专利名称：用于生物酶固定化的醛基介孔分子筛及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于生物酶固定化的醛基介孔分子筛及其制备方法，具体地说， 用6°Co-Y射线预辐照接枝丙烯醛技术或醛丙基三甲氧基硅烷对介孔分子筛表面的功 能化修饰，在介孔分子筛表面引入链长较短的醛丙基官能团(-CH2-CH2-cho)，然后使生物酶 以共价结合方式固定在介孔分子筛表面，提高固定化酶的性能。
背景技术：
将游离酶直接用于催化过程存在许多不足，如在高温、强酸、强碱和有机溶剂中不 稳定，容易丧失催化活性；游离酶回收困难，经济上不合理，还造成产物难以分离提纯，严重 影响产品质量；生产过程难以实现连续操作，只能一次性间歇操作等。固定化酶克服了游 离酶的上述不足，不仅保持了游离酶特有的催化特性，还提高了操作稳定性，生产过程易于 实现连续操作，反应完成后易于与产物分离且可以重复使用，所得的产品纯度高，生产成本 低。因此，酶的固定化一直是催化化学、生物化学和材料化学等领域的研究热点。固定化酶的常用制备方法可以分为四种包埋法、交联法、吸附法和共价结合法。 包埋法分为网格型和微囊型两类，可获得较高的酶活力回收，但必须巧妙设计反应条件，制 得的固定化酶不适用于大分子底物，一般用于制备固定化细胞。交联法是指先将酶吸附于 不溶性载体上，然后使用双官能团或多功能团交联剂使酶分子之间进行交联，形成网状结 构，可得到酶蛋白单位浓度较高的固定化酶，但存在着反应条件剧烈、酶活损失等不足。吸 附法包括物理吸附和离子吸附法，具有酶活性中心不易被破坏和酶高级结构变化较少等优 点，但由于酶与载体之间是以离子键、范德华力和氢键等较弱的作用力相连接，酶容易流 失。共价结合法是借助共价键将酶的活性非必需侧链基团和载体的功能性基团进行偶联制 备固定化酶的方法，因酶与载体之间以共价键相结合，呈现良好的操作稳定性，是目前工业 上广泛使用的酶固定化方法。由上述固定化酶的制备方法可知，要想得到性能优异的固定化酶，载体必须满足 以下要求载体表面具有可与酶分子发生相互作用的功能性基团，或可以通过表面改性进 行功能化；载体表面的功能性基团数量及其分布适当，而且容易接近；载体必须是多孔物 质，具有较高的比表面积；载体具有较大的孔径，以降低酶催化反应过程中存在的扩散阻 力；载体具有足够的机械强度和化学稳定性。生物酶固定化载体可分为两类无机载体和有机载体。与广泛使用的有机载体相 比较，无机载体具有更高的机械强度和较好的化学稳定性，其结构和表面性质容易控制，其 突出优势是负载的酶经焙烧等简单处理就可以除去，载体可以重复使用，这就大大降低了 固定化酶的成本，也避免了已失活的固定化酶的后处理问题，减轻了对环境的压力。新型介 孔分子筛具有较大连续可调的孔径、高的比表面积、较大的吸附容量和孔道内富含弱酸性 羟基，可以使体积较大的酶分子固定于分子筛介孔中和反应产物及时扩散出孔道，保持固 定化酶适宜的微环境，因而制得的固定化酶具有较高的催化活性，同时固定化酶的使用温 度较低，可以避免介孔分子筛普遍存在的水热稳定性差的问题，因此，介孔分子筛是一类很有发展前途的酶固定化新型无机载体。固定化酶的性能与介孔分子筛的结构(晶型、孔径、孔容和比表面积)密切相关。 介孔分子筛的孔径是影响固定化酶活性的关键因素，当介孔分子筛的孔径大于生物酶的分 子尺寸时，在酶的固定化过程中，酶分子就容易进入介孔分子筛孔道内与表面的功能性基 团相结合，充分利用介孔分子筛的孔容，得到的固定化酶具有较高活性。介孔分子筛的晶 型、孔容和比表面积对固定化酶活性都有较大影响。由于生物酶分子与介孔分子筛表面弱 酸性羟基之间通常是以较弱的氢键作用力相结合，在使用过程中一部分酶会发生脱落，操 作稳定性有待进一步提高，如何在基本保持固定化酶活性的前提下，提高固定化酶的操作 稳定性，仍需要做进一步的研究。固定化青霉素酰化酶(EC 3.5. 1. 11，酶分子尺寸70ax50ax55a )是半合成
