶、阿拉伯糖异构酶、D-来苏糖异构酶、和 核糖异构酶；木糖还原酶和木酮糖还原酶的组合，阿拉伯糖还原酶、L-阿拉伯糖醇4-脱氢 酶、L-木酮糖还原酶和D-木酮糖还原酶的组合，及D-来苏糖还原酶和D-阿拉伯糖醇脱氢 酶的组合。多肽对于所述微生物可以是内源的和/或外源的。多肽可以由一种或多种表达 载体来编码。优选地，戊醛糖选自下组木糖，阿拉伯糖，核糖和来苏糖。优选地，戊醛糖是木糖 或阿拉伯糖。更优选地，戊醛糖是木糖。微生物中α-戊醛糖和β-戊醛糖之间的自发转变是缓慢的。例如，β-D-木糖 变成α -D-木糖的自发转变在生理温度具有约0. 094/min的一级K值(Bailey等，1969)。如本文中使用的，短语“引起微生物过表达醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列”和 “能够过表达编码醛糖-ι-差向异构酶的核苷酸序列的启动子”中的术语“过表达”指在比较经转化微生物与转化前的等同微生物时，表达自零升高至某表达水平或自较低的表达水 平升高至较高的表达水平(例如上调)。过表达醛糖-ι-差向异构酶的微生物具有升高的 催化α-戊醛糖和β-戊醛糖之间的转变的能力。优选地，所述过表达醛糖-1-差向异构酶的经转化微生物能够以比未转化的微生 物要高至少10%、15%、20%或25%的速率催化α-戊醛糖转变成β-戊醛糖，在如下的测 定法中测量，将Ig破碎的细胞量添加至50ml新鲜制备的含有IOOmM β-戊醛糖的缓冲中性 溶液，使用本文中稍后描述的互相转变测定法。过表达醛糖-1-差向异构酶的微生物的例子包括⑴经编码醛糖-1-差向异构 酶的表达载体转化的微生物(在转化之前，所述微生物不能够表达醛糖-ι-差向异构酶)； 和(ii)经转化以上调内源醛糖-1-差向异构酶表达的微生物(在转化之前，所述微生物 能够在指数生长期间对于给定的培养条件集表达所述醛糖-1-差向异构酶，但是在转化之 后，所述微生物能够在指数生长期间在相同培养条件中以更高的水平表达所述醛糖-1-差 向异构酶)。如本文中使用的，短语“能够在戊醛糖存在下实现比转化前的等同微生物要更高 的生长速率的经转化微生物”中的术语“更高的生长速率”指经转化微生物能够实现升高的 生长速率，使得在相同培养条件下培养时指数生长期期间每ml微生物数加倍所花费的时 间比转化前的等同微生物要少至少10^^15^^20%或25%。在一个优选的方面，微生物以 它们的最适生长温度培养；且优选地，在最适量的盐、维生素和微生物所必需的其它养分之 外，培养基包含介于和4%之间的戊醛糖。如本文中使用的，短语“能够实现比转化前的等同微生物要更高的戊醛糖代谢的 经转化微生物”中的术语“更高的代谢”指经转化微生物能够代谢戊醛糖，使得在相同培养 条件下培养指数生长期内的给定时间段时，培养液中戊醛糖的消耗量比转化前的等同微生 物高至少10^^20^^25%,30%或35%每细胞。在一个优选的方面，微生物以它们的最适 生长温度培养；且优选地，在最适量的盐、维生素和微生物所必需的其它养分之外，培养基 包含介于和4%之间的戊醛糖。优选地，依照本发明的经转化微生物所具有的将戊醛糖转变成戊酮糖的速率处于 比转化前的等同微生物要更高的水平。此短语中使用的术语“更高的水平”指经转化微生 物能够转变戊醛糖，使得在相同培养条件下培养指数生长期内的给定时间段时，培养液中 戊醛糖的量的降低比转化前的等同微生物要多至少5110120%或25%每细胞。如本文中使用的，术语“编码醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列”涵盖包含调节 序列的核苷酸序列，调节序列使得编码醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列能够表达，诸如 启动子和增强子，它们可以是与编码醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列天然或非天然关联 的。如本文中使用的，短语“能够在培养基中以比转化前的等同微生物要更高的速率 生成生物燃料的经转化微生物”中的术语“更高的速率”指在相同培养条件下培养指数生 长期内的给定时间段时，经转化微生物能够生成比转化前的等同微生物多至少10%、20%、 25%、30%或35%的生物燃料每细胞。优选地，微生物以它们的最适生产环境(例如最适 氧分压和搅动速度)培养，且优选地，在最适量的盐、维生素和微生物所必需的其它养分之 外，培养基包含介于2 %和6 %之间的戊醛糖。
优选地，用于生成生物燃料的方法进一步包括自培养液获得生物燃料的步骤。经转化微生物如本文所述，术语“经转化微生物”指通过重组DNA技术已经遗传改变的微生物。 如本文中使用的，术语“经转化”与术语诸如“经转染”、“重组”、“经遗传工程改造”和“经遗 传修饰”同义。涉及本发明的术语“经转化微生物”包括任何包含如下的表达载体的微生物，所述 表达载体包含本文所述核苷酸序列和/或能够容许本文所述核苷酸序列表达(特别是过表 达即上调)的启动子。在一个实施方案中，将核苷酸序列掺入微生物的基因组。在另一个实 施方案中，将启动子掺入微生物的基因组。这些特征使得经转化微生物(在与转化前的等 同微生物比较时)能够⑴以更高的速率代谢戊醛糖；和/或(ii)具有更高的生长速率； 和/或(iii)以更高的速率生成戊酮糖；和/或(iv)以更高的速率生成戊糖衍生化合物； 和/或(ν)以更高的速率生成生物燃料。术语“经转化微生物”不涵盖在它们的天然启动子(在其天然环境中的)控制下 的天然核苷酸编码序列(在其天然环境中的)。因此，本发明的经转化微生物包括包含下述任一项或其组合的微生物编码本文 所述酶的核苷酸序列，包含所述核苷酸序列的构建物，包含所述核苷酸序列的载体，包含所 述核苷酸序列的质粒和包含所述核苷酸序列的表达载体。如此，本发明的又一个实施方案提供经表达本文所述酶的核苷酸序列转化或转染 的微生物。微生物会选择成与载体相容，而且可以是例如细菌、真菌或酵母细胞。合适的细菌宿主生物体的例子是革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌物种。根据编码本文所述酶的核苷酸序列的性质，真核宿主诸如酵母或其它真菌可能是 优选的。一般地，优选酵母细胞胜过真菌细胞，因为它们易于操作。合适的微生物-诸如酵母和真菌宿主细胞-的使用可提供翻译后修饰(例如肉豆 蔻酰化、糖基化、截短、脂化和酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化)，因为它们可能是赋予本文 所述重组表达产物以最佳生物学活性所需要的。合适的微生物包括细菌、真菌和酵母。优选地，微生物是酵母或细菌。优选地，所述经转化微生物是经转化酵母。优选地，所述经转化酵母衍生自糖酵母 属/酵母属(genus Saccharomyces)。更优选地，所述经转化酵母是啤酒糖酵母/酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)0在另一个实施方案中，优选地，所述经转化微生物是经转化细菌。优选地，所述经 转化细菌衍生自发酵单胞菌属(genus Zymomonas)或发酵杆菌属(genus Zymobacter) 0 更优选地，所述经转化细菌是运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)或棕榈发酵杆菌 (Zymobacter palmae)0在一个实施方案中，本文所述经转化微生物在包含戊醛糖的培养基中培养时以比 转化前的等同微生物要更高的速率代谢戊醛糖。另一方面，本文所述经转化微生物在包含戊醛糖的培养基中培养时的生长速率比 转化前的等同微生物要更高。又一方面，本文所述经转化微生物在包含戊醛糖的培养基中培养时能够以比转化 前的等同微生物要更高的速率生成戊酮糖。
另一方面，本文所述经转化微生物在包含戊醛糖的培养基中培养时能够以比转化 前的等同微生物要更高的速率生成生物燃料。微生物可以使用本领域例行的技术诸如电穿孔(Sambrook等，1989)来转化。另 外，经转化微生物中序列的存在可以通过合适培养基上的生长选择来确定，所述合适培养 基选择经转化微生物的生长。或者/另外，插入的异源DNA序列的存在可以通过使用为插 入的序列专门设计的引物进行的直接菌落PCR来确定。此类技术是本领域公知的且例行的 (参见例如 Sambrook 等，1989 和 Ausubel 等，1995)。依照本发明的经转化微生物可以与一种或多种依照本发明的经转化微生物组合使用。例如，一种或多种能够将D-木糖转变成D-木酮糖的依照本发明的经转化微生物 可以与选自下组的一种或多种微生物组合使用能够将L-阿拉伯糖转变成D-木酮糖的依 照本发明的经转化微生物；能够将L-阿拉伯糖转变成L-核酮糖的依照本发明的经转化微 生物；能够将D-来苏糖转变成D-木酮糖的依照本发明的经转化微生物；和能够将D-核糖 转变成D-核酮糖的依照本发明的经转化微生物。又例如，一种或多种能够将L-阿拉伯糖转变成D-木酮糖的依照本发明的经转化 微生物可以与选自下组的一种或多种微生物组合使用能够将D-木糖转变成D-木酮糖的 依照本发明的经转化微生物；能够将L-阿拉伯糖转变成L-核酮糖的依照本发明的经转化 微生物；能够将D-来苏糖转变成D-木酮糖的依照本发明的经转化微生物；和能够将D-核 糖转变成D-核酮糖的依照本发明的经转化微生物。又例如，一种或多种能够将L-阿拉伯糖转变成L-核酮糖的依照本发明的经转化 微生物可以与选自下组的一种或多种微生物组合使用能够将D-木糖转变成D-木酮糖的 依照本发明的经转化微生物；能够将L-阿拉伯糖转变成D-木酮糖的依照本发明的经转化 微生物；能够将D-来苏糖转变成D-木酮糖的依照本发明的经转化微生物；和能够将D-核 糖转变成D-核酮糖的依照本发明的经转化微生物。又例如，一种或多种能够将D-来苏糖转变成D-木酮糖的依照本发明的经转化微 生物可以与选自下组的一种或多种微生物组合使用能够将L-阿拉伯糖转变成D-木酮糖 的依照本发明的经转化微生物；能够将L-阿拉伯糖转变成L-核酮糖的依照本发明的经转 化微生物；能够将D-木糖转变成D-木酮糖的依照本发明的经转化微生物；和能够将D-核 糖转变成D-核酮糖的依照本发明的经转化微生物。