专利名称：利用昆虫系统表达白藜芦醇芪合酶和制备白藜芦醇的方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种从昆虫表达系统表达的白藜芦醇芪合酶制备白藜芦醇的方法，即利用昆虫系统表达的白藜芦醇合成的关键酶(芪合酶)，以西瓜皮或哈密瓜皮或葡萄皮等的提取液为底物在体外合成白藜芦醇的方法。
背景技术：
白藜芦醇药用价值的研究越来越受到国内外学者的青睐，Jang等在Science杂志上对白藜芦醇在癌症的始发、促进及发展阶段表现出的抑制作用进行了系列报道，从而使白藜芦醇成为癌症化学预防和化学治疗领域的一个研究热点。体外试验证实白藜芦醇可以抑制血小板功能和内皮细胞TF的表达，从而减少血栓形成。体外试验还证实白藜芦醇由于抑制了类花生酸的合成和血小板钙通道，从而抑制了由血栓素、ADP和胶原诱导的血小板聚集。在诱发心血管疾患的内皮源性介质中，21个氨基酸的内皮素21(ET21)是一个重要的先行分子。白藜芦醇已被发现可作为ET21的拮抗剂，可以拮抗ET21对大鼠的杀伤效应，并能够抑制由ET21所致的血压升高。在高胆固醇血症的兔子模型中，白藜芦醇可减少血浆ET21水平，并显著升高NO水平。这些研究结果显示白藜芦醇可改善内皮细胞功能，也是白藜芦醇发挥非酒精依赖性的心血管保护效应的机制之一。Orgogozo等调查后发现，经常饮用红葡萄酒的老年人罹患老年痴呆病的几率显著下降，推测红酒具有神经保护作用。之后，大量实验证实白藜芦醇是红葡萄酒中发挥神经保护作用的主要物质，研究发现，白藜芦醇可以标识激酶和神经细胞，通过葡萄酒摄入白藜芦醇，对于老年人的退化病，如帕金森症、痴呆症、风湿性疾病都有较好的预防和治疗作用。多羟基芪类物质大都具有抗氧化、抗自由基作用。研究证明，白藜芦醇具有抗氧化、抗自由基及影响花生四烯酸代谢的药理作用。这也是其具有多重生物学效应的重要机制之一。有研究表明，白藜芦醇能显著抑制肝微粒体、脑线粒体及突触体氧化损伤过程中 DNA的生成，对病毒性肝炎、帕金森病、阿尔茨海默病等疾病有很好的防治作用。白藜芦醇及白藜芦醇苷对脂质过氧化有很强的抑制作用，能降低血清和肝脏的脂质，减少脂质过氧化物在体内的堆积，保护肝脏不受损害。另外，白藜芦醇还能通过选择性下调细胞周期蛋白cyclinDl的表达，使星状细胞静止在Gl期，从而有利于抑制肝纤维化的形成。综上所述，白藜芦醇具有多方面有益于人类健康的生物药理活性，使其广泛应用于医药、保健品、化妆品和食品添加剂等领域。其在肿瘤、心脑血管疾病、痴呆、病毒性肝炎、 炎症疾病等方面的治疗及预防作用也越来越被人们认识，其临床应用前景广阔，有望成为一种可防治多种疾病的新型药物。然而，白藜芦醇市场售价极为昂贵，而且不宜为大多数人所利用。白藜芦醇的获得可以通过化学合成法得到，然而现有的化学合成方法，如Wittig 法和Wittig-Horner法、Perkin反应法、Heck反应法等都存在着产物的顺反异构选择性不高，收率低，生成的副产难以除去，合成路线步骤繁多等缺陷；在生物合成中一般原核表达载体产生的目的蛋白生物活性极低或无生物活性，植物表达系统一般产量低，周期长，难以大规模投入生产，更难以满足市场需要；而酵母和动物表达系统生产药物成本极高，产量极低，也存在相同的问题。Bac-to-Bac杆状病毒表达系统是近年来一种发展迅速的高效、便捷的新型真核表达系统。通过位点特异的转座可方便地将外源基因插入到杆状病毒穿梭载体上，然后提取含有外源基因的重组Bacmid，将其转染入昆虫细胞即可获得含有外源基因的重组病毒用于表达目的蛋白。Bac-to-Bac杆状病毒表达系统已在各领域得到广泛运用，受到广泛关注。