3 _内酰胺类抗生素生产中最关键的酶，它既能催化青霉素及其扩环酸水解去侧链，生产半 合成内酰胺类抗生素的重要中间体6-氨基青霉烷酸(6-APA)和7-氨基-3-脱乙酰氧 基头孢烷酸(7-ADCA)，又能催化6-APA和7-ADCA与侧链缩合，生产多种半合成0 -内酰胺 类抗生素(如 Ampicillin, Amoxicillin, Cephalexin 禾口 Cefadroxil 等)。我国人口众多，对半合成内酰胺类抗生素的需求很大，用固定化青霉素酰化 酶工艺生产半合成青霉素是一条低成本的绿色生产工艺，已被列为我国今后生物医药发展 的六大重点方向之一。由于基因工程的迅猛发展，重组青霉素酰化酶已能高效表达和大量 生产，中科院上海生命科学院用DNA操作技术获得了高产的青霉素酰化酶基因工程菌株， 大大降低了游离酶的生产成本。但我国目前工业上所用载体全部依赖进口，固定化酶的生 产成本还太高。因此，性能优异的固定化载体的合成技术已成为我国青霉素酰化酶固定化 技术发展的技术瓶颈，发展具有我国自主知识产权的固定化载体合成路线，从根本上摆脱 我国长期依赖进口载体生产固定化酶的被动局面，开发有自主知识产权的半合成内酰 胺类抗生素酶法工艺，以满足日益增长的国内需求和增强产品的国际竞争力，从而为我国 固定化酶技术的进步和抗生素产业的可持续发展做出积极贡献。中国专利CN1320688A公开了一种用于青霉素酰化酶固定化的介孔材料。该介孔 材料的最大孔径为3. 3nm,固定化酶的最高酶活为511U/g，但由于该介孔材料的孔径比青 霉素酰化酶的分子尺寸小得多，而且通过利用载体表面的弱酸性羟基与酶分子之间的较弱 氢键作用力实现酶的固定化，因此，得到的固定化酶性能较差。中国专利CN1935994A公开了一种有机基团功能化介孔分子筛酶固定化载体及其 制备方法。通过用3-含氧缩水甘油基丙基三甲氧基硅烷或氨丙基三乙氧基硅烷和戊 二醛对介孔分子筛表面的功能化修饰，引入环氧基或醛基等有机官能团(占载体总质量的 2 9% )，然后在温和条件下以共价结合方式固定生物酶分子，获得的固定化青霉素酰化 酶具有高的催化活性和使用稳定性，固定化酶的表观活性为1000 2000IU/g，重复使用10 次后，固定化酶保留90%以上的初始表观活性。但由于上述两种方法引入的有机官能团的 链长比较长，经过表面功能化后，介孔分子筛的孔径、比表面积及孔容均明显变小，大大降 低了固定化酶的活性。中国专利CN1580233A公开了一种用于酶固定化的介孔反应器及其制备方法。这 种介孔反应器通过介孔材料表面的羟基基团与酶分子羧基氧原子相互作用，将酶分子固定 在介孔材料孔道内，再利用接枝技术将硅烷偶联剂接枝在介孔材料的孔口处，最后利用聚合硅烷偶联剂末端的双键聚合，在孔口处形成网状结构。通过这种方法制备的介孔反应器 可以有效地将载体的孔口缩小，在抑制酶分子流失的同时还不会对底物和产物造成传质阻 力，因而得到具有高催化活性和高操作稳定性的固定化酶。介孔材料选用SBA-15、MCM-41、 MCM-48和FSM中的一种，酶选用猪胰脂肪酶、辣根过氧化物酶、球蛋白酶、胰岛素中的一种。 但该方法在制备固定化酶过程中使用了大量有机溶剂，容易使游离酶丧失催化活性。