又例如，一种或多种能够将D-核糖转变成D-核酮糖的依照本发明的经转化微生 物可以与选自下组的一种或多种微生物组合使用能够将L-阿拉伯糖转变成D-木酮糖的 依照本发明的经转化微生物；能够将L-阿拉伯糖转变成L-核酮糖的依照本发明的经转化 微生物；能够将D-来苏糖转变成D-木酮糖的依照本发明的经转化微生物；和能够将D-木 糖转变成D-木酮糖的依照本发明的经转化微生物。依照本发明的经转化微生物可以与一种或多种别的微生物组合使用。例如，一种 或多种依照本发明的经转化微生物可以与能够在某些培养条件下生成选自下列的多种成 分之一的至少一种微生物组合培养乙醇，乳酸，琥珀酸，乙酸，乙醛，衣康酸，甲酚，3-羟基 丙酸，聚-3-羟基链烷酸盐/酯，原儿茶酸，焦儿茶酚，愈创木酚，藜芦醚，香草醛，香草酸，香 草醇，己二烯二酸，己二酸，4-羟基苯甲酸，4-羟基苯甲醛，4-甲氧基苯甲酸，4-氨基苯甲酸盐/酯，4-羟基苯胺，4-甲氧基苯胺，对苯二酚，苯甲醚，酚，邻氨基苯甲酸，3-羟基邻氨基苯 甲酸盐/酯，2，3- 二羟基苯甲酸，2-氨基苯酚，1,4-环己二酮和芳香族氨基酸。又一方面，提供下述各项的组合(i) 一种或多种依照本发明的经转化微生物和 (ii)至少一种能够在某些培养条件下生成选自下列的多种成分之一的别的微生物乙醇， 乳酸，琥珀酸，乙酸，乙醛，衣康酸，甲酚，3-羟基丙酸，聚-3-羟基链烷酸盐/酯，原儿茶酸， 焦儿茶酚，愈创木酚，藜芦醚，香草醛，香草酸，香草醇，己二烯二酸，己二酸，4-羟基苯甲酸， 4-羟基苯甲醛，4-甲氧基苯甲酸，4-氨基苯甲酸盐/酯，4-羟基苯胺，4-甲氧基苯胺，对苯 二酚，苯甲醚，酚，邻氨基苯甲酸，3-羟基邻氨基苯甲酸盐/酯，2，3- 二羟基苯甲酸，2-氨基 苯酚，1,4-环己二酮和芳香族氨基酸。另外，本发明提供包含上述组合之一的接种物。另外，提供包含上述组合之一的培养液。另外，本发明提供包含下述各项的试剂盒(i)包含一种或多种依照本发明的微 生物的接种物和(ii)包含一种或多种本文所述别的微生物的接种物。表达载体术语“表达载体”指能够在体内或在体外表达的构建物。一方面，将表达载体掺入合适微生物的基因组。术语“掺入”优选涵盖稳定掺入基 因组。本文所述核苷酸序列可以存在于载体中，其中核苷酸序列可操作连接至调节序 列，其能够提供合适宿主微生物对核苷酸序列的表达。将载体转化入本文所述合适宿主微生物。载体的选择(例如质粒、粘粒、或噬菌体载体)常常会取决于它要导入的微生物。供本文中使用的载体可以含有一种或多种选择标志核苷酸序列-诸如赋予抗生 素抗性的核苷酸序列，例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性。或者，可以通过共 转化来实现选择(如W091/17243中记载的)。载体可以在体外使用，例如转染、转化、转导或感染宿主微生物。载体可以进一步包含使得载体能够在所讨论的宿主微生物中复制的核苷酸序列。 此类序列的例子是质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMBl和pIJ702的复制起点。在一个优选的方面，如本文所述能够将戊醛糖转变成戊酮糖的微生物包含编码醛 糖-1-差向异构酶的核苷酸序列。优选地，如本文所述的表达载体包含编码醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列。优选地，如本文所述能够将戊醛糖转变成戊酮糖的微生物包含至少一种编码木糖 还原酶和/或D-木酮糖还原酶的表达载体。在另一个优选的方面，如本文所述能够将戊醛糖转变成戊酮糖的微生物包含编码 木糖还原酶的表达载体和编码D-木酮糖还原酶的表达载体。又一方面，优选地，如本文所述能够将戊醛糖转变成戊酮糖的微生物包含至少一 种编码木糖异构酶的表达载体。另一方面，优选地，如本文所述能够将戊醛糖转变成戊酮糖的微生物包含至少一 种编码阿拉伯糖还原酶和/或L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶和/或L-木酮糖还原酶和/或D-木 酮糖还原酶的表达载体。
在又一个优选的方面，如本文所述能够将戊醛糖转变成戊酮糖的微生物包含编码 阿拉伯糖还原酶的表达载体、编码L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶的表达载体、编码L-木酮糖还 原酶的表达载体、和编码D-木酮糖还原酶的表达载体。在又一个优选的方面，如本文所述能够将戊醛糖转变成戊酮糖的微生物包含编码 L-阿拉伯糖异构酶的表达载体。优选地，另一方面，如本文所述能够将戊醛糖转变成戊酮糖的微生物包含至少一 种编码L-阿拉伯糖异构酶和/或核酮糖激酶和/或核酮糖磷酸4-差向异构酶的表达载体。在又一个优选的方面，如本文所述能够将戊醛糖转变成戊酮糖的微生物包含编码 L-阿拉伯糖异构酶的表达载体、编码核酮糖激酶的表达载体、和编码核酮糖磷酸4-差向异 构酶的表达载体。在另一个优选的方面，如本文所述能够将戊醛糖转变成戊酮糖的微生物包含至少 一种编码D-来苏糖异构酶的表达载体。在又一个优选的方面，如本文所述能够将戊醛糖转变成戊酮糖的微生物包含编码 D-核糖异构酶的表达载体。优选地，另一方面，如本文所述能够将戊醛糖转变成戊酮糖的微生物可进一步包 含至少一种编码选自下组的一种或多种酶的表达载体木酮糖激酶，D-核酮糖激酶，核 糖-5-磷酸异构酶，核酮糖-5-磷酸差向异构酶，转醛醇酶，转酮醇酶和戊糖磷酸途径的任 何其它酶。优选地，所述如本文所述能够将戊醛糖转变成戊酮糖的微生物进一步包含至少 一种编码木酮糖激酶和/或D-核酮糖激酶的表达载体。更优选地，所述如本文所述能够将 戊醛糖转变成戊酮糖的微生物进一步包含至少一种编码木酮糖激酶的表达载体。在另一个 实施方案中，优选地，如本文所述能够将戊醛糖转变成戊酮糖的微生物进一步包含至少一 种编码核酮糖-5-磷酸差向异构酶和/或核糖-5-磷酸异构酶和/或转醛醇酶和/或转酮 醇酶的表达载体。一方面，如本文所述的表达载体可进一步编码选自下组的一种或多种酶醛 糖-1-差向异构酶，木糖还原酶，D-木酮糖还原酶，木糖异构酶，阿拉伯糖还原酶，L-阿拉伯 糖醇4-脱氢酶，L-木酮糖还原酶，L-阿拉伯糖异构酶，核酮糖激酶，核酮糖磷酸4-差向异 构酶，D-来苏糖异构酶，D-核糖异构酶，木酮糖激酶，D-核酮糖激酶，核酮糖-5-磷酸差向 异构酶，核糖-5-磷酸异构酶，转醛醇酶，和转酮醇酶。一方面，如本文所述的表达载体可进一步编码选自下组的一种或多种酶木酮糖 激酶，D-核酮糖激酶，核糖-5-磷酸异构酶，D-核酮糖-5-磷酸差向异构酶，转醛醇酶，转酮 醇酶和戊糖磷酸途径的任何其它酶。在一个优选的方面，如本文所述的表达载体进一步编 码木酮糖激酶和/或D-核酮糖激酶。更优选地，所述如本文所述的表达载体进一步编码木 酮糖激酶。在另一个实施方案中，优选地，如本文所述的表达载体进一步编码核酮糖-5-磷 酸差向异构酶和/或核糖-5-磷酸异构酶和/或转醛醇酶和/或转酮醇酶。在另一个更优 选的实施方案中，优选地，如本文所述的表达载体进一步编码核糖-5-磷酸异构酶和/或转 醛醇酶和/或转酮醇酶。在一个优选的方面，如本文所述能够将戊醛糖转变成戊酮糖的微生物进一步包含 至少一种编码醛糖-ι-差向异构酶的表达载体。优选地，如本文所述的表达载体进一步包含编码醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列。调节序列在一些应用中，将本文所述核苷酸序列可操作连接至调节序列，其能够提供核苷 酸序列的表达，诸如由所选择的微生物进行。举例而言，本发明涵盖使用如下的载体，其包 含可操作连接至此类调节序列的本文所述核苷酸序列，即所述载体是表达载体。术语“可操作连接”指如下的并置，其中所述成分的关系容许它们以它们的预定方 式发挥功能。“可操作连接”至编码序列的调节序列以如下方式连接，即在与控制序列相容 的条件下实现编码序列的表达。术语“调节序列”包括启动子和增强子和其它表达调节信号。术语“启动子”以本领域普通含义使用，例如RNA聚合酶结合位点。编码本文所述酶的核苷酸序列的增强的表达还可以通过选择异源调节区来实现， 例如启动子、分泌前导序列和终止子区。优选地，将本文所述核苷酸序列可操作连接至至少一种启动子。其它启动子可同样用于指导本文所述多肽的表达。用于在细菌、真菌或酵母细胞中指导核苷酸序列转录的合适启动子的例子是本领 域公知的。启动子可另外包括特征以确保或提高合适宿主中的表达。例如，所述特征可以是 保守区，诸如I^ribnow框或TATA框。构建物术语“构建物”-其与术语诸如“缀合物”、“盒”和“杂合物”同义-包括直接或间 接附着至启动子的本文所述核苷酸序列。间接附着的一个例子是在启动子和本文所述核苷酸序列中间提供合适的间隔物 基团，诸如内含子序列，诸如Shl内含子或ADH内含子。涉及本发明的术语“融合”也是如 此，其包括直接或间接附着。在一些情况中，这些术语不覆盖天然组合的编码通常与野生型 基因启动子有关的蛋白质且它们都处于天然环境中时的核苷酸序列。构建物甚至可以含有或表达标志物，其容许选择遗传构建物。对于一些应用，优选地，构建物至少包含可操作连接至启动子的本文所述核苷酸 序列。启动子如本文所述，一方面，本发明涉及已经用引起微生物过表达醛糖-1-差向异构酶 的核苷酸序列，诸如启动子转化的微生物。例如，将启动子插入微生物的基因组，这使得微生物能够过表达(例如上调)编码 醛糖-1-差向异构酶的内源核苷酸序列。另一方面，将启动子可操作连接至例如表达载体中的核苷酸序列。另一方面，启动子不受葡萄糖的存在遏制。能在依照本发明的微生物，诸如酿酒酵母中使用的合适启动子的例子包括甘油 醛-3-磷酸脱氢酶(GPD)基因的启动子；醇脱氢酶(ADH)基因的启动子；促甲状腺胚胎因子 (TEF)基因的启动子。能在运动发酵单胞菌中和在棕榈发酵杆菌中使用的合适启动子的例 子包括发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(Conway等，1987)和发酵单胞菌烯醇化酶启动子(Burnett 等，1992)。 可用于过表达醛糖-1-差向异构酶的优选启动子可以是控制编码涉及糖酵解和 葡萄糖发酵的蛋白质的核苷酸序列表达的任何调节元件。例子包括但不限于
