专利名称：用于生物酶固定化的环氧基介孔分子筛及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于生物酶固定化的环氧基介孔分子筛及其制备方法，具体地说，通过用间氯过氧苯甲酸对含有乙烯基的立方相Ia3d结构的介孔分子筛和表面乙烯基 功能化的介孔分子筛的环氧化，在介孔分子筛表面引入链长较短的环氧基官能团，然后使 生物酶以共价结合方式固定在介孔分子筛表面，提高固定化酶的性能。
背景技术：
将游离酶直接用于催化过程存在许多不足，如在高温、强酸、强碱和有机溶剂中不 稳定，容易丧失催化活性；游离酶回收困难，经济上不合理，还造成产物难以分离提纯，严重 影响产品质量；生产过程难以实现连续操作，只能一次性间歇操作等。固定化酶克服了游 离酶的上述不足，不仅保持了游离酶特有的催化特性，还提高了操作稳定性，生产过程易于 实现连续操作，反应完成后易于与产物分离且可以重复使用，所得的产品纯度高，生产成本 低。因此，酶的固定化一直是催化化学、生物化学和材料化学等领域的研究热点。固定化酶的常用制备方法可以分为四种包埋法、交联法、吸附法和共价结合法。 包埋法分为网格型和微囊型两类，可获得较高的酶活力回收，但必须巧妙设计反应条件，制 得的固定化酶不适用于大分子底物，一般用于制备固定化细胞。交联法是指先将酶吸附于 不溶性载体上，然后使用双官能团或多功能团交联剂使酶分子之间进行交联，形成网状结 构，可得到酶蛋白单位浓度较高的固定化酶，但存在着反应条件剧烈、酶活损失等不足。吸 附法包括物理吸附和离子吸附法，具有酶活性中心不易被破坏和酶高级结构变化较少等优 点，但由于酶与载体之间是以离子键、范德华力和氢键等较弱的作用力相连接，酶容易流 失。共价结合法是借助共价键将酶的活性非必需侧链基团和载体的功能性基团进行偶联制 备固定化酶的方法，因酶与载体之间以共价键相结合，呈现良好的操作稳定性，是目前工业 上广泛使用的酶固定化方法。由上述固定化酶的制备方法可知，要想得到性能优异的固定化酶，载体必须满足 以下要求载体表面具有可与酶分子发生相互作用的功能性基团，或可以通过表面改性进 行功能化；载体表面的功能性基团数量及其分布适当，而且容易接近；载体必须是多孔物 质，具有较高的比表面积；载体具有较大的孔径，以降低酶催化反应过程中存在的扩散阻 力；载体具有足够的机械强度和化学稳定性。生物酶固定化载体可分为两类无机载体和有机载体。与广泛使用的有机载体相 比较，无机载体具有更高的机械强度和较好的化学稳定性，其结构和表面性质容易控制，其 突出优势是负载的酶经焙烧等简单处理就可以除去，载体可以重复使用，这就大大降低了 固定化酶的成本，也避免了已失活的固定化酶的后处理问题，减轻了对环境的压力。新型介 孔分子筛具有较大连续可调的孔径、高的比表面积、较大的吸附容量和孔道内富含弱酸性 羟基，可以使体积较大的酶分子固定于分子筛介孔中和反应产物及时扩散出孔道，保持固 定化酶适宜的微环境，因而制得的固定化酶具有较高的催化活性，同时固定化酶的使用温 度较低，可以避免介孔分子筛普遍存在的水热稳定性差的问题，因此，介孔分子筛是一类很有发展前途的酶固定化新型无机载体。固定化酶的性能与介孔分子筛的结构(晶型、孔径、孔容和比表面积)密切相关。 介孔分子筛的孔径是影响固定化酶活性的关键因素，当介孔分子筛的孔径大于生物酶的分 子尺寸时，在酶的固定化过程中，酶分子就容易进入介孔分子筛孔道内与表面的功能性基 团相结合，充分利用介孔分子筛的孔容，得到的固定化酶具有较高活性。