发明内容
本发明目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种可提高固定化酶 的活性和操作稳定性的用于生物酶固定化的醛基介孔分子筛的制备方法。本发明的目的可以通过以下技术方案来实现一种用于生物酶固定化的醛基介孔 分子筛的制备方法，其特征在于，该方法是用6°Co-Y射线预辐照接枝丙烯醛技术或醛 丙基三甲氧基硅烷对介孔分子筛表面的功能化修饰，在介孔分子筛表面引入链长较短的醛 丙基官能团(-ch2-ch2-cho)。所述的6°Co- y射线预辐照接枝丙烯醛技术是将介孔分子筛置于6°Co- y射线中预 辐照，辐照剂量为24 120kGy，样品经预辐照后转移至体积百分含量为10 90%的丙烯 醛水溶液中，在30 80°C水浴中反应10 30小时，然后将介孔分子筛过滤后，在索氏提取 器中用乙醇抽提除去丙烯醛聚合物，再在50 100°C真空烘箱中干燥12 24小时得到醛 基介孔分子筛。所述的丙烯醛水溶液的体积和介孔分子筛的质量比为50 200 1。所述的醛丙基三甲氧基硅烷对介孔分子筛表面的功能化修饰是将介孔分子 筛和醛丙基三甲氧基硅烷加入甲苯溶液中，在100 120°C加热回流5 15小时，然 后将介孔分子筛过滤后，在索氏提取器中用乙醇抽提除去未反应的醛丙基三甲氧基硅 烷，再在50 100°C真空烘箱中干燥12 24小时得到醛基介孔分子筛。所述的醛丙基三甲氧基硅烷和介孔分子筛的质量比为0.3 2 1，所述的甲 苯的体积和介孔分子筛的质量比为20 100 1。所述的醛基介孔分子筛可用于青霉素酰化酶、葡萄糖异构酶、葡萄糖转苷酶、胰蛋 白酶和淀粉酶等水溶性生物酶的固定化，特别适用于青霉素酰化酶的固定化。用上述方法制备的醛基介孔分子筛的平均孔径为10 35nm，比表面积为300 600m2/g,孔容在1. 0 2. 5cm7g之间，醛丙基官能团占介孔分子筛总质量的9. 0 15. 0%， 可用于青霉素酰化酶、葡萄糖异构酶、葡萄糖转苷酶、胰蛋白酶和淀粉酶等水溶性生物酶的 固定化，特别适用于青霉素酰化酶的固定化。与现有技术相比，本发明所述的醛基介孔分子筛的制备方法的显著优点在于，通 过用6°Co-Y射线预辐照接枝丙烯醛技术或醛丙基三甲氧基硅烷对介孔分子筛表面的 功能化修饰，在介孔分子筛表面引入链长较短的醛丙基官能团，尽量减少表面功能化过程 对于介孔分子筛的孔径、比表面积和孔容的影响，不需要进一步活化就可以直接使生物酶 以共价结合方式固定在介孔分子筛表面，提高固定化酶的性能。本发明所述的醛基介孔分子筛的显著优点之一在于，该醛基介孔分子筛的孔径比 青霉素酰化酶的分子尺寸大得多，有利于更多的酶分子进入介孔分子筛孔道内被固定化， 提高固定化酶的活性。
本发明所述的醛基介孔分子筛的显著优点之二在于，该醛基介孔分子筛通过表面 的醛丙基与酶分子中氨基之间形成的共价键来实现酶的固定化，提高固定化酶的操作稳定 性。