能够表达PGI1基因的P-Pgi启动子，所述启动子包含此基因和可读框YBR197C之 间的核苷酸序列；能够表达TPIl基因的P-tpi启动子，所述启动子包含此基因和可读框YDR051C之 间的核苷酸序列；能够表达HXK2基因的P-hxk启动子，所述启动子包含此基因和基因FZFl之间的 核苷酸序列；能够表达PHQ基因的ρ-pfk启动子，所述启动子包含此基因和基因YAP1802之间 的核苷酸序列；能够表达ΕΝ02基因的P-eno启动子，所述启动子包含此基因和基因SPC97之间的 核苷酸序列；能够表达TDH3基因的P-tdh启动子，所述启动子包含此基因和基因PDXl之间的 核苷酸序列；能够表达FBAl基因的P-fba启动子，所述启动子包含此基因和基因MPEl之间的 核苷酸序列；能够表达GPMl基因的P-gpm启动子，所述启动子包含此基因和可读框IL151C之 间的核苷酸序列；能够表达PDCl基因的P-pdc启动子，所述启动子包含此基因和基因STU2之间的 核苷酸序列；和，能够表达PGM2基因的P-pgm启动子，所述启动子包含此基因和基因YKU80之间的 核苷酸序列。生物燃料如本文中使用的，术语“生物燃料”指适合于在(例如)内燃机中使用的燃料(例 如液体燃料)。所述生物燃料衍生自包含戊糖和/或通过酶手段和/或通过酸处理的水解 能衍生戊糖的生物学物质。优选地，所述戊糖是戊醛糖。植物材料-包括包含木质纤维素材料的植物废物(例如谷类秆，诸如小麦秆；甜 菜浆；甘蔗渣；高粱秣；大豆秣；玉蜀黍秣；玉米秣；木屑；和纸浆)和完整植株(诸如那些 为能量目的而种植的，例如柳枝稷)_是用于本发明的戊糖，特别是戊醛糖的合适来源。植 物材料的其它合适来源包括非废物产品(换言之，食物和饲料来源)诸如甘蔗提取物、甜菜 提取物、高粱、大豆、小麦淀粉和玉米淀粉。优选地，本文所述生物燃料包含至少一种醇。在一个优选的方面，醇选自下组甲醇，乙醇，丙醇和丁醇。更优选地，生物燃料包
含乙醇。优选地，所述生物燃料是自依照本发明的经转化微生物已经在合适条件下培养的 培养液获得的(或可获得的)一换言之，提取(或可提取的)。所述生物燃料可以是使用本 领域常规技术自培养液获得的(或可获得的)，诸如通过离心除去微生物、分离上清液接着 蒸馏、和进一步的脱水步骤以产生99. 5%纯的乙醇。
生物燃料可包含一种或多种别的生物燃料成分，诸如丁醇。可以在自培养物获得或提取(可获得的或可提取的)生物燃料之前和/或之后将 一种或多种别的生物燃料成分与生物燃料混合。或者/另外，可以在在培养基中培养依照本发明的经转化微生物以生成生物燃料 之前和/或之后和/或同时通过在培养基中培养微生物来生成一种或多种别的生物燃料成 分。本发明还提供包含使用依照本发明的微生物生成的生物燃料的运输燃料。用作运输燃料的乙醇可用于两种不同目的(i)它能起氧化添加剂(oxygenated additive)的作用以提高辛烷值和降低新配 方汽油(RFG)(四乙铅或MTBE替代物)排放。(ii)它能起常规汽油(RG)部分或完全替代品的作用以降低对汽油供给的依赖性。无水乙醇具有130的辛烷值，而且能以5-10%的浓度(取决于季节)添加至直接 自精炼厂获得的常规汽油。传统上，将四乙铅用于提高辛烷，然而，由于健康问题，几乎全世 界都禁止使用铅。向常规汽油添加氧化剂(oxygenate)降低一氧化碳排放以及造成空气 污染的其它颗粒。甲基叔丁基醚(MTBE)最初用作氧化添加剂，然而，饮用水含水层中MTBE 污染的发生促使一些州禁止使用这种氧化剂。乙醇在全世界日益用作MTBE的替代物，作为 RFG制造的氧化添加剂。在充当新配方汽油生产中的氧化添加剂之外，乙醇可用作常规汽油的一般替代 品。在发动机没有任何改变的情况中，汽车能使用ElO混合物(添加10%乙醇)。另外，已经制造了能以100%乙醇运行的交通工具-换言之，不需要基于化石的燃 料。依照本发明的经转化微生物或通过依照本发明的方法制备的微生物能够以比转 化前的等同微生物要更高的速率生成生物燃料。如本文中使用的，术语“更高的速率”指在 相同培养条件下培养指数生长期内的给定时间段时，经转化微生物能够在培养液中生成比 转化前的等同微生物多至少5 %、10 %、20 %、25 %、30 %或35 %的生物燃料(诸如生物乙 醇)每细胞。戊糖衍生化合物如本文中使用的，术语“戊糖衍生化合物”指任何自戊糖衍生的化合物。戊糖衍生 化合物可以是自戊醛糖衍生的。戊糖衍生化合物可以是自戊酮糖衍生的。戊糖衍生化合物的例子包括但不限于乙醇，芳香族氨基酸，甲酚，衣康酸，乳酸， 琥珀酸，乙酸，乙醛，聚-3-羟基链烷酸盐/酯，和3-羟基丙酸。图1显示其它戊糖衍生化 合物，诸如自戊醛糖衍生的戊酮糖。可以将戊糖衍生产物转变成其它产物。例如，可以经戊 糖磷酸途径将自戊醛糖D-木糖衍生的戊酮糖D-木酮糖转变成乙醇。优选地，所述戊糖衍生化合物是乙醇、乳酸、琥珀酸、乙酸、乙醛、衣康酸、甲酚、 3-羟基丙酸、聚-3-羟基链烷酸盐/酯、原儿茶酸、焦儿茶酚、愈创木酚、藜芦醚、香草醛、香 草酸、香草醇、己二烯二酸、己二酸、4-羟基苯甲酸、4-羟基苯甲醛、4-甲氧基苯甲酸、4-氨 基苯甲酸盐/酯、4-羟基苯胺、4-甲氧基苯胺、对苯二酚、苯甲醚、酚、邻氨基苯甲酸、3-羟基 邻氨基苯甲酸盐/酯、2，3_ 二羟基苯甲酸、2-氨基苯酚、1，4_环己二酮和芳香族氨基酸。
优选地，所述戊糖衍生化合物是乙醇、甲酚、衣康酸、乳酸、琥珀酸、和3-羟基丙酸。更优选地，所述戊糖衍生化合物是乙醇。培养基培养基包含至少一种戊糖。在一个优选的方面，培养基包含至少一种戊醛糖。优选地，经转化微生物在所述微生物的最适培养基中培养。使用常规技术，可以确 定最适培养基；另外，可以确定最适生长条件。一方面，所述培养基在接种微生物(即在时间零)之前包含约1 %、约2%、约4%、 约8%、约15%或约25%戊醛糖。优选地，所述培养基包含最适量的盐、维生素和微生物所必需的其它养分。微生物优选于它们的最适生长温度培养。技术人员会容易地能够确定培养本文所 述微生物的最适温度。在一个实施方案中，微生物于约201、251、301、351、或371培养。在一个实施方案中，微生物于约35 °C至39 °C、优选约36 °C至38 V、更优选约 35. 5°C 至 37. 5°C 培养。优选地，微生物培养约3小时、约6小时、约15小时、约M小时、约48小时或约96 小时。一方面，微生物，特别是经转化微生物，是醇耐受的和/或酸耐受的。涉及本发明的术语“醇耐受的”指微生物能够在包含至少2^^5^^10%或15%醇 的培养基中生长。如本文所述，术语“酸耐受的”指微生物能够在pH等于或小于6. 5,6. 0,5. 0、4. 0或
3.0的培养基中生长。在一个优选的方面，给培养基接种至少切107至^clO11个细胞每kg培养基，优选 5xl08至^cIOiq个细胞每kg培养基，优选IxlO9至IXIOiq个细胞每kg培养基和更优选约 5xl09个细胞每kg培养基。术语“接种物”和“起始培养物”可互换使用。戊糖的来源戊糖(特别是戊醛糖)衍生或可衍生自植物。戊糖(特别是戊醛糖)可衍生自通常用作食物或饲料来源的植物材料(诸如甘 蔗、甜菜、高粱、小麦和玉米-它们是富含淀粉和富含糖的植物材料)；完整植株(诸如那些 为能量目的而种植的，例如柳枝稷)；和，特别地，废物农业(植物)材料(诸如谷类秆，例 如小麦秆；甜菜浆；渣，例如甘蔗渣；秣，例如高粱、大豆、玉蜀黍或玉米秣；和木屑)。用于本文所述培养基的戊糖的来源包括通常视为农业废物材料的木质纤维素材 料。茎/干、柄梗和叶含有木质纤维素材料。甘蔗渣、玉米秣和木屑(只有半纤维素)是三 种最容易获得的木质纤维素材料来源，因为这些在各个季节易于大量收集或储存。木质纤维素材料主要由长链糖组成。平均而言，三分之二的这些糖是己糖，它们主 要以纤维素存在，而且三分之一的糖是戊糖，主要以阿拉伯糖基木聚糖聚合物存在。显著量的半纤维素衍生戊糖是木糖。可以水解木质纤维素材料以释放纤维素、半纤维素和木质素的长链糖中的己糖和/或戊糖。木质纤维素材料的水解可以通过升高的温度的酸处理来进行。然而，这种处理可 生成糖衍生副产物，它们对大多数微生物有毒，而且阻止糖转变成乙醇。可以除去此类有毒 副产物(如果生成的话)，但是这一般是不经济的。或者，可以使用纤维素和半纤维素水解酶来水解木质纤维素材料。有利地，这种工 艺避免有毒副产物的生成。在一个优选的方面，培养基包含自一种或多种经处理以释放己糖和/或戊糖的木 质纤维素材料(此类处理技术的例子包括蒸气处理、蒸气爆发、湿氧化、酸水解、碱性湿氧 化和氨纤维膨胀)衍生的材料。优选地，通过酶促水解工艺来处理木质纤维素材料。可以 进一步处理所述经水解的木质纤维素材料以提取糖，之后在培养基中使用所述提取物。木质纤维素材料的水解初步机械处理根据需要及在认为需要时，将木质纤维素材料砍成小片。例如，将小麦秆切成长度 为大约5cm的段。后续湿热预处理木质纤维素材料的湿热预处理可以以蒸汽预处理接着清洗步骤来进行，由此生成 纤维级分和液体级分。纤维级分含有超过90%的纤维素、最初存在于纤维素材料中的木质 素、和一些半纤维素。液体级分含有来自半纤维素的糖(C5糖)、超过90%的包含在木质纤 维素生物质中的碱金属氯化物、和大部分自木质纤维素原料预处理产生的发酵抑制剂。典型地，通过蒸汽将小麦秆加热至介于180和200°C之间的温度，停留时间5_15分 钟。自压力反应器卸下经预处理的生物质，并清洗和挤压。收集释放的蒸汽，并再次用于液 体级分蒸发以进料糖蜜。酶促水解糖聚合物的后续水解可以通过添加纤维素酶和半纤维素酶来进行，或是在发酵之 前或是在发酵期间或是二者，就像同步糖化和发酵工艺等。己糖己糖具有6个碳原子。己醛糖在1位具有醛，而己酮糖在2位具有酮。葡萄糖是 己醛糖的例子。果糖是己酮糖的例子。戊糖戊糖具有5个碳原子。戊糖或是具有1位醛官能团(戊醛糖)或是具有2位酮官 能团(戊酮糖)。戊醛糖优选地，所述戊醛糖选自下组木糖，阿拉伯糖，核糖和来苏糖。更优选地，戊醛糖 是木糖或阿拉伯糖。在一个优选的方面，所述戊醛糖是木糖。更优选地，所述戊醛糖是D-木糖。戊酮糖优选地，所述戊酮糖是木酮糖或核酮糖。在一个优选的方面，所述戊酮糖是木酮糖。更优选地，所述戊酮糖是D-木酮糖。在一个优选的方面，所述戊酮糖是核酮糖。更优选地，所述核酮糖是D-核酮糖。