Bac-to-Bac杆状病毒表达系统经过多年的发展，已分化出面向苜蓿银纹夜蛾杆状态病毒(Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus, AcMNPV) > 家香杆状病毒(Bombyxmori nuclear polyhedrosis virus, BmNPV)禾口棉铃虫杆状病毒 (Helicoverpa armigera nuclearpolyhedrosis virus, HaNPV)的3个子系统。AcMNPV 的Bac-to-Bac系统发展最早，研究也最深入，对其他两个系统的发展影响很大。近年来， Invitrogen公司应用Bac-to-Bac策略已开发出面向AcMNPV的表达系统。该系统中，Bacmid 包含有mini2F复制子、卡那霉素抗性筛选标记和细菌转座子Tn7的靶位点(mini-attTn7) 以及编码β-半乳糖苷酶α肽的部分DNA片段。Bacmid既能像质粒一样在E. coli中复制，又能像病毒一样感染昆虫细胞，供体质粒PFastBac含有庆大霉素抗性基因(Gen+)及Tn7的左右两臂序列，两臂序列之间是多角体蛋白的启动子，下游依次是多克隆位点、SV40的PolyA位点。将含有外源基因的供体质粒转化DHlOBac感受态细胞(该细胞含有杆状病毒穿梭载体、Kanr和复制子以及LacZ肽段编码基因)，供体质粒中的外源基因在辅助质粒编码的转座酶作用下，通过转座插入到杆状病毒基因组中，破坏了 LacZ的表达。通过含有卡那霉素、庆大霉素、四环素和X-gal的培养板筛选，重组的Bacmid (即重组病毒基因组)转化体菌落呈白色，而非重组Bacmid转化菌落为蓝色。从白色菌落培养物提取Bacmid DNA，用脂质介导法转染昆虫细胞即可获得重组病毒。Bac-to-Bac杆状病毒表达系统具有多方面的优势，其所产生的重组蛋白具有折叠和糖基化，其生物学活性、抗原性和免疫原性都与天然蛋白极为相似；具有较高的重组蛋白表达水平；可容纳较大外源DNA插入；可同时表达多个外源基因；能够可溶性地表达一些原核系统难以表达的大分子量蛋白；较易培养和生长，安全等。这些为进一步研究生物学活性奠定了良好的基础。目前，在开发杆状病毒作为表达载体时，应用最多的是将多角体蛋白基因删除，由外源目的基因替代，利用多角体强启动子带动外源基因的表达。由此产生的重组病毒不能形成多角体，重组病毒必需通过经皮注射的方式接种家蚕，才能实现病毒的有效感染和外源目的基因的表达。家蚕皮下注射接种不仅技术要求高，需预防细菌感染，而且接种工作强度大，效率低下，即使操作熟练的人员也很难在短时间内完成大规模的接种，往往会错过病毒接种的最佳时机。Bac-to-Bac系统与传统的杆状病毒表达载体系统(baculovirus expression vector system, BEVS)相比，至少有以下三个优势 大大缩短了重组病毒构建所需的时间。Bac-to-Bac杆状病毒表达系统只需要不到2周的时间来构建和纯化重组杆状病毒，而利用传统方法即便是技术熟练的人员也需要 4-6周甚至更长的时间才能获得重组杆状病毒。 不需要传统繁琐的空斑分析来纯化重组病毒，转座率高，纯化率达100%。原因在于重组病毒DNA在细菌内产生，可根据菌斑颜色筛选(蓝白斑筛选)，不存在野生型和非重组型病毒交叉污染的问题。 能够快速并同时分离多个重组杆状病毒，而且适合于蛋白变异体表达的结构或功能研究。在昆虫杆状病毒表达系统中，以家蚕杆状病毒表达系统更具优越性。利用家蚕表达外源重组蛋白不仅具有廉价、方便、高效的优点，而且翻译后加工也与天然蛋白相似。邓小昭等选择微载体Cytodex 3对家蚕BmN细胞进行高密度培养，其绿色荧光蛋白表达量是用方瓶静止培养的3倍，经ELISA法检测发现细胞培养液中HBeAg滴度达到1 32000; 李慧等利用Bac-to-Bac在昆虫细胞表达系统中表达出人FGF29重组蛋白；段宇等利用杆状病毒载体在家蚕幼虫中表达有生物学活性的可溶性分泌型重组人胰岛素样生长因子21(rhIGF21)。