图1为用6°Co_ Y射线预辐照接枝技术对介孔分子筛表面的醛基功能化及酶的固 定化示意图；图2为用Y _醛丙基三甲氧基硅烷对介孔分子筛表面的醛基功能化及酶的固定化 示意图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。在以下实施例中，采用下述方法进行青霉素酰化酶的固定化，以及测定固定化酶 的活性和操作稳定性青霉素酰化酶的固定化称取0. lg载体与6. OmL经pH = 7. 8的磷酸盐缓冲溶液 稀释的青霉素酰化酶溶液(VbuffCT/VmzyM = 2 1)混合，放入30°C的水浴摇床中固定化18 小时后进行离心分离，所得固体用pH = 7. 8的磷酸盐缓冲溶液多次洗涤后进行活性测定。固定化酶的活性测定(青霉素G钾盐水解制备6-APA)在37°C的温度下，将上述 固定化酶与lOOmL 4衬％的青霉素G钾盐水溶液(用0. lmol/L pH = 7. 8磷酸盐缓冲溶液稀 释)均勻混合，然后用浓度为0. lmol/L的NaOH溶液滴定，使混合溶液的pH值保持在7. 8， 记录10分钟内NaOH的消耗量。然后用以下公式来计算固定化酶的活性A (IU/g) = VNa0HXCNa0HX 103/ (mXt)其中A代表固定化酶的活性;VNa0H代表NaOH消耗量(ml) ；C,^代表NaOH浓度 (mol/L) ；m代表载体干重(g) ；t代表测试所用时间(min)。固定化酶的操作稳定性测定将已使用过的固定化酶溶液进行离心分离，然后将 固定化酶转移到反应器中，采用上述活性测定方法测定使用过的固定化酶的活性。经过10 次循环使用后，固定化酶的活性与初始活性的百分比越高，则说明固定化酶的操作稳定性 越好。对比例在室温条件下，将2. 0g Pluronic P123 (E020P070E020, Mav = 5800)溶于 75mL 1.6mol/L的HC1溶液中；待P123完全溶解后加入0.023g氟化铵和3.0g 1，3，5-三甲苯，然 后将溶液升温至35°C并持续搅拌45min后，加入4. 4g正硅酸乙酯，并在35°C下持续搅拌20 小时；将溶液转入带有聚四氟乙烯内衬的水热晶化釜中，于100°C水热晶化24小时；待溶液 冷却至室温后过滤得到白色固体，在100°C的烘箱中干燥过夜，然后在马弗炉中程序升温至 550°C焙烧8小时得到介孔分子筛。将上述介孔分子筛用于青霉素酰化酶的固定化，得到的 固定化酶活性为10465U/g，经过10次循环使用后，固定化酶保留了 77%的初始活性。实施例1在室温条件下，将2. 0g Pluronic P123 (E020P070E020, Mav = 5800)溶于 75mL 1. 6mol/L的HC1溶液中；待P123完全溶解后加入0. 023g氟化铵和3. 0g 1，3，5-三甲苯，然后将溶液升温至35°C并持续搅拌45min后，加入4. 4g正硅酸乙酯，并在35°C下持续搅拌 20小时；将溶液转入带有聚四氟乙烯内衬的水热晶化釜中，于100°C水热晶化24小时；待 溶液冷却至室温后过滤得到白色固体，在100°c的烘箱中干燥过夜，然后在马弗炉中程序升 温至550°C焙烧8小时得到介孔分子筛。用6°Co_ Y射线预辐照接枝技术对介孔分子筛表面的醛基功能化及酶的固定化的 示意图如图1所示，将l.Og上述介孔分子筛置于6°Co-y射线中预辐照，辐照剂量为72kGy， 样品经预辐照后转移至160mL 50%的丙烯醛水溶液中，置于冰水浴中，抽真空，充氮气，然 后在60°C水浴中反应20小时；将介孔分子筛过滤后，在索氏提取器中用乙醇抽提以除去丙 烯醛聚合物，然后在50°C真空烘箱中干燥24小时得到醛基介孔分子筛。将上述醛基介孔分 子筛用于青霉素酰化酶的固定化，得到的固定化酶活性为8580U/g，经过10次循环使用后， 固定化酶保留了 83%的初始活性。