戊醛糖转变成戊酮糖戊醛糖转变成戊酮糖的例子包括但不限于木糖转变成木酮糖；阿拉伯糖转变成 木酮糖；阿拉伯糖转变成核酮糖；来苏糖转变成木酮糖；核糖转变成核酮糖；D-木糖转变成 D-木酮糖；L-阿拉伯糖转变成L-木酮糖或D-木酮糖；L-阿拉伯糖转变成L-核酮糖；D-来 苏糖转变成D-木酮糖；和D-核糖转变成D-核酮糖。不希望受理论束缚，典型地，真菌中涉及D-木糖转变成D-木酮糖的酶是木糖还原 酶和D-木酮糖还原酶。在细菌中，不希望受理论束缚，通常涉及D-木糖转变成D-木酮糖的酶是木糖异构酶。不希望受理论束缚，真菌中一般涉及L-阿拉伯糖转变成L-木酮糖的酶是阿拉伯 糖还原酶、L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶、L-木酮糖还原酶和D-木酮糖还原酶。在细菌中，不希望受理论束缚，典型地，涉及L-阿拉伯糖转变成L-核酮糖的酶是 L-阿拉伯糖异构酶。不希望受理论束缚，细菌中可涉及D-来苏糖转变成D-木酮糖的酶是来苏糖异构酶。不希望受理论束缚，可涉及D-核糖转变成D-核酮糖的酶是D-核糖异构酶。酶本文所述酶命名法编号(EC编号)指1992年出版的国际生物化学和分子生物学 联合会命名委员会关于酶命名和分类的推荐。本文所述酶可以由自极其多种来源衍生的核苷酸序列生成。一方面，编码本 文所述酶的核苷酸序列可以衍生或可衍生自乳酸乳球菌乳亚种(Lactococcus Iactis subsp. Iactis)、嗜热月旨肪地芽孢杆菌(Geobaci 1 lusstearothermophilus),粪肠球菌 (Enterococcus faecalis) > Piromyces sp>lif (Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus)、树干毕赤氏酵母(Pichia stipitis)、或酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)。醛糖-1-差向异构酶(EC 5. 1. 3. 3)本文所述醛糖-1-差向异构酶能够作用于戊醛糖。醛糖-1-差向异构酶具有EC命名法编号5. 1. 3. 3。醛糖差向异构酶可称作变 旋酶或醛糖变旋酶。术语醛糖-1-差向异构酶指能够将α-戊醛糖转变成戊醛糖和反之亦然的酶。在一个优选的实施方案中，醛糖-1-差向异构酶由选自下组的核苷酸序列编码 AAD20257 版本 1，ΑΒΧ75760 版本 1，ΑΑΚ05605 版本 1，AAD20245 版本 1，AAD20251 版本 1， ABJ73095版本1，ΑΒΙ49935版本1和ΑΑ080762版本1 (NCBI登录号)。更优选地，醛糖差 向异构酶选自下组AAD20257版本1，ABX75760版本1，AAK05605版本1，AAD20245版本1 和 AAD2(^51 版本 1。适合于如本文所述使用的醛糖-1-差向异构酶的例子包括由下述各项编码的 醛糖-1-差向异构酶乳酸乳球菌醛糖-1-差向异构酶基因的核苷酸序列(NCBI登录号 AAD20245)；酿酒酵母GALlO基因的核苷酸序列(特别地，编码具有变旋酶活性的氨基酸序列的部分)；和酿酒酵母菌株D0002 GALlO基因的核苷酸序列(特别地，编码具有变旋酶活 性的氨基酸序列的部分)。醛糖还原酶(EC1. 1. 1. 21)醛糖还原酶具有EC命名法编号1. 1. 1. 21。醛糖还原酶可称作多元醇脱氢酶，醛 还原酶，ALR2，NADPH-戊醛糖还原酶，NADPH-醛糖还原酶，醛醇NADP氧化还原酶或醛醇 NADP+I-氧化还原酶。术语醛糖还原酶指能够将醛醇转变成醛糖和反之亦然的酶。醛糖还原酶可还原超过一种类型的醛糖。例如，同一种酶可以能够还原D-木糖和 L-阿拉伯糖二者，此类酶因此可称作醛糖还原酶，或者，它可以更特异性地以底物之一命 名，例如木糖还原酶。木糖还原酶(EC1. 1. 1. 21)在一个实施方案中，醛糖还原酶是木糖还原酶。木糖还原酶具有EC命名法编号 1. 1. 1. 21。术语木糖还原酶指能够将D-木糖转变成木糖醇和反之亦然的酶。本文所述木糖还原酶能够作用于D-木糖。适合于如本文所述使用的木糖还原酶的例子包括由下述各项编码的木糖还原酶 树干毕赤氏酵母木糖还原酶基因(PsXR)的核苷酸序列；树干毕赤氏酵母菌株DSM3651木 糖还原酶基因(PsXR)的核苷酸序列-NCBI登录号)(59465版本1 ；纤细假丝酵母(Candida tenuis)的核苷酸序列(所述编码木糖还原酶的核苷酸序列可以如Kavanagh等，2003所述 来获得)；和粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)的核苷酸序列(所述编码木糖还原酶的核 苷酸序列可以如Woodyer等，2005所述来获得)。阿拉伯糖还原酶(EC 1. 1. 1. 21)在另一个实施方案中，醛糖还原酶是阿拉伯糖还原酶。阿拉伯糖还原酶具有EC命 名法编号1. 1. 1.21。术语阿拉伯糖还原酶指能够将L-阿拉伯糖转变成L-阿拉伯糖醇和反之亦然的酶。本文所述阿拉伯糖还原酶能够作用于L-阿拉伯糖。本领域当前已知的D-木糖还原酶也可以相似活性作用于作为底物的L-阿拉伯 糖。因此，术语L-阿拉伯糖还原酶也可指归类为D-木糖还原酶的酶，而且适合于引入木糖 代谢的本文所述木糖还原酶类似地适合用于将阿拉伯糖代谢引入微生物。在又一个实施方案中，醛糖还原酶可以能够将L-来苏糖转变成L-阿拉伯糖醇和 反之亦然。在另一个实施方案中，醛糖还原酶可以能够将D-来苏糖转变成D-阿拉伯糖醇 和反之亦然。在另一个实施方案中，醛糖还原酶可以能够将核糖转变成核糖醇(特别所将D-核 糖转变成D-核糖醇)和反之亦然。木酮糖还原酶(EC1. 1. 1. 9 和 EC 1. 1. 1. 10)术语木酮糖还原酶涵盖D-木酮糖还原酶和L-木酮糖还原酶。D-木酮糖还原酶(EC 1. 1. 1. 9)D-木酮糖还原酶具有EC命名法编号1. 1.1.9。D-木酮糖还原酶可称作木糖醇脱氢酶、木糖醇-2-脱氢酶、2，3-顺式-多元醇(DPN)脱氢酶(C34)、NAD依赖性木糖醇脱氢 酶、赤藓糖醇脱氢酶或戊糖醇-DPN脱氢酶。术语D-木酮糖还原酶指能够将木糖醇转变成D-木酮糖和反之亦然的酶。本文所述D-木酮糖还原酶能够作用于木糖醇。适合于如本文所述使用的D-木酮糖还原酶的例子包括由下述各项编码的D-木酮 糖还原酶树干毕赤氏酵母D-木酮糖基因(I5s)(DH)的核苷酸序列；和树干毕赤氏酵母菌株 DSM3651D-木酮糖还原酶基因(I3s)(DH)的核苷酸序列-NCBI登录号)(55392版本1。L-木酮糖还原酶(EC 1. 1. 1. 10)L-木酮糖还原酶具有EC命名法编号1. 1. 1. 10。L-木酮糖还原酶可称作L-木糖
醇脱氢酶。术语L-木酮糖还原酶指能够将L-木酮糖转变成木糖醇和反之亦然的酶。本文所述L-木酮糖还原酶能够作用于L-木酮糖。编码L-木酮糖还原酶的核苷酸序列可以自黑曲霉(Aspergillus niger)(如 Witteveen 等，1994 所述)或自酵母单孢神食酵母(Ambrosiozymamonospora) (Verho 等， 2004)获得。木酮糖激酶(EC2. 7. 1. 17)木酮糖激酶具有EC命名法编号2. 7. 1. 17。木酮糖激酶可称作D-木酮糖激酶。术语木酮糖激酶指能够将D-木酮糖转变成D-木酮糖5-磷酸和反之亦然的酶。本文所述木酮糖激酶能够作用于D-木酮糖。适合于如本文所述使用的木酮糖激酶的例子包括由下述各项编码的木酮糖激酶: 树干毕赤氏酵母木酮糖激酶基因O3SXKQ的核苷酸序列；树干毕赤氏酵母菌株DSM3651木 酮糖激酶基因O3SXKS)的核苷酸序列-NCBI登录号AF127802版本1 ；酿酒酵母木酮糖激酶 基因GcXKQ的核苷酸序列；和酿酒酵母菌株D0002木酮糖激酶基因GcXKQ的核苷酸序 列-NCBI登录号X61377版本1。木糖异构酶(EC5. 3. 1. 5)木糖异构酶具有EC命名法编号EC 5. 3. 1. 5。木糖异构酶可称作D-木糖异构酶、 D-木糖酮异构酶、或D-木糖酮醇异构酶。术语木糖异构酶指能够将D-木糖转变成D-木酮糖和反之亦然的酶。本文所述木糖异构酶能够作用于D-木糖。适合于如本文所述使用的木糖异构酶的例子包括由下述各项编码的木糖异构 酶Piromyces木糖异构酶基因(PmXI)的核苷酸序列；Piromyces sp E2木糖异构酶基因 (PmXI)的核苷酸序列-NCBI登录号AJM9909版本1 ；和热硫化氢高温厌氧杆菌木糖异构酶 基因(ThXI)的核苷酸序列-NCBI登录号D00756版本1 ；SEQ ID No 2和SEQ ID No 3。D-阿拉伯糖醇4-脱氢酶(EC 1. 1. 1. 11)D-阿拉伯糖醇4-脱氢酶具有EC命名法编号1. 1. 1. 11。D-阿拉伯糖醇4_脱氢酶 可称作D-阿拉伯糖醇脱氢酶或阿拉伯糖醇脱氢酶。术语D-阿拉伯糖醇4-脱氢酶指能够将D-阿拉伯糖醇转变成D-木酮糖和反之亦 然的酶。本文所述D-阿拉伯糖醇4-脱氢酶能够作用于D-阿拉伯糖醇。
一种合适的D-阿拉伯糖醇4-脱氢酶和相应的基因记载于Cheng等，2005。L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶(EC 1. 1. 1. 12)L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶具有EC命名法编号1. 1. 1. 12。L-阿拉伯糖醇4_脱氢酶 可称作L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶或戊糖醇-DPN脱氢酶。术语L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶指能够将L-阿拉伯糖醇转变成L-木酮糖和反之亦 然的酶。本文所述L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶能够作用于L-阿拉伯糖醇。一种合适的L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶和相应的基因记载于Richard等，2001。L-阿拉伯糖异构酶(EC 5. 3. 1. 4)L-阿拉伯糖异构酶具有EC命名法编号5. 3. 1. 4。L-阿拉伯糖异构酶可称作L-阿 拉伯糖酮醇异构酶。术语L-阿拉伯糖异构酶指能够将L-阿拉伯糖转变成L-核酮糖和反之亦然的酶。本文所述L-阿拉伯糖异构酶能够作用于L-阿拉伯糖。编码L-阿拉伯糖异构酶的核苷酸序列的一个例子是可以自植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)菌株 NCIMB8^6 (ATCC 14917)获得的核苷酸序列(NCBI 登录 码NC_004567版本1中记载的基因)。核酮糖激酶(EC2. 7. 1. 16)核酮糖激酶具有EC命名法编号2. 7. 1. 16。核酮糖激酶可称作L-核酮糖激酶。术语核酮糖激酶指能够(i)将L-核酮糖转变成L-核酮糖5-磷酸和反之亦然；和 /或(ii)将D-核酮糖转变成D-核酮糖5-磷酸和反之亦然的酶。本文所述核酮糖激酶能够作用于L-核酮糖和/或D-核酮糖。一种合适的编码核酮糖激酶的核苷酸序列可以自植物乳杆菌菌株 NCIMB8826 (ATCC 14917)获得(NCBI登录码NC_004567版本1中记载的基因)。L-核酮糖磷酸4-差向异构酶(EC 5. 1. 3. 4)L-核酮糖磷酸4-差向异构酶具有EC命名法编号5. 1. 3. 4。L-核酮糖磷酸4_差 向异构酶可称作核酮糖磷酸4-差向异构酶、磷酸核酮糖异构酶、L-核酮糖5-磷酸4-差向 异构酶、AraD或L-Ru5P。术语L-核酮糖磷酸4-差向异构酶指能够将L-核酮糖5-磷酸转变成D-木酮糖 5-磷酸和反之亦然的酶。本文所述L-核酮糖磷酸4-差向异构酶能够作用于L-核酮糖5-磷酸。一种合适的编码L-核酮糖磷酸4-差向异构酶的核苷酸序列可以自植物乳杆菌菌 株NCIMB8^6 (ATCC 14917)获得(NCBI登录码NC_004567中记载的基因)。D-核糖醇4-脱氢酶D-核糖醇4-脱氢酶具有EC命名法编号1. 1. 1. 56。这种酶也可称作核糖醇2-脱氢酶、福寿糖醇脱氢酶或核糖醇脱氢酶。术语D-核糖醇4-脱氢酶指能够将核糖醇转变成D-核酮糖和反之亦然的酶。