介孔分子筛的晶 型、孔容和比表面积对固定化酶活性都有较大影响。由于生物酶分子与介孔分子筛表面弱 酸性羟基之间通常是以较弱的氢键作用力相结合，在使用过程中一部分酶会发生脱落，操 作稳定性有待进一步提高，如何在基本保持固定化酶活性的前提下，提高固定化酶的操作 稳定性，仍需要做进一步的研究。固定化青霉素酰化酶(EC 3.5. 1. 11，酶分子尺寸70AX50AX55A)是半合成 β -内酰胺类抗生素生产中最关键的酶，它既能催化青霉素及其扩环酸水解去侧链，生产半 合成β-内酰胺类抗生素的重要中间体6-氨基青霉烷酸(6-ΑΡΑ)和7-氨基-3-脱乙酰氧 基头孢烷酸(7-ADCA)，又能催化6-ΑΡΑ和7-ADCA与侧链缩合，生产多种半合成β -内酰胺 类抗生素(如 Ampicillin, Amoxicillin, Cephalexin 禾口 Cefadroxil 等)。我国人口众多，对半合成内酰胺类抗生素的需求很大，用固定化青霉素酰化 酶工艺生产半合成青霉素是一条低成本的绿色生产工艺，已被列为我国今后生物医药发展 的六大重点方向之一。由于基因工程的迅猛发展，重组青霉素酰化酶已能高效表达和大量 生产，中科院上海生命科学院用DNA操作技术获得了高产的青霉素酰化酶基因工程菌株， 大大降低了游离酶的生产成本。但我国目前工业上所用载体全部依赖进口，固定化酶的生 产成本还太高。因此，性能优异的固定化载体的合成技术已成为我国青霉素酰化酶固定化 技术发展的技术瓶颈，发展具有我国自主知识产权的固定化载体合成路线，从根本上摆脱 我国长期依赖进口载体生产固定化酶的被动局面，开发有自主知识产权的半合成内酰 胺类抗生素酶法工艺，以满足日益增长的国内需求和增强产品的国际竞争力，从而为我国 固定化酶技术的进步和抗生素产业的可持续发展做出积极贡献。中国专利CN1320688A公开了一种用于青霉素酰化酶固定化的介孔材料。该介孔 材料的最大孔径为3. 3nm,固定化酶的最高酶活为511U/g，但由于该介孔材料的孔径比青 霉素酰化酶的分子尺寸小得多，而且通过利用载体表面的弱酸性羟基与酶分子之间的较弱 氢键作用力实现酶的固定化，因此，得到的固定化酶性能较差。中国专利CN1935994A公开了一种有机基团功能化介孔分子筛酶固定化载体及其 制备方法。通过用3-含氧缩水甘油基丙基三甲氧基硅烷或Y-氨丙基三乙氧基硅烷和戊 二醛对介孔分子筛表面的功能化修饰，引入环氧基或醛基等有机官能团(占载体总质量的 2 9% )，然后在温和条件下以共价结合方式固定生物酶分子，获得的固定化青霉素酰化 酶具有高的催化活性和使用稳定性，固定化酶的表观活性为1000 2000IU/g，重复使用10 次后，固定化酶保留90%以上的初始表观活性。但由于上述两种方法引入的有机官能团的 链长比较长，经过表面功能化后，介孔分子筛的孔径、比表面积及孔容均明显变小，大大降 低了固定化酶的活性。 中国专利CN1580233A公开了一种用于酶固定化的介孔反应器及其制备方法。这 种介孔反应器通过介孔材料表面的羟基基团与酶分子羧基氧原子相互作用，将酶分子固定 在介孔材料孔道内，再利用接枝技术将硅烷偶联剂接枝在介孔材料的孔口处，最后利用聚合硅烷偶联剂末端的双键聚合，在孔口处形成网状结构。通过这种方法制备的介孔反应器可以有效地将载体的孔口缩小，在抑制酶分子流失的同时还不会对底物和产物造成传质阻 力，因而得到具有高催化活性和高操作稳定性的固定化酶。介孔材料选用SBA-15、MCM-41、 MCM-48和FSM中的一种，酶选用猪胰脂肪酶、辣根过氧化物酶、球蛋白酶、胰岛素中的一种。 但该方法在制备固定化酶过程中使用了大量有机溶剂，容易使游离酶丧失催化活性。