其它还有如重组人酸性和碱性成纤维细胞生长因子(aFGF，bFGF)、人内皮血管生长因子、人生长激素等都成功地在家蚕中得到表达，并都具有很高的生物活性。 Motohashi等成功构建了 BmNPV穿梭载体和大肠杆菌DHlOBac转化株，从而首次使BmNPV 穿梭载体系统成为可行。缪云根等运用此原理，成功地构建了含蜘蛛丝基因的重组杆状病毒rBacmid/BmNPV/Flag，蜘蛛丝蛋白在家蚕BmN细胞和家蚕幼虫中均得到表达。岳万福等应用这种新型的Bac-to-Bac/BmNPV杆状病毒表达系统使得Mn-SOD在家蚕幼虫内高效表达，为生产上制取超氧化物歧化酶(SOD)提供了良好的基础。
发明内容
为了克服现有的化学合成以及上述提到的生物合成中所遇到的难题，本发明的一个目的是应用昆虫表达载体来进行白藜芦醇芪合酶的生产，利用瓜果皮的提取液，在体外进行酶学反应，进而制备自藜芦醇粗制品。既能获得高活性的目的产物，又能降低成本，可规模化生产，以适应市场需求。本发明利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统高效表达白藜芦醇合成的关键酶，并分离纯化，使其能在体外条件下与底物充分发生催化反应，以得到目的产物。为解决其技术问题，本发明利用昆虫表达系统，同时将白藜芦醇芪合酶基因5’端的30个碱基替换为家蚕杆状病毒多角体基因5’端的30个碱基，并采用如下技术方案制得白藜芦醇芪合酶1)通过RT-PCR从葡萄组织获得白藜芦醇芪合酶(STS)基因(SEQ ID No 1)；并在其5’端加上BamH I酶切位点，3’端加上Sal I酶切位点，获得重组基因；其中，所使用的上游引物5 ‘ -GGAAGGATCCATGCCGAATTATTCATACACCCCCACCATCCAACGTGCCAAGGGTCCGGC 和下游引物5 ‘ -GGGCGTCGACTTAATTTGTAACCATAGC ；2)把重组基因经BamH I和Sal I双酶切后与pFastBac HTA质粒载体连接并获得重组 pFastBac HTA-Ilcjy 质粒，Bacmid DNA ；3)转化DH IOBac大肠杆菌感受态细胞；4)经蓝白斑筛选(含卡那霉素kanamycin，Kan ；庆大霉素gentamicin，Gen ；四环素tetracycline，Tet的固体培养基)，挑取含有重组Bacmid的白色菌落，提取重组Bacmid DNA ；5)提取重组Bacmid DNA，用脂质体介导法转染昆虫细胞，获得重组病毒(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，CGMCC，保藏编号CGMCC3673)；6)重组病毒的鉴定及大量扩增；7)重组病毒接种家蚕蛹，28°C 士2°C反应5到7天，即获得大量表达白藜芦醇芪合酶的工程蚕蛹；8)勻浆后纯化获得重组白藜芦醇芪合酶，蚕蛹用0.85wt%生理盐水按重量比 1 1混和后勻浆，然后多次离心后用G150分子筛纯化并脱盐后获得重组白藜芦醇芪合酶 (SEQ ID No2)。制得的白藜芦醇芪合酶用于白藜芦醇的制备，具体如下1)在30°C下，与西瓜皮或哈密瓜皮或葡萄皮及葡萄籽的提取液反应6 8小时， 获得反应混合物。 2)反应混合物用大孔树脂纯化，使用中极性的粒径在0. 30 1. 25mm的大孔树脂 DM-130进行富集，在常温条件下，用质量分数为60%的乙醇作解吸剂，以2. OmL/min的流速对已吸附了样品的白藜芦醇进行洗脱，收集洗脱液，获得的洗脱液经真空旋转蒸发浓缩，去除有机溶剂，并冷冻干燥，得到白藜芦醇粗制品。本发明技术方案实现的有益效果本发明利用在昆虫表达系统中获得白藜芦醇芪合酶，然后利用纯化得到的该芪合酶经转化获得白藜芦醇。本发明技术方案一是克服了化学合成技术上所存在的问题，如合成步骤繁杂，副产物难以去除，产物回收率不高，存在顺反异构体以及不能直接为人类所利用等问题；二是克服了原核表达系统所得产物活性低的问题，酵母表达系统生产的工程成本问题高以及植物表达系统生产药物的周期长、低转染效率等问题。其操作流程相对简单， 充分利用果皮废弃物，符合低碳经济理念，能结合产业化生产以满足市场的需要，有较为广阔的市场前景。