本文所述D-核糖醇4-脱氢酶能够作用于D-核糖醇。一种合适的D-核糖醇4-脱氢酶和相应的基因记载于Dothie等，1985。D-来苏糖异构酶(EC 5. 3. 1. 15)
D-来苏糖异构酶具有EC命名法编号5. 3. 1. 15。这种酶也可称作D-来苏糖酮醇 异构酶。术语D-来苏糖异构酶指能够将D-来苏糖转变成D-木酮糖和反之亦然的酶。本文所述D-来苏糖异构酶能够作用于D-来苏糖。编码D-来苏糖/L-核糖异构酶的核苷酸序列可以自生物体不动杆菌 (Acinetobacter sp.)菌株 DL—28 (Shimonishi 禾口 Izumori, 1996)或产气气杆菌 (Aerobacter aerogenes) (Anderson 禾口 Allison, 1965)克隆。核糖异构酶(EC5. 3. 1. 20)核糖异构酶具有EC命名法编号5. 3. 1. 20。这种酶也可称作D-核糖异构酶或D-核 糖酮醇异构酶。术语核糖异构酶指能够将D-核糖转变成D-核酮糖和反之亦然的酶。本文所述核糖异构酶能够作用于D-核糖。已经在生物体耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis) (Izumori φ, 1975)中 找到D-核糖异构酶，可以自该生物体克隆D-核糖异构酶。核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶(EC 5. 1. 3. 1)核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶具有EC命名法编号5. 1.3. 1。这种酶也可称作 戊糖-5-磷酸3-差向异构酶，磷酸戊酮糖3-差向异构酶，磷酸戊酮糖差向异构酶，磷酸核 酮糖差向异构酶，核酮糖-磷酸3-差向异构酶；D-核酮糖5-磷酸差向异构酶；D-核酮糖磷 酸-3-差向异构酶；D-核酮糖-5-P3-差向异构酶；D-木酮糖-5-磷酸3-差向异构酶；赤 藓糖-4-磷酸异构酶；核酮糖5-磷酸3-差向异构酶；和木酮糖磷酸3-差向异构酶。术语核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶指能够将D-核酮糖5-磷酸转变成D-木酮糖 5-磷酸和反之亦然的酶。适合于如本文所述使用的核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶的例子包括由下述各项 编码的核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶酿酒酵母RPEl基因的核苷酸序列；酿酒酵母菌株 D0002RPE1基因的核苷酸序列；NCBI登录码NP_01M14版本1的核苷酸序列；和能在NCBI 登录码NP_012414版本1中找到的来自树干毕赤氏酵母的核酮糖-5-磷酸异构酶。核糖-5-磷酸异构酶(EC 5. 3. 1. 6)核糖-5-磷酸异构酶具有EC命名法编号5. 3. 1.6。这种酶也可称作磷酸戊糖异构 酶、磷酸戊糖异构酶、磷酸戊糖异构酶、磷酸核糖异构酶、核糖5-磷酸差向异构酶、核糖磷 酸异构酶、5-磷酸核糖异构酶、或D-核糖-5-磷酸酮醇异构酶。术语核糖-5-磷酸异构酶指能够将D-核糖5-磷酸转变成D-核酮糖5_磷酸和反 之亦然的酶。适合于如本文所述使用的核糖-5-磷酸异构酶的例子包括由下述各项编码的核 糖-5-磷酸酮醇异构酶酿酒酵母RKIl基因的核苷酸序列；酿酒酵母菌株D0002 RKIl基因 的核苷酸序列；NCBI登录码X94335版本1的核苷酸序列；NCBI登录码ΝΡ_014738版本1的 核苷酸序列，和能在登录号NC_009043版本1中找到的来自树干毕赤氏酵母的核糖-5-磷 酸异构酶。转酮醇酶(EC2. 2. 1. 1)转酮醇酶具有EC命名法编号2. 2. 1. 1。这种酶也可称作羟乙醛转移酶。
术语转酮醇酶指能够将景天庚酮糖7-磷酸+D-甘油醛3-磷酸转变成D-核糖 5-磷酸+D-木酮糖5-磷酸和反之亦然的酶。适合于如本文所述使用的转酮醇酶的例子包括由下述各项编码的转酮醇酶酿酒 酵母TKLl基因的核苷酸序列；酿酒酵母菌株D0002 TKLl基因的核苷酸序列；NCBI登录码 X73224版本1的核苷酸序列；NCBI登录码NP_015399版本1的核苷酸序列和能在登录码 CP000496版本1中找到的来自树干毕赤氏酵母的转酮醇酶。转醛醇酶(EC2. 2. 1. 2)转醛醇酶具有EC命名法编号2. 2.1.2.这种酶也可称作二羟基丙酮转移酶、二羟 基丙酮合酶、甲醛转酮醇酶或甘油酮转移酶。术语转醛醇酶指能够将景天庚酮糖7-磷酸+D-甘油醛3-磷酸转变成D-赤藓糖 4-磷酸+D-果糖6-磷酸和反之亦然的酶。适合于如本文所述使用的转醛醇酶的例子包括由下述各项编码的转醛醇酶酿酒 酵母TALl基因的核苷酸序列；酿酒酵母菌株D0002 TALl基因的核苷酸序列；NCBI登录码 X15953版本1的核苷酸序列；NCBI登录码NP_013458版本1的核苷酸序列，和能在登录码 CP000502中找到的来自树干毕赤氏酵母的转醛醇酶。戊醛糖测定法溶液(诸如培养液)中戊醛糖的量可以通过如m^ert等(A Simplified, Colorimetric Micromethod for Xylose in Serum or Urine,with Phloroglucinol, 1979, Clin. Chem. 25，no. 8，pp. 1440-1443)记载的根皮酚法来比色测定。显色试剂由0.5g根皮酚(1，3，5-三羟基苯)、IOOml冰乙酸和IOml浓HCl组成。 将50 μ 1样品添加至950 μ 1显色试剂。将混合物加热至100°C达4分钟，并于554nm读取 混合物的吸光度。依据用同一种戊醛糖作为标准品绘制的标准曲线确定样品中戊醛糖的 量。这种方法可用于测定培养液中木糖、阿拉伯糖、来苏糖和核糖的量。互相转变测定法微生物催化α -戊醛糖和β -戊醛糖之间转变的能力可以通过多种方法来测定。 例如，醛糖的α和β-异头物之间的互相转变可以通过NMR来跟踪(例如如Ryu等，2004 解释的)，或通过偶联测定法来跟踪(其中跟踪对异头物之一特异性的酶的活性，如Brahma 禾口 Bhattacharyya，2004 记载的)。戊酮糖测定法溶液(诸如培养液)中戊酮糖的量可以通过如^icharias Dische和 EllenBorenffeund(1951 J. Biol. Chem. 192(2) :583)记载的半胱氨酸-咔唑法来比色测定。乙醇测定法溶液(诸如培养液)中生物燃料像乙醇的量可以通过使用由 Megazymelnternational, Bray Business Park, Bray, Co. Wicklow, Ireland 制造禾口销售的 商品化乙醇测定法K-ETOH试剂盒来测定；或者它可以通过例如使用气相层析来测定。戊糖磷酸途径戊酮糖经戊糖磷酸途径被转变成乙醇。这样的一个例子显示于图4。涉及戊糖磷酸途径的酶的例子包括转酮醇酶，转醛醇酶，核糖-5-磷酸酮醇异构酶和核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶。在一个实施方案中，依照本发明的微生物还已经转化以表达或过表达一种或多种 涉及戊糖磷酸途径的酶。在一个实施方案中，依照本发明的微生物还已经用引起微生物过表达一种或多种 涉及戊糖磷酸途径的酶的一种或多种核苷酸序列转化。例如，将启动子插入微生物的基因 组，使得微生物能够过表达编码涉及戊糖磷酸途径的酶的内源核苷酸序列。在另一个实施方案中，微生物已经用编码一种或多种涉及戊糖磷酸途径的酶的一 种或多种核苷酸序列转化。例如，微生物用表达载体转化，该表达载体包含编码一种或多种 涉及戊糖磷酸途径的酶的核苷酸序列。优选地，本文所述表达载体包含一种或多种启动子，其能够过表达编码一种或多 种涉及戊糖磷酸途径的酶的一种或多种核苷酸序列。此类启动子的例子包括GPD启动子、 TEF启动子和ADP启动子。可用于过表达编码一种或多种涉及戊糖磷酸途径的酶的一种或 多种核苷酸序列的优选启动子可以是任何控制编码涉及糖酵解和葡萄糖发酵的蛋白质的 核苷酸序列表达的调节元件。如本文中使用的，短语“引起微生物过表达一种或多种涉及戊糖磷酸途径的酶的 一种或多种核苷酸序列”和“能够过表达编码一种或多种涉及戊糖磷酸途径的酶的一种或 多种核苷酸序列的一种或多种启动子”中的术语“过表达”指在比较经转化微生物与转化前 的等同微生物时，表达自零升高至某表达水平或自较低的表达水平升高至较高的表达水平 (例如上调)。过表达一种或多种涉及戊糖磷酸途径的酶的微生物具有升高的催化戊酮糖 (诸如木酮糖5-磷酸)转变成生物燃料(诸如乙醇)的能力。优选地，所述过表达一种或多种涉及戊糖磷酸途径的酶的经转化微生物能够以比 未转化的微生物要高至少10 %、15 %、20 %或25 %的速率催化戊酮糖(诸如木酮糖5-磷 酸)转变成生物燃料(诸如乙醇)。表达一种或多种涉及戊糖磷酸途径的酶的微生物的例子包括(i)经编码一种或 多种转酮醇酶、转醛醇酶、核糖-5-磷酸酮醇异构酶和核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶的一 种或多种表达载体转化的微生物；和(ii)经转化以上调编码一种或多种转酮醇酶、转醛醇 酶、核糖-5-磷酸酮醇异构酶和核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶的一种或多种内源核苷酸序 列表达的微生物(在转化之前，所述微生物能够在指数生长期间对于给定的培养条件集表 达一种或多种这些酶，但是在转化之后，所述微生物能够在指数生长期间在相同培养条件 中以更高的水平表达一种或多种这些酶)。现在会借助实施例进一步描述本发明，实施例意图用来帮助本领域技术人员实施 本发明而非意图以任何方式限制本发明的范围。