实施例2介孔分子筛的制备方法与实施例1相同。将1. 0g上述介孔分子筛置于6°Co_ Y射 线中预辐照，辐照剂量为24kGy，样品经预辐照后转移至50mL 90 %的丙烯醛水溶液中，置 于冰水浴中，抽真空，充氮气，然后在30°C水浴中反应30小时；将介孔分子筛过滤后，在索 氏提取器中用乙醇抽提以除去丙烯醛聚合物，然后在75°C真空烘箱中干燥18小时得到醛 基介孔分子筛。将上述醛基介孔分子筛用于青霉素酰化酶的固定化，得到的固定化酶活性 为8760U/g，经过10次循环使用后，固定化酶保留了 81%的初始活性。实施例3介孔分子筛的制备方法与实施例1相同。将1. 0g上述介孔分子筛置于6°Co_ Y射 线中预辐照，辐照剂量为120kGy，样品经预辐照后转移至200mL 10%的丙烯醛水溶液中， 置于冰水浴中，抽真空，充氮气，然后在80°C水浴中反应10小时；将介孔分子筛过滤后，在 索氏提取器中用乙醇抽提以除去丙烯醛聚合物，然后在100°C真空烘箱中干燥12小时得到 醛基介孔分子筛。将上述醛基介孔分子筛用于青霉素酰化酶的固定化，得到的固定化酶活 性为8920U/g，经过10次循环使用后，固定化酶保留了 80%的初始活性。实施例4介孔分子筛的制备方法与实施例1相同。用醛丙基三甲氧基硅烷对介孔分子 筛表面的醛基功能化及酶的固定化示意图如图2所示，将1. 0g介孔分子筛和1. 78g 醛 丙基三甲氧基硅烷加入到50mL甲苯溶液中，在110°C加热回流10小时；将介孔分子筛过滤 后，在索氏提取器中用乙醇抽提以除去未反应的醛丙基三甲氧基硅烷，然后在50°C真 空烘箱中干燥12小时得到醛基介孔分子筛。将上述醛基介孔分子筛用于青霉素酰化酶的 固定化，得到的固定化酶活性为8895U/g，经过10次循环使用后，固定化酶保留了 92%的初 始活性。实施例5介孔分子筛的制备方法与实施例1相同。将1. 0g介孔分子筛和1. 07g Y -醛丙基 三甲氧基硅烷加入到50mL甲苯溶液中，在110°C加热回流10小时；将介孔分子筛过滤后， 在索氏提取器中用乙醇抽提以除去未反应的醛丙基三甲氧基硅烷，然后在50°C真空烘 箱中干燥12小时得到醛基介孔分子筛。将上述醛基介孔分子筛用于青霉素酰化酶的固定 化，得到的固定化酶活性为9240U/g，经过10次循环使用后，固定化酶保留了 89%的初始活性。实施例6介孔分子筛的制备方法与实施例1相同。将1. 0g介孔分子筛和0. 36g 醛丙基 三甲氧基硅烷加入到50mL甲苯溶液中，在110°C加热回流10小时；将介孔分子筛过滤后， 在索氏提取器中用乙醇抽提以除去未反应的醛丙基三甲氧基硅烷，然后在50°C真空烘 箱中干燥12小时得到醛基介孔分子筛。将上述醛基介孔分子筛用于青霉素酰化酶的固定 化，得到的固定化酶活性为9626U/g，经过10次循环使用后，固定化酶保留了 86%的初始活 性。实施例7介孔分子筛的制备方法与实施例1相同。将1. 0g介孔分子筛和0. 3g Y _醛丙基 三甲氧基硅烷加入到20mL甲苯溶液中，在100°C加热回流5小时；将介孔分子筛过滤后，在 索氏提取器中用乙醇抽提以除去未反应的醛丙基三甲氧基硅烷，然后在50°C真空烘箱 中干燥12小时得到醛基介孔分子筛。将上述醛基介孔分子筛用于青霉素酰化酶的固定化， 得到的固定化酶活性为9650U/g，经过10次循环使用后，固定化酶保留了 85%的初始活性。实施例8介孔分子筛的制备方法与实施例1相同。将l.Og介孔分子筛和2.0g 醛丙基 三甲氧基硅烷加入到100mL甲苯溶液中，在120°C加热回流15小时；将介孔分子筛过滤后， 在索氏提取器中用乙醇抽提以除去未反应的醛丙基三甲氧基硅烷，然后在100°C真空 烘箱中干燥24小时得到醛基介孔分子筛。将上述醛基介孔分子筛用于青霉素酰化酶的固 定化，得到的固定化酶活性为8775U/g，经过10次循环使用后，固定化酶保留了 93%的初始 活性。