图1为RT-PCR获得白藜芦醇芪合酶基因的PCR产物电泳图，1为250bp DNA标记， 2为PCR产物分子量1. 2kb。
具体实施例方式本发明的技术方案结合以下附图详细描述如下。本发明所用的试剂若未明确指明，则均购自西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)。实验例1 白藜芦醇芪合酶基因的获得。以葡萄嫩芽为材料，用Trizol法提取总RNA，已Oligo (dT18)为引物逆转录获得 cDNA,并进行RT-PCR扩增白藜芦醇芪合酶基因，引物如下上游引物5‘ -GGAAGGATCCATGCCGAATTATTCATACACCCCCACCATCCAACGTGCCAAGGGTC C GGC ；下游引物5‘ -GGGCGTCGACTTAATTTGTAACCATAGC。
PCR反应体系为
ddH2020 μ L
10 X PCR缓冲液
2. 5μ L
(25mmol/L MgCl2)
2. 5mmol/L dNTP0. 5μ L
Primer 10. 5μ L
Primer 20. 5μ L
Taq聚合酶0. 5μ L
cDNA模板0. 5μ L
Total25 μ L
PCR的反应程序为
94°C预变性5min
94°C变性45 sec ^60°C退火45 sec 卜 30 cycles72。C延伸90 sec 」
72 0CIOmin
最后保存于4°C。
纯化PCR产物即获得白藜芦醇芪合酶基因，目的片段大小约
实施例2重组家蚕杆状状病毒的制备
l.pFast HTA和纯化PCR产物的双酶切
在无菌的Eppendorf管中，依次加
IOX缓冲液5 μ L
pFastBac HTA42. 5μ L
BamH I1. 5μ L
Sal I1 μ L
Total50 μ L
IOX缓冲液5 μ L
纯化后PCR产物42. 5μ L
BamH I1. 5μ L
Sal I1 μ L
Total50 μ L
37°C温育4h后备用。
2.酶切产物处理
双酶切后的反应体系，70°C水浴IOmin灭活限制性内切酶。胶回收PCR酶切后小片段以及pFastBac HTA载体大片段。利用胶回收试剂盒分别纯化回收。3.连接反应将纯化的PCR产物与pET_28a连接，反应条件如下2X连接酶缓冲液5yL回收的PCR产物3 μ LT4DNA 连接酶1 μ LpFastBac HTA1 μ L_Total10 μ L4 °C连接过夜。4.连接产物的转化1)取 5 μ L 重组质粒 pFastBac HTA-llc jy，加到 200 μ L BmDHlOBac 感受态细胞悬液中，轻轻混勻，冰上放置30min ；2) 42°C水浴热激45sec，迅速取出置冰上冷却3_5min ；3)加入ImL 37°C预热的LB液体培养基(不含抗生素)，混勻后37°C水浴4h，使细菌恢复正常生长状态；4)将转化好的菌液4000rpm离心lOmin，弃ImL上清，沉淀重悬后取约200 μ L培养液。5)取20μ L菌液稀释100倍，然后加入5μ L X_gal和5 μ L IPTG混勻，取菌液 100-200 μ L涂布于LB平板(含Tet、Gen和Kan)上，37°C正面向上避光放置30min，待菌液完全被培养基吸收后倒置避光培养48h。