实施例一般重组DNA方法学技术除非另外指明，本发明采用化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的 常规技术，它们在本领域普通技术人员的能力之内。文献中解释了此类技术。参见例 如 Sambrook 等，1989 ；Ausubel, F. M.等，1995 ；Roe 等，1996 ；Gait, 1984 ；及 Lilley 和 Dahlberg, 1992。通过述及将每一篇这些通用教科书收入本文。
除非另外指明，本发明采用化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的 常规技术，它们在本领域普通技术人员的能力之内。文献中解释了此类技术。参见例 如 J. B. Roe, J. Crabtree,禾口 k. Kahn,1996, DNA Isolationand Sequencing :Essential Techniques, John Wiley & Sons ;Μ· J. Gait (编)，1984, Oligonucleotide Synthesis :A Practical Approach, Irl Press ；及 D. M. J. Lilley 禾口 J. E. Dahlberg,1992, Methods of Enzymology :DNA Structure Part A :Synthesisand Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press0通过述及将每一篇这些通用教科书收入本文。实施例Ia-基于NCBI登录码AAD20245版本1的乳酸乳球菌的合成变旋酶基因 (醛糖-1-差向异构酶)的构建。由GeneartAG (Regensburg，Germany)合成和装配完整乳酸乳球菌醛糖差向异 构酶基因(L1MI )。序列中的密码子选择是基于来自Kazusa密码子选择数据库(Nakamura 等，2000)的酵母密码子选择表而优化的。在合成的构建物中在可读框的侧翼包括靠近ATG 起始密码子的NheI限制性位点和远离终止密码子的BioI限制性位点。通过对两条链的测 序来确定LlMR合成基因的完整性。包括侧翼限制性位点的LlMR的核苷酸序列鉴定为SEQ ID NO 1(即AAD20245)，而由此核苷酸序列编码的氨基酸序列鉴定为SEQ ID No 47。包含 的质粒命名为0717050pGA14。实施例Ib-基于NCBI登录码AJM9909版本1的Piromyces sp. E2的合成木糖异 构酶基因的构建。由 Geneart AG(Regensburg，Germany)合成禾口装配完整 Piromyces 木糖异构醇 基因(PmXI)。序列中的密码子选择是基于来自Kazusa密码子选择数据库(Nakamura等， 2000)的酵母密码子选择表而优化的。在合成的构建物中在可读框的侧翼包括靠近ATG起 始密码子的NheI限制性位点和远离终止密码子的BioI限制性位点。通过对两条链的测 序来确定PmXI合成基因的完整性。包括侧翼限制性位点的PmXI的核苷酸序列鉴定为SEQ ID NO 2，而由此核苷酸序列编码的氨基酸序列鉴定为SEQ ID No 48。包含的质粒命名为 0717049pGA15。实施例Ic-基于NCBI登录码D00756版本1的热硫化氢高温厌氧杆菌的合成木糖 异构酶(XylA)基因的构建。由Geneart AG (Regensburg，Germany)合成和装配完整热硫化氢高温厌氧杆菌 木糖异构酶基因(ThXI)。序列中的密码子选择是基于来自Kazusa密码子选择数据库 (Nakamura等，2000)的酵母密码子选择表而优化的。在合成的构建物中在可读框的侧翼包 括靠近ATG起始密码子的NheI限制性位点和远离终止密码子的BioI限制性位点。通过对 两条链的测序来确定ThXI合成基因的完整性。包括侧翼限制性位点的ThXI的核苷酸序列 鉴定为SEQ ID NO 3，而由此核苷酸序列编码的氨基酸序列鉴定为SEQ ID No 49。包含的 质粒命名为0717046pGA14。实施例基于NCBI登录码AF127802版本1的来自树干毕赤氏酵母菌株DSM3651 的D-木酮糖激酶基因的Τ0Ρ0克隆。使用由SEQ ID NO 4禾口 SEQ ID NO 5鉴定的引物自得自菌株DSM3651的DNAPCR 扩增完整树干毕赤氏酵母D-木酮糖激酶基因O^XKQ。在I5sXKS基因侧翼导入靠近ATG起 始密码子的NheI限制性位点和远离终止密码子的BioI限制性位点。作为模板，以0. 2ng/μ 1 PCR反应的浓度使用来自树干毕赤氏酵母菌株的DNA。使用Wrnsion高保真DNA聚合 酶(Finnzymes 0y, Finland)实施 PCR，30 个循环的 30 秒 96°C >30 秒 50°C、和 150 秒 72°C, 接着是最终温育10分钟72°C。通过电泳将PCR产物在1 %低熔点琼脂糖凝胶上分开，并 分离1891bp片段。依照制造商的用法说明将DNA片段TOPO克隆入pCR-Blimtll-TOPO载 体(Invitrogen，USA)，并将所得质粒用于转化大肠杆菌T0P10。质粒命名为pCR-Blunt 2 P.stip XKS0实施例2b-基于NCBI登录码)(59465版本1的来自树干毕赤氏酵母菌株DSM3651 的D-木糖还原酶基因的TOPO克隆。使用由SEQ ID NO 6和SEQ ID NO 7鉴定的引物自得自菌株DSM3651的DNA PCR 扩增完整树干毕赤氏酵母木糖还原酶基因(PsXR)。在基因侧翼导入靠近ATG起始 密码子的NheI限制性位点和远离终止密码子的BioI限制性位点。作为模板，以0. 2ng/ μ 1 PCR反应的浓度使用来自树干毕赤氏酵母菌株的DNA。使用Wrnsion高保真DNA聚合 酶(Finnzymes 0y, Finland)实施 PCR，30 个循环的 30 秒 96°C >30 秒 50°C、和 150 秒 72°C, 接着是最终温育10分钟72°C。通过电泳将PCR产物在低熔点琼脂糖凝胶上分开，并 分离976bp片段。依照制造商的用法说明将DNA片段TOPO克隆入pCR-Blunt II-TOPO载 体(Invitrogen，USA)，并将所得质粒用于转化大肠杆菌T0P10。质粒命名为pCR-Blunt 2 P.stip XR0实施例2c-基于NCBI登录码)(55392版本1的来自树干毕赤氏酵母菌株DSM3651 的木糖醇脱氢酶(D-木酮糖还原酶)基因的TOPO克隆。使用由SEQ ID NO 8和SEQ ID NO 9鉴定的引物自得自菌株DSM3651的DNA PCR 扩增完整树干毕赤氏酵母木糖醇脱氢酶基因(I3s)(DH)。在基因侧翼导入靠近ATG起 始密码子的NheI限制性位点和远离终止密码子的BioI限制性位点。作为模板，以0. 2ng/ μ 1 PCR反应的浓度使用来自树干毕赤氏酵母菌株的DNA。使用Wrnsion高保真DNA聚合 酶(Finnzymes 0y, Finland)实施 PCR，30 个循环的 30 秒 96°C >30 秒 50°C、和 150 秒 72°C, 接着是最终温育10分钟72V。通过电泳将PCR产物在低熔点琼脂糖凝胶上分开，并 分离IlOSbp片段。依照制造商的用法说明将DNA片段TOPO克隆入pCR-Blimtll-TOPO载 体(Invitrogen，USA)，并将所得质粒用于转化大肠杆菌T0P10。质粒命名为pCR-Blunt 2P.stip XDH0实施例2d-基于NCBI登录码NC_004567版本1的来自植物乳杆菌菌株 NCIMB8826 (ATCC 14917)的L-阿拉伯糖异构酶基因(EC 5.3.1.4)的Τ0Ρ0克隆。使用由SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11鉴定的引物自得自菌株ATCC14917的DNA PCR扩增完整植物乳杆菌L-阿拉伯糖异构酶基因(LpAraA)。在LpAraA基因侧翼导入靠近 ATG起始密码子的NheI限制性位点和远离终止密码子的BioI限制性位点。作为模板，以 0. 2ng/ μ 1 PCR反应的浓度使用来自植物乳杆菌菌株的DNA。使用Wmsion高保真DNA聚 合酶(FinnzymesOy，Finland)实施 PCR, 30 个循环的 30 秒 96°C >30 秒 55°C、和 60 秒 72°C， 接着是最终温育10分钟72°C。通过电泳将PCR产物在0. 7%低熔点琼脂糖凝胶上分开，并 分离1444bp片段。依照制造商的用法说明将DNA片段Τ0Ρ0克隆入pCR-Blunt ΙΙ-Τ0Ρ0载 体(Invitrogen，USA)，并将所得质粒用于转化大肠杆菌T0P10。实施例2e_基于NCBI登录码NC_004567版本1的来自植物乳杆菌菌株NCIMB8826 (ATCC 14917)的 L-核酮糖激酶基因(EC 2.7.1.16)的 TOPO 克隆。使用由SEQ ID NO 12和SEQ ID NO 13鉴定的引物自得自菌株ATCC14917的 DNAPCR扩增完整植物乳杆菌L-核酮糖激酶基因(LpAraB)。在LpAraB基因侧翼导入靠近 ATG起始密码子的NheI限制性位点和远离终止密码子的BioI限制性位点。作为模板，以 0. 2ng/ μ 1 PCR反应的浓度使用来自植物乳杆菌菌株的DNA。使用Wm si on高保真DNA聚合 酶(Finnzymes 0y, Finland)实施 PCR, 30 个循环的 30 秒 96°C、30 秒 55°C、和 60 秒 72°C， 接着是最终温育10分钟72°C。