发明内容
本发明目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种可提高固定化酶 的活性和操作稳定性的用于生物酶固定化的环氧基介孔分子筛的制备方法。本发明的目的可以通过以下技术方案来实现一种用于生物酶固定化的环氧基介孔分子筛的制备方法，其特征在于，该方法是 用间氯过氧苯甲酸对含有乙烯基的立方相Ia3d结构的介孔分子筛和表面乙烯基功能化的 介孔分子筛的环氧化，在介孔分子筛表面引入链长较短的环氧基官能团。所述的方法具体包括如下步骤将乙烯基介孔分子筛加入到间氯过氧苯甲酸 (m-CPBA)的二氯甲烷溶液中，在30 50°C持续搅拌回流48 96小时后，过滤，将滤饼用 二氯甲烷充分洗涤三次，所得固体粉末在50 100°C真空干燥12 24小时，即得到环氧基 介孔分子筛。所述的间氯过氧苯甲酸和乙烯基介孔分子筛的质量比为1 3 1，所述的二氯甲 烷的体积和乙烯基介孔分子筛的质量比为50 150 1。所述的环氧基介孔分子筛可用于青霉素酰化酶、葡萄糖异构酶、葡萄糖转苷酶、胰 蛋白酶和淀粉酶等水溶性生物酶的固定化，特别适用于青霉素酰化酶的固定化。用于生物酶固定化的环氧基介孔分子筛的制备方法，由乙烯基介孔分子筛的合成 和表面环氧基功能化2个过程组成，其中乙烯基介孔分子筛的合成包括如下步骤直接共聚法合成在室温条件下，将5. 68g Pluronic P123 (EO20PO70EO20, Mav = 5800)和11. 36g Na2SO4溶于160mL 1. Omo 1/L的HCl溶液中；待完全溶解之后，将溶液升温 至35°C并持续搅拌数小时，缓慢滴加53. 2mmol的不同组成的正硅酸乙酯(TEOS)和乙烯基 三乙氧基硅烷(TEVS)的混合物，并在35°C条件下持续搅拌20小时，其中TEVS的摩尔百分 比为5 20%;将溶液转入带有聚四氟乙烯内衬的水热晶化釜中，并置于100°C的烘箱中晶 化24小时，然后将溶液冷却至室温后过滤得到的固体，在100°C烘箱中干燥过夜；将l.Og 未除模板剂的介孔分子筛置于圆底烧瓶中，加入50ml浓度为60%的硫酸，加热到95°C并持 续搅拌24小时；过滤并用去离子水洗涤至中性，将滤饼回收后加入50mi无水乙醇，在室温 条件下持续搅拌12小时后过滤，重复三次，然后在50°C真空烘箱中干燥24小时，得到含有 乙烯基的立方相Ia3d结构的介孔分子筛。后嫁接法合成在室温下将2. Og Pluronic P123 (EO20PO70EO20, Mav = 5800)溶于 75mLl. 6mol/L的HCl溶液中；待P123完全溶解后加入0. 023g氟化铵和1. 5 3. 5g 1,3, 5_三甲苯，然后将溶液升温至35°C并持续搅拌45min后，加入4. 4g正硅酸乙酯，并在35°C 下持续搅拌20小时；将溶液转入带有聚四氟乙烯内衬的水热晶化釜中，于100°C水热晶化 24小时；待溶液冷却至室温后过滤得到白色固体，在100°C的烘箱中干燥过夜，然后在马弗 炉中程序升温至500°C焙烧4小时得到介孔分子筛；将介孔分子筛和乙烯基三乙氧基硅烷加入到甲苯溶液中，在100 120°C加热回流5 15小时，其中乙烯基三乙氧基硅烷和介孔 分子筛的质量比为0.5 1.5 1，甲苯的体积和介孔分子筛的质量比为20 70 1;将 介孔分子筛过滤、用乙醇洗涤三次后，在50°C真空烘箱中干燥24小时，得到表面乙烯基功 能化的介孔分子筛。用上述方法制备的环氧基介孔分子筛，可用于青霉素酰化酶、葡萄糖异构酶、葡萄 糖转苷酶、胰蛋白酶和淀粉酶等水溶性生物酶的固定化，特别适用于青霉素酰化酶的固定 化。