5.重组Bacmid的小量制备1)分别取 1. 5mL 培养液倒入 1. 5mL Eppendorf 管中，4°C，14，OOOrpm 离心 Imin ；2)弃尽上清，菌体沉淀重悬于预冷的300yL溶液I中，用吸液枪反复轻轻吹打；3)加入新鲜配制的溶液II 300 μ L，轻轻吹打，使其混勻；4)缓慢加入300 μ L ρΗ值为5. 5的醋酸钾溶液，边加边轻轻混勻，冰浴5-lOmin ；5)在 4°C下，14，OOOrpm 离心 IOmin ；6)将上清液轻轻转移到新的Eppendorf管中，加入800 μ L异丙醇，并且轻轻反复倒置，使液体充分混勻，然后冰浴5-lOmin。室温，14，OOOrpm离心15min ；7)小心移除上清液，加入500 μ L 70 %的乙醇，将Eppendorf管反复轻轻倒置几次，使液体充分混勻；8)在室温下14，OOOrpm离心5min，使重组Bacmid DNA充分洗涤和沉淀。如果需要的话重复10-11步。9)将上清液充分移除并且小心以防重组Bacmid DNA的再度溶解，在室温下将沉淀出的DNA放置5-lOmin晾干。切忌过分干燥。10)将重组Bacmid DNA再次溶解于40 μ L ρΗ值为8. 0的1 X TE Buffer中，避免剧烈摇动以防DNA断裂。允许轻轻摇晃使位于Eppendorf管底部的DNA充分溶解。11)将重组Bacmid DNA通过脂质体转染到家蚕Bm5细胞中。
12)等细胞发病后，传代培养重组病毒，并收集备用。实验例3重组病毒的接种和重组酶的纯化1.接种用3日龄蛹作为接种对象，蚕蛹表皮(70%酒精，食用酒精)消毒，按每头约 IOOpfu重组病毒穿刺接种。在清净的条件下，28°C放置5-7天，收获蚕蛹速冻后，_20°C储存备用。2.纯化重组酶1)蚕蛹勻浆a)原料蚕蛹在4°C解冻(约30min)，与0. 85%生理盐水按重量比1 1混和；勻浆，时间为9min勻至浆液细致均勻即可；2)低速离心(使用R10A3转头)，依次为b)将勻浆液加入500ml离心管中，配平，将R10A3转头放入离心机，3000rpm离心 30min，取上清，小心弃去油脂；c)将3000rpm离心上清液倒入新500ml离心管中，配平，6000rpm离心30min，取上
清，弃油脂；d)取出R10A3转头，擦拭后倒扣在毛巾上；实验例4果皮液汁的提取果皮切碎后，用中药粉碎机打成糊状，用4层纱布过滤，滤液12000rpm离心IOmin
后上清即为果汁提取液。实验例5利用重组酶生产白藜芦醇实例3中的初酶液与实例4中果皮提取液(提取液中4-香豆酰辅酶A的含量大于6 μ g/mL)，按1 6的体积比，于30°C下反应6 8小时，收集反应混合物。实验例6反应混合物中白藜芦醇的纯化中极性的粒径在0. 30 1. 25mm的大孔树脂DM-130进行富集，在常温条件下，用质量分数为60%的乙醇作解吸剂，以2. OmL/min的流速对已吸附了样品的白藜芦醇进行洗脱，收集洗脱液，获得的洗脱液经真空旋转蒸发浓缩，去除有机溶剂，并冷冻干燥，得到白藜芦醇产品，用高效液相色谱法测定其含量，产品中白藜芦醇量不低于70 %。
序列表
<110>上海科爱生物技术有限公司
<120>利用昆虫系统表达白藜芦醇芪合酶和制备白藜芦醇的方法 <130> MKA. HF. 9001 <160> 2
<170> PatentIn version 3.3 <210> SEQ ID No 1 <211> 1179 <212> DNA
<213>白藜芦醇芪合酶基因 <400> 1