通过电泳将PCR产物在0. 7%低熔点琼脂糖凝胶上分开，并 分离1618bp片段。依照制造商的用法说明将DNA片段TOPO克隆入pCR-Blunt II-TOPO载 体(Invitrogen，USA)，并将所得质粒用于转化大肠杆菌T0P10。实施例2f_基于NCBI登录码NC_004567版本1的来自植物乳杆菌菌株 NCIMB8826 (ATCC 14917)的L-核酮糖-5-磷酸4-差向异构酶基因(EC 5.1.3.4)的TOPO克隆。使用由SEQ ID NO 14和SEQ ID NO 15鉴定的引物自得自菌株ATCC14917的DNA PCR扩增完整植物乳杆菌L-核酮糖-5-磷酸4-差向异构酶基因(LpAraD)。在LpAraD基因 侧翼导入靠近ATG起始密码子的NheI限制性位点和远离终止密码子的BioI限制性位点。 作为模板，以0. 2ng/ μ 1 PCR反应的浓度使用来自植物乳杆菌菌株的DNA。使用Wmsion高 保真 DNA 聚合酶(Finnzymes 0y, Finland)实施 PCR，30 个循环的 30 秒 96°C、30 秒 55°C、和 60秒72°C，接着是最终温育10分钟72°C。通过电泳将PCR产物在0. 7%低熔点琼脂糖凝 胶上分开，并分离745bp片段。依照制造商的用法说明将DNA片段TOPO克隆入pCR-Blunt II-TOPO载体(Invitrogen，USA)，并将所得质粒用于转化大肠杆菌T0P10。实施例2g-基于NCBI登录号码D5888版本1的来自酿酒酵母菌株D0002的GALlO 基因的TOPO克隆。使用由SEQ ID NO 16和SEQ ID NO 17鉴定的引物自得自酿酒酵母菌株D0002的 DNA PCR扩增完整酿酒酵母GALlO基因(&GAL10)。在&GAL10基因侧翼导入靠近ATG起始 密码子的NheI限制性位点和远离终止密码子的BioI限制性位点。作为模板，以0. 2ng/yl PCR反应的浓度使用来自酿酒酵母菌株的DNA。使用Wiusion高保真DNA聚合酶(Finnzymes 0y, Finland)实施PCR，35个循环的30秒96°C、30秒57°C、和120秒72°C，接着是最终温育 10分钟72°C。通过电泳将PCR产物在0. 7%低熔点琼脂糖凝胶上分开，并分离2116bp片 段。依照制造商的用法说明将DNA片段TOPO克隆入pCR-Bluntll-TOPO载体(Invitrogen， USA)，并将所得质粒用于转化大肠杆菌T0P10。质粒命名为kGAL-a23a。实施例2h_基于NCBI登录码D5888版本1的来自酿酒酵母菌株D0002的截短型 GAL10基因[核苷酸1084-2100]的Τ0Ρ0克隆。使用由SEQ ID NO 18和SEQ ID NO 17鉴定的引物自得自酿酒酵母菌株D0002的 DNAPCR扩增完整N端截短型酿酒酵母GAL10基因(&GAL10 Δ )。在&GAL10 Δ基因侧翼导入 靠近ATG起始密码子的NheI限制性位点和远离终止密码子的BioI限制性位点。作为模板， 以0. 2ng/ μ 1 PCR反应的浓度使用来自酿酒酵母菌株的DNA。使用Wmsion高保真DNA聚合 酶(Finnzymes 0y, Finland)实施 PCR，35 个循环的 30 秒 96°C >30 秒 57°C、和 120 秒 72°C, 接着是最终温育10分钟72°C。通过电泳将PCR产物在0. 7%低熔点琼脂糖凝胶上分开，并 分离1036bp片段。依照制造商的用法说明将DNA片段Τ0Ρ0克隆入pCR-Blunt ΙΙ-Τ0Ρ0载体anvitrogen，USA)，并将所得质粒用于转化大肠杆菌T0P10。质粒命名为&GALA-aMa。实施例3a_在来自酿酒酵母的GPD启动子和CYCl终止子控制下含有Piromyces 木糖异构酶(PmXI)基因的质粒PmXI-8a的构建。用SpeI和BioI消化大肠杆菌/酿酒酵母高拷贝穿梭载体P似6-GPD (Mumberg等， 1995)，并用碱性磷酸酶将所得末端去磷酸化。类似地，通过用NheI和B10I消化来自载体 0717049pGA15(实施例Ib中描述的)释放编码Piromyces木糖异构酶基因的DNA片段。通 过电泳将所得线性化质粒P^6-GPD和编码PmXI的DNA片段在1 %低熔点琼脂糖凝胶上分 开，并分离。将两个DNA片段连接到一起，产生命名为PmXI-Sa的质粒。实施例3b_在来自酿酒酵母的GPD启动子和CYCl终止子控制下含有热硫化氢高 温厌氧杆菌木糖异构酶(ThXI)基因的质粒ThXI_5a的构建。用SpeI和BioI消化大肠杆菌/酿酒酵母高拷贝穿梭载体P似6-GPD (Mumberg等， 1995)，并用碱性磷酸酶将所得末端去磷酸化。类似地，通过用NheI和B10I消化来自载体 0717046pGA14(实施例Ic中描述的)释放编码热硫化氢高温厌氧杆菌木糖异构酶基因的 DNA片段。通过电泳将所得线性化质粒P^6-GPD和编码ThXI的DNA片段在1 %低熔点琼 脂糖凝胶上分开，并分离。将两个DNA片段连接到一起，产生命名为ThXI_5a的质粒。实施例3c-在来自酿酒酵母的GPD启动子和CYCl终止子控制下含有树干毕赤氏 酵母D-木酮糖激酶O3SXKQ基因的质粒I^sXKS-Ha的构建。用SpeI和BioI消化大肠杆菌/酿酒酵母高拷贝穿梭载体P^6_GPD (Mumberg等， 1995)，并用碱性磷酸酶将所得末端去磷酸化。类似地，通过用NheI和B10I消化来自载体 pCR-Blunt 2 P. stip XKS (实施例加中描述的)释放编码树干毕赤氏酵母木酮糖激酶基因 的DNA片段。通过电泳将所得线性化质粒P^6-GPD和编码I^sXKS的DNA片段在1 %低熔点 琼脂糖凝胶上分开，并分离。将两个DNA片段连接到一起，产生命名为I^sXKS-Ha的质粒。实施例3d-在来自酿酒酵母的GPD启动子和CYCl终止子控制下含有树干毕赤氏 酵母木糖还原酶(PsXR)基因的质粒和PsXR-25的构建。 用SpeI和BioI消化大肠杆菌/酿酒酵母高拷贝穿梭载体P似6_GPD (Mumberg等， 1995)，并用碱性磷酸酶将所得末端去磷酸化。类似地，通过用NheI和B10I消化来自载体 pCR-Blunt 2 P. stip XR(实施例2b中描述的)释放编码树干毕赤氏酵母木糖还原酶基因 的DNA片段。通过电泳将所得线性化质粒P4M-GPD和P414-GPD和编码的DNA片段 在1 %低熔点琼脂糖凝胶上分开，并分离。将线性化质粒P4M-GPD与片段连接到一 起，产生命名为PsXR-Ma的质粒。同样地，将线性化质粒P414-GPD与片段连接到一 起，产生命名为PsXR-25a的质粒。实施例3e_在来自酿酒酵母的GPD启动子和CYCl终止子控制下含有树干毕赤氏 酵母木糖醇脱氢酶(I3S)(DH)基因(木酮糖还原酶)的质粒I^)(DH-lla的构建。用SpeI和BioI消化大肠杆菌/酿酒酵母高拷贝穿梭载体P似6_GPD (Mumberg等， 1995)，并用碱性磷酸酶将所得末端去磷酸化。类似地，通过用NheI和B10I消化来自载体 pCR-Blunt 2 P. stip )(DH(实施例2c中描述的)释放编码树干毕赤氏酵母木酮糖脱氢酶基 因的DNA片段。通过电泳将所得线性化质粒P^6-GPD和编码的DNA片段在1 %低 熔点琼脂糖凝胶上分开，并分离。将两个DNA片段连接到一起，产生命名为I^CDH-Ila的质 粒。
实施例3f_在来自酿酒酵母的各种启动子和CYCl终止子控制下含有乳酸乳球菌 变旋酶基因(LlMR)基因(醛糖-1-差向异构酶)的质粒LlMR-36a、LlMR-38a和LlMR-40a 的构建。用SpeI和BioI消化大肠杆菌/酿酒酵母低拷贝穿梭载体P413-GPD、P413-ADH 和P413-TEF (Mumberg等，1995)，并用碱性磷酸酶将所得末端去磷酸化。类似地，通过用 NheI和BioI消化来自载体0717050pGA14(实施例Ia中描述的)释放编码乳酸乳球菌醛 糖-1-差向异构酶基因(L1MI )基因的DNA片段。通过电泳将所得线性化质粒P413-GPD、 P413-ADH和P413-TEF和编码LlMR的DNA片段在1 %低熔点琼脂糖凝胶上分开，并分离。将 线性化质粒P413-GPD与LlMR片段连接到一起，产生命名为LlMR_36a的质粒。同样地，将 线性化质粒P413-ADH与LlMR片段连接到一起，产生命名为LlMR_38a的质粒。最后，将线 性化质粒P413-TEF与LlMR片段连接到一起，产生命名为LlMR_40a的质粒。P413-GPD包含来自编码甘油醛_3_磷酸脱氢酶(也称作GAPDH)同工酶3的基因 TDH3的启动子；P413-ADH包含来自编码醇脱氢酶I的基因ADHl的启动子；而P413-TEF包 含来自编码翻译延伸因子EF-I α的基因TEF2的启动子。实施例3g_在来自酿酒酵母的GPD启动子和CYCl终止子控制下含有植物乳杆菌 L-阿拉伯糖异构酶基因(LpAraA)基因的酵母表达质粒的构建。用SpeI和BioI消化大肠杆菌/酿酒酵母高拷贝穿梭载体P似6_GPD (Mumberg等， 1995)，并用碱性磷酸酶将所得末端去磷酸化。类似地，通过用NheI和B10I消化来自实施 例2d中描述的载体释放编码植物乳杆菌L-阿拉伯糖异构酶基因(LpAraA)的DNA片段。通 过电泳将所得线性化质粒P^6-GPD和编码LpAraA的DNA片段在0. 7%低熔点琼脂糖凝胶 上分开，并分离。将两个DNA片段连接到一起并将所得质粒用于转化大肠杆菌T0P10。实施例3h_在来自酿酒酵母的ADH启动子和CYCl终止子控制下含有植物乳杆菌 L-核酮糖激酶基因(LpAraB)基因的酵母表达质粒的构建。用SpeI和BioI消化大肠杆菌/酿酒酵母高拷贝穿梭载体P425-ADH(Mumberg等， 1995)，并用碱性磷酸酶将所得末端去磷酸化。类似地，通过用NheI和B10I消化来自实施 例加中描述的载体释放编码植物乳杆菌L-核酮糖激酶基因(LpAraB)的DNA片段。通过 电泳将所得线性化质粒P425-ADH和编码LpAraB的DNA片段在0. 7%低熔点琼脂糖凝胶上 分开，并分离。将两个DNA片段连接到一起并将所得质粒用于转化大肠杆菌T0P10。实施例3i_在来自酿酒酵母的GPD启动子和CYCl终止子控制下含有植物乳杆菌 L-核酮糖-5-磷酸4-差向异构酶基因(LpAraD)基因的酵母表达质粒的构建。用SpeI和BioI消化大肠杆菌/酿酒酵母高拷贝穿梭载体P4M-GPD (Mumberg等.， 1995)，并用碱性磷酸酶将所得末端去磷酸化。类似地，通过用NheI和B10I消化来自实施 例2f中描述的载体释放编码植物乳杆菌L-核酮糖-5-磷酸4-差向异构酶基因(LpAraD) 的DNA片段。通过电泳将所得线性化质粒P4M-GPD和编码LpAraD的DNA片段在0. 7%低 熔点琼脂糖凝胶上分开，并分离。将两个DNA片段连接到一起并将所得质粒用于转化大肠 杆菌TOPlO。实施例3j_用于醛糖-1-差向异构酶过表达的在来自酿酒酵母的ADH启动子和 CYCl终止子控制下含有酿酒酵母双功能醛糖-1-差向异构酶/UDP半乳糖4-差向异构酶基 因(&GAL10)基因的酵母表达质粒的构建。