权利要求
一种用于生物酶固定化的醛基介孔分子筛的制备方法，其特征在于，该方法是用60Co-γ射线预辐照接枝丙烯醛技术或γ-醛丙基三甲氧基硅烷对介孔分子筛表面的功能化修饰，在介孔分子筛表面引入链长较短的醛丙基官能团(-CH2-CH2-CHO)。
2.根据权利要求1所述的用于生物酶固定化的醛基介孔分子筛的制备方法，其特征在 于，所述的6tlCo-Y射线预辐照接枝丙烯醛技术是将介孔分子筛置于6tlCo-Y射线中预辐照， 辐照剂量为24 120kGy，样品经预辐照后转移至体积百分含量为10 90%的丙烯醛水溶 液中，在30 80°C水浴中反应10 30小时，然后将介孔分子筛过滤后，在索氏提取器中用 乙醇抽提除去丙烯醛聚合物，再在50 100°C真空烘箱中干燥12 24小时得到醛基介孔 分子筛。
3.根据权利要求2所述的用于生物酶固定化的醛基介孔分子筛的制备方法，其特征在 于，所述的丙烯醛水溶液的体积和介孔分子筛的质量比为50 200 1。
4.根据权利要求1所述的用于生物酶固定化的醛基介孔分子筛的制备方法，其特征 在于，所述的Y-醛丙基三甲氧基硅烷对介孔分子筛表面的功能化修饰是将介孔分子筛和 Y-醛丙基三甲氧基硅烷加入甲苯溶液中，在100 120°C加热回流5 15小时，然后将介 孔分子筛过滤后，在索氏提取器中用乙醇抽提除去未反应的Y -醛丙基三甲氧基硅烷，再 在50 100°C真空烘箱中干燥12 24小时得到醛基介孔分子筛。
5.根据权利要求4所述的用于生物酶固定化的醛基介孔分子筛的制备方法，其特征在 于，所述的Y-醛丙基三甲氧基硅烷和介孔分子筛的质量比为0.3 2 1，所述的甲苯的 体积和介孔分子筛的质量比为20 100 1。
6.根据权利要求1所述的用于生物酶固定化的醛基介孔分子筛的制备方法，其特征在 于，所述的醛基介孔分子筛可用于青霉素酰化酶、葡萄糖异构酶、葡萄糖转苷酶、胰蛋白酶 和淀粉酶等水溶性生物酶的固定化，特别适用于青霉素酰化酶的固定化。
全文摘要
本发明公开了用于生物酶固定化的醛基介孔分子筛及其制备方法。本发明用60Co-γ射线预辐照接枝丙烯醛技术或γ-醛丙基三甲氧基硅烷对介孔分子筛表面的功能化修饰，在介孔分子筛表面引入链长较短的醛丙基官能团，尽量减少表面功能化过程对于介孔分子筛的孔径、比表面积和孔容的影响，不需要进一步活化就可以直接使生物酶以共价结合方式固定在介孔分子筛表面，提高固定化酶的性能。将上述醛基介孔分子筛可用于青霉素酰化酶、葡萄糖异构酶、葡萄糖转苷酶、胰蛋白酶和淀粉酶等水溶性生物酶的固定化，特别适用于青霉素酰化酶的固定化，得到的固定化酶活性为8895U/g，经过10次循环使用后，固定化酶保留了92％的初始活性。
文档编号C12N11/14GK101851616SQ20101014823
公开日2010年10月6日 申请日期2010年4月16日 优先权日2010年4月16日
发明者刘晓晖, 卢冠忠, 张志刚, 王筠松, 王艳芹, 田程程, 詹望成, 郭杨龙, 郭耘, 高振源 申请人:华东理工大学