与现有技术相比，本发明所述的环氧基介孔分子筛的制备方法的显著优点在于， 用间氯过氧苯甲酸对含有乙烯基的立方相Ia3d结构的介孔分子筛和表面乙烯基功能化的 介孔分子筛的环氧化，在介孔分子筛表面引入链长较短的环氧基官能团，尽量减少表面功 能化过程对于介孔分子筛的孔径、比表面积和孔容的影响，不需要进一步活化就可以直接 使生物酶以共价结合方式固定在介孔分子筛表面，提高固定化酶的性能。本发明所述的环氧基介孔分子筛的显著优点之一在于，该环氧基介孔分子筛的孔 径比青霉素酰化酶的分子尺寸大得多，有利于更多的酶分子进入介孔分子筛孔道内被固定 化，提高固定化酶的活性。本发明所述的环氧基介孔分子筛的显著优点之二在于，该环氧基介孔分子筛通过 表面的环氧基与酶分子中氨基之间形成的共价键来实现酶的固定化，提高固定化酶的操作 稳定性。
图1为用乙烯基三甲氧基硅烷和m-CPBA对介孔分子筛表面的环氧基功能化及酶 的固定化示意图；图2为用m-CPBA对含有乙烯基的介孔分子筛表面的环氧基功能化及酶的固定化 示意图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。在以下实施例中，采用以下方法对进行青霉素酰化酶的固定化，以及测定固定化 酶的活性和操作稳定性青霉素酰化酶的固定化称取0. 05g载体与6. OmL经pH = 7. 8的磷酸盐缓冲溶液 稀释的青霉素酰化酶溶液(VbuffCT/Venzyme = 4 1)混合，放入30°C的水浴摇床中固定化24 小时后进行离心分离，所得固体用pH = 7. 8的磷酸盐缓冲溶液多次洗涤后进行活性测定。固定化酶的活性测定(青霉素G钾盐水解制备6-APA)在37°C的温度下，将上述 固定化酶与50mL 4衬％的青霉素G钾盐水溶液(用0. Imol/LpH = 7.8磷酸盐缓冲溶液稀 释)均勻混合，然后用浓度为0. lmol/L的NaOH溶液滴定，使混合溶液的pH值保持在7. 8， 记录10分钟内NaOH的消耗量。然后用以下公式来计算固定化酶的活性A(IU/g) = VNaOHXCNaOHX103/(mXt)其中A代表固定化酶的活性;VNa0H代表NaOH消耗量(ml) ；Cn30h代表NaOH浓度 (mol/L) ；m代表载体干重(g) ；t代表测试所用时间(min)。
固定化酶的操作稳定性测定将已使用过的固定化酶溶液进行离心分离，然后将 固定化酶转移到反应器中，采用上述活性测定方法测定使用过的固定化酶的活性。经过10 次循环使用后，固定化酶的活性与初始活性的百分比越高，则说明固定化酶的操作稳定性 越好。实施例1 用乙烯基三甲氧基硅烷和m-CPBA对介孔分子筛表面的环氧基功能化及酶的固定 化示意图如图1所示，在室温条件下，将5. 68g Pluronic P123 (EO20PO70EO20,Mav = 5800)和 11. 36gNa2S04溶于160mL 1. Omol/L的HCl溶液中；待完全溶解之后，将溶液升温至35°C并 持续搅拌数小时，缓慢滴加53. 