用SpeI和BioI消化大肠杆菌/酿酒酵母低拷贝穿梭载体P413-ADH(Mumberg等 (1995) Gene 156，p. 119-122)，并随后用碱性磷酸酶将所得末端去磷酸化。类似地，通过用 NheI和BioI消化自载体kGAL-a23a(实施例2g中描述的)释放编码酿酒酵母双功能醛 糖-1-差向异构酶/UDP半乳糖4-差向异构酶基因(&GAL10)的DNA片段。通过电泳将所 得线性化质粒P413-ADH和编码&GAL10的DNA片段在0. 7%低熔点琼脂糖凝胶上分开，并 在此后分离。将线性化质粒P413-ADH与&GAL10片段连接到一起，产生酵母表达质粒。实施例3k_用于醛糖-1-差向异构酶过表达的在来自酿酒酵母的ADH启动子和 CYCl终止子控制下含有酿酒酵母醛糖-1-差向异构酶/UDP-半乳糖4-差向异构酶基因之 变旋酶部分(&GAL10 Δ )基因的酵母表达质粒的构建。已知基因GALlO是一种双功能酶，含有催化UDP-半乳糖转变成UDP-葡萄糖的差 向异构酶部分以及催化α-半乳糖转变成β-半乳糖和反之亦然的变旋酶部分Majumdar 等，2004。用SpeI和BioI消化大肠杆菌/酿酒酵母低拷贝穿梭载体P413-ADH(Mumberg等 (1995) Gene 156，p. 119-122)，并随后用碱性磷酸酶将所得末端去磷酸化。类似地，通过用 NheI和BioI消化自载体&GAL Δ -a24a (实施例池中描述的)释放编码酿酒酵母双功能醛 糖-1-差向异构酶/UDP-半乳糖4-差向异构酶基因之变旋酶部分(&GAL10 Δ )的DNA片 段。通过电泳将所得线性化质粒P413-ADH和编码&GAL10 Δ的DNA片段在0. 7%低熔点琼 脂糖凝胶上分开，并在此后分离。将线性化质粒？41340!1与^^41^10八片段连接到一起， 产生酵母表达质粒。实施例4a_ 连同 LlMR-36a、LlMR-38a、LlMR_40a 或空 P413-CYC 质粒(Mumberg 等， 1995)任一含有PmXI-8a和I^sXKS-Ha质粒的酿酒酵母菌株的构建。将200ng每一种质粒组合并使用Biorad Gene Pulser II系统(Biorad，USA)依照 制造商的用法说明依靠电穿孔用于转化酿酒酵母酵母菌株BY4741 (Euroscarf，Germany)。 依照标准方案(Becker，D. Μ.和Guarente，1991)将酵母细胞制成感受态。在遗漏尿嘧啶、 组氨酸和亮氨酸且补充有2% D-葡萄糖的固体合成完全失落培养基(solid synthetic complete dropout media) (SC-Ura，His, Leu) (Rose 等，1990)上进行对经所有三种质粒转 化的克隆的选择。将中等大小的原代克隆在SC-Ura，His，LeU上再划线，并分离下述每一项 的一个菌落经质粒LlMR-36a、PmXI-8a和PsXKS_14a转化的菌株T0062 ；经质粒LlMR_38a、 PmXI-8a 和 PsXKS_14a 转化的菌株 T0063 ；经质粒 LlMR_40a、PmXI_8a 和 PsXKS_14a 转化的 菌株T0065 ；和最终经质粒P413-CYC、PmXI_8a和I^sXKS-Ha转化的菌株T0067 (这些质粒 在实施例3中有描述；P413-CYC是Mumberg等，1995中描述的空质粒)。实施例4b-通过酵母菌株T0062、T0063、T0065和T0067的生长曲线对D-木糖代 谢的测量。作为木糖代谢性酵母菌株的生长速率的变化来测量D-木糖代谢速率的变化。首 先使四种菌株适应D-木糖代谢。在遗漏尿嘧啶、组氨酸和亮氨酸且补充有2% D-木糖和 0.2% D-葡萄糖的液体合成完全失落培养基(SCX(+0. 2% D-glc)-Ura,His,Leu)中分别接 种每一种菌株。将培养物在以225RPM运行的摇床中于30°C温育1周。1周后，用遗漏尿嘧 啶、组氨酸和亮氨酸且补充有2% D-木糖和0. 02% D-葡萄糖的液体合成完全失落培养基 (SCX(+0. 02% D-glc)-Ura,His,Leu)将每一种培养物用于再接种新的培养物。将这些培养
32物如上所述再温育1周。通过以初始细胞滴度0D600 = 0. 006/ml接种补充有2% D-木糖 的SCX-Ura，His，Leu来启动生长实验。将这些培养物如上所述温育。对于四种菌株每一 种，间隔M小时四次采样等分试样，测量光密度0D600并确定生长曲线。使用初始延滞期 后M-96小时时间间隔确定倍增时间(即指数生长期期间每ml的微生物数目倍增所花去 的时间)。可以为四种菌株确定下面的生长数据
权利要求
1.能够以比转化前的等同微生物要更高的速率将戊醛糖转变成戊酮糖的经转化微生物。
2.依照权利要求1的微生物，其中所述微生物已经用引起微生物过表达醛糖-1-差向 异构酶的核苷酸序列转化。
3.依照权利要求1或权利要求2的微生物，其中所述微生物已经用编码醛糖-1-差向 异构酶的核苷酸序列转化。
4.依照权利要求1-3任一项的微生物，其中所述微生物是经转化酵母。
5.依照前述权利要求任一项的微生物，其中所述戊醛糖选自下组木糖，阿拉伯糖，核 糖和来苏糖。
6.依照前述权利要求任一项的微生物，其中所述戊酮糖是木酮糖。
7.包含依照权利要求1-6任一项的微生物的接种物。
8.包含依照权利要求1-6任一项的微生物的培养液。
9.用于制备能够生成戊糖衍生化合物的经转化微生物的方法，所述方法包括用编码醛 糖-ι-差向异构酶的核苷酸序列转化微生物的步骤，且其中所述经转化微生物能够将戊醛 糖转变成戊糖衍生化合物。
10.依照权利要求9的方法，其中所述编码醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列在编码它 的表达载体中。
11.用于生成戊糖衍生化合物的方法，其中所述方法包括在培养基中培养依照权利要 求1-8任一项的微生物或通过权利要求9或权利要求10的方法制备的微生物。
12.用于生成生物燃料的方法，其中所述方法包括在培养基中培养依照权利要求1-8 任一项的微生物或通过权利要求9或权利要求10的方法制备的微生物的步骤。
13.依照权利要求12的方法，其中所述方法进一步包括自培养液获得生物燃料的步马聚ο
14.通过依照权利要求12或权利要求13的方法获得的生物燃料。
15.依照权利要求1-8任一项的微生物或通过权利要求9或权利要求10的方法制备的 微生物用于生成戊糖衍生产物的用途。
16.依照权利要求1-8任一项的微生物或通过权利要求9或权利要求10的方法制备的 微生物用于生成生物燃料的用途。
17.能够在戊醛糖存在下实现比转化前的等同微生物要更高的生长速率的经转化微生物。
18.能够实现比转化前的等同微生物要更高的戊醛糖代谢的经转化微生物。
19.依照权利要求17或权利要求18的微生物，其中所述微生物已经用引起微生物过表 达醛糖-ι-差向异构酶的核苷酸序列转化。
20.依照权利要求17-19任一项的微生物，其中所述微生物已经用编码醛糖-1-差向异 构酶的核苷酸序列转化。
21.依照权利要求17-20任一项的微生物，其中所述微生物是经转化酵母。
22.依照权利要求17-20任一项的微生物，其中所述戊醛糖选自下组木糖，阿拉伯糖， 核糖和来苏糖。
23.依照前述权利要求任一项的微生物，其中所述戊酮糖是木酮糖。
24.包含依照权利要求17-23任一项的微生物的接种物。
25.包含依照权利要求17- 任一项的微生物的培养液。
26.用于制备能够以比转化前的等同微生物要更高的速率将戊醛糖转变成戊酮糖的经 转化微生物的方法，所述方法包括用编码醛糖-ι-差向异构酶的核苷酸序列转化微生物的 步骤，其中所述经转化微生物能够将戊醛糖转变成戊酮糖。
27.用于制备能够在戊醛糖存在下实现比转化前的等同微生物要更高的生长速率的经 转化微生物的方法，所述方法包括用编码醛糖-ι-差向异构酶的核苷酸序列转化微生物的 步骤，其中所述经转化微生物能够将戊醛糖转变成戊酮糖。
28.用于制备能够实现比转化前的等同微生物要更高的戊醛糖代谢的经转化微生物的 方法，所述方法包括用编码醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列转化微生物的步骤，其中所 述经转化微生物能够将戊醛糖转变成戊酮糖。
29.依照权利要求沈-观任一项的方法，其中所述微生物已经用引起微生物过表达醛 糖-ι-差向异构酶的核苷酸序列转化。
30.依照权利要求沈-四任一项的方法，其中所述微生物已经用编码醛糖-1-差向异构 酶的核苷酸序列转化。
31.依照权利要求沈-30任一项的方法，其中所述微生物是经转化酵母。
32.依照权利要求沈-31任一项的方法，其中所述戊醛糖选自下组木糖，阿拉伯糖，核 糖和来苏糖。
33.依照权利要求沈-32任一项的方法，其中所述戊酮糖是木酮糖。
34.基本上如本文所述的经转化微生物。
35.基本上如本文所述的接种物。
36.基本上如本文所述的培养液。
37.基本上如本文所述的生物燃料。
38.基本上如本文所述的用于制备经转化微生物的方法。
39.基本上如本文所述的用于生成戊糖衍生化合物的方法。
40.基本上如本文所述的用于生成生物燃料的方法。
全文摘要
能够以比转化前的等同微生物要更高的速率将戊醛糖转变成戊酮糖的经转化微生物。
文档编号C12R1/865GK102144029SQ200980134462
公开日2011年8月3日 申请日期2009年7月3日 优先权日2008年7月4日
发明者伯吉特.龙诺, 奥利.西贝森, 托马斯.H.安德森 申请人:特拉诺尔股份公司