2mmol的正硅酸乙酯(TEOS)和乙烯基三乙氧基硅烷(TEVS) 的混合物(TEVS的摩尔百分比为5% )，并在35°C条件下持续搅拌20小时；将溶液转入带 有聚四氟乙烯内衬的水热晶化釜中，并置于100°C的烘箱中晶化24小时，然后将溶液冷却 至室温后过滤得到的固体，在100°C烘箱中干燥过夜；将l.Og未除模板剂的介孔分子筛置 于圆底烧瓶中，加入50ml浓度为60%的硫酸，加热到95°C并持续搅拌24小时；过滤并用去 离子水洗涤至中性，将滤饼回收后加入50ml无水乙醇，在室温条件下持续搅拌12小时后过 滤，重复三次，然后在50°C真空烘箱中干燥24小时，得到含有乙烯基的立方相Ia3d结构的 介孔分子筛。将0. 5g上述乙烯基介孔分子筛，加入到50mL间氯过氧苯甲酸的二氯甲烷溶液中 (浓度为1. 0g/50mL)，在35°C持续搅拌回流72小时后，过滤，将滤饼用二氯甲烷充分洗涤三 次，所得固体粉末在50°C真空干燥24小时，即得到环氧基介孔分子筛。将上述环氧基介孔 分子筛用于青霉素酰化酶的固定化，得到的固定化酶活性为3611U/g，经过10次循环使用 后，固定化酶保留了 77%的初始活性。实施例2将实施例1中TEVS的摩尔百分比由5%改为10%，其他条件与实施例1相同，得 到环氧基介孔分子筛，用于青霉素酰化酶的固定化，得到的固定化酶活性为2262U/g，经过 10次循环使用后，固定化酶保留了 80%的初始活性。实施例3将实施例1中TEVS的摩尔百分比由5%改为15%，其他条件与实施例1相同，得 到环氧基介孔分子筛，用于青霉素酰化酶的固定化，得到的固定化酶活性为1563U/g，经过 10次循环使用后，固定化酶保留了 66%的初始活性。实施例4将实施例1中TEVS的摩尔百分比由5%改为20%，其他条件与实施例1相同，得 到环氧基介孔分子筛，用于青霉素酰化酶的固定化，得到的固定化酶活性为1308U/g，经过 10次循环使用后，固定化酶保留了 64%的初始活性。实施例5在室温下将2. Og Pluronic P123 (EO2ciPO7ciEO2ci，Mav = 5800)溶于 75mL 1.6mol/L 的 HCl溶液中；待P123完全溶解后加入0.023g氟化铵和1.5g 1，3，5-三甲苯，然后将溶液升 温至35°C并持续搅拌45min后，加入4. 4g正硅酸乙酯，并在35°C下持续搅拌20小时；将溶 液转入带有聚四氟乙烯内衬的水热晶化釜中，于100°C水热晶化24小时；待溶液冷却至室 温后过滤得到白色固体，在100°C的烘箱中干燥过夜，然后在马弗炉中程序升温至500°C焙烧4小时得到介孔分子筛；将1. Og介孔分子筛和1. 08g乙烯基三乙氧基硅烷加入到55mL甲苯溶液中，在110°C加热回流10小时；将介孔分子筛过滤、用乙醇洗涤三次后，在50°C真 空烘箱中干燥24小时，得到表面乙烯基功能化的介孔分子筛。用m-CPBA对含有乙烯基的介孔分子筛表面的环氧基功能化及酶的固定化示意图 如图2所示，将0. 5g上述乙烯基介孔分子筛，加入到50mL间氯过氧苯甲酸的二氯甲烷溶液 中(浓度为1.0g/50mL)，在35°C持续搅拌回流75小时后，过滤，将滤饼用二氯甲烷充分洗 涤三次，所得固体粉末在50°C真空干燥24小时，即得到环氧基介孔分子筛。将上述环氧基 介孔分子筛用于青霉素酰化酶的固定化，得到的固定化酶活性为8383U/g，经过10次循环 使用后，固定化酶保留了 69%的初始活性。实施例6将实施例5中1，3，5-三甲苯的质量由1.5g改为2. 5g，其他条件与实施例1相同， 得到环氧基介孔分子筛，用于青霉素酰化酶的固定化，得到的固定化酶活性为8416U/g，经 过10次循环使用后，固定化酶保留了 90%的初始活性。实施例7将实施例5中1，3，5-三甲苯的质量由1.5g改为3. 5g，其他条件与实施例1相同， 得到环氧基介孔分子筛，用于青霉素酰化酶的固定化，得到的固定化酶活性为8016U/g，经 过10次循环使用后，固定化酶保留了 84%的初始活性。实施例8乙烯基介孔分子筛的制备方法同实施例5，将0. 5g上述乙烯基介孔分子筛，加入 到25mL间氯过氧苯甲酸的二氯甲烷溶液中(浓度为1. 0g/50mL)，在30°C持续搅拌回流96 小时后，过滤，将滤饼用二氯甲烷充分洗涤三次，所得固体粉末在50°C真空干燥24小时，即 得到环氧基介孔分子筛。将上述环氧基介孔分子筛用于青霉素酰化酶的固定化，得到的固 定化酶活性为8543U/g，经过10次循环使用后，固定化酶保留了 66%的初始活性。实施例9乙烯基介孔分子筛的制备方法同实施例5，将0. 5g上述乙烯基介孔分子筛，加入 到75mL间氯过氧苯甲酸的二氯甲烷溶液中(浓度为1. 0g/50mL)，在40°C持续搅拌回流72 小时后，过滤，将滤饼用二氯甲烷充分洗涤三次，所得固体粉末在100°C真空干燥12小时， 即得到环氧基介孔分子筛。将上述环氧基介孔分子筛用于青霉素酰化酶的固定化，得到的 固定化酶活性为8026U/g，经过10次循环使用后，固定化酶保留了 80%的初始活性。
权利要求
一种用于生物酶固定化的环氧基介孔分子筛的制备方法，其特征在于，该方法是用间氯过氧苯甲酸对含有乙烯基的立方相Ia3d结构的介孔分子筛和表面乙烯基功能化的介孔分子筛的环氧化，在介孔分子筛表面引入链长较短的环氧基官能团。
2.根据权利要求1所述的用于生物酶固定化的环氧基介孔分子筛的制备方法，其特征 在于，所述的方法具体包括如下步骤将乙烯基介孔分子筛加入到间氯过氧苯甲酸的二氯 甲烷溶液中，在30 50°C持续搅拌回流48 96小时后，过滤，将滤饼用二氯甲烷充分洗涤 三次，所得固体粉末在50 100°C真空干燥12 24小时，即得到环氧基介孔分子筛。
3.根据权利要求2所述的用于生物酶固定化的环氧基介孔分子筛的制备方法，其特征 在于，所述的间氯过氧苯甲酸和乙烯基介孔分子筛的质量比为1 3 1，所述的二氯甲烷 的体积和乙烯基介孔分子筛的质量比为50 150 1。
4.根据权利要求1所述的用于生物酶固定化的环氧基介孔分子筛的制备方法，其特征 在于，所述的环氧基介孔分子筛可用于青霉素酰化酶、葡萄糖异构酶、葡萄糖转苷酶、胰蛋 白酶和淀粉酶等水溶性生物酶的固定化，特别适用于青霉素酰化酶的固定化。
全文摘要
本发明公开了用于生物酶固定化的环氧基介孔分子筛及其制备方法。本发明用间氯过氧苯甲酸对含有乙烯基的立方相Ia3d结构的介孔分子筛和表面乙烯基功能化的介孔分子筛的环氧化，在介孔分子筛表面引入链长较短的环氧基官能团，尽量减少表面功能化过程对于介孔分子筛的孔径、比表面积和孔容的影响，不需要进一步活化就可以直接使生物酶以共价结合方式固定在介孔分子筛表面，提高固定化酶的性能。将上述环氧基介孔分子筛可用于青霉素酰化酶、葡萄糖异构酶、葡萄糖转苷酶、胰蛋白酶和淀粉酶等水溶性生物酶的固定化，特别适用于青霉素酰化酶的固定化，得到的固定化酶活性为8416U/g，经过10次循环使用后，固定化酶保留了90％的初始活性。
文档编号C12N11/14GK101864410SQ20101014822
公开日2010年10月20日 申请日期2010年4月16日 优先权日2010年4月16日
发明者卢冠忠, 杨波, 王筠松, 王通海, 詹望成, 郭杨龙, 郭耘, 陈栋, 高振源 申请人:华东理工大学