atgccgaatt attcatacac ccccaccatc caacgtgcca agggtccggc cactatccta60gccattggca cagctactcc ttcagggtca ctaagagcga gacaaatcaa tgatcaagaa ccaaacattg gtgcttatat gaggtaccta gacttggtag aagtccaaga tcacccatct gattacaaac tcgctaatct catcaagggt gctatgcagg aatgcaggag cacgagttct ccttccgaag atgctttgga gctgtgattg ttggatcaga tcagcagccc aaacatttat gtggggctca cctttcattt aaatgcttga cccaggcttt attgctcacc caggtggccc aaaaagaaac tcgaagcaac tgtgtgttgt ttattctgga acaggtgaag gattggattg actgttgtgc tgcatagcgt 〈210〉 SEQ ID No 2 〈211〉 276 〈212〉 PRT
〈213〉白藜芦醇芪合酶 〈400〉 2
Met Pro Asn Tyr Ser Tyr 15101520
Ala lie Gly Thr Ala Thr 25303540
Phe Arg Val Thr Lys Ser 45505560
Asp Lys Ser Met lie Lys 65707580
Pro Asn lie Gly Ala Tyr 859095100
Glu Val Pro Arg Leu Gly
105110115120
Lys Ser Lys lie Thr His
125130135140
Asp Tyr Lys Leu Ala Asn
tgaccactgt gtctaccagt ctgattatgc gcacatgact gagttgaaga agaagttcaa gcgttacatt cacttgaccg aagaaatgct ggctccatct cttaacatac gccaagagat ggatgcagca ttgaaggctc ttaaagagtg tgtattttgt acaacctccg gtgtagaaat cttaggtctt gaaacatcgg ttagaagggt tggaactgtc cttcgaactg ctaaggatct tgtggtgtgc tctgagatca ctgttgttac ctctttagtt ggccaagccc tttttggtga tccagatgtc tcgattgaac gaccactctt tcctaattca gcaggagcca ttgccggaaa gtggcccaat gtgcctactt tgatttctga tgacccactt ggtattagcg attggaactc tgcaattctc gatgcagttg aagcaaaact taggcatgtg ttaagtgagt acggtaacat tgagatgaga aagaaatcct tgaaggggga gggagtatta tttggttttg ggccgggctt tcctacagtt acaaattaall79
tgattactatl20
tcgcatatgtl80
tgaggagcac240
tatcactgct300
gggccaacca360
gcccggtgcg420
gatgttgtac480
tgcagaaaat540
attccgtggc600
tgggtcttca660
ccaacttgtt720
cttacgtgag780
gaacatagag840
gttattttgg900
caatttagag960
gtcaagtgcal020
aaaggctaccl080
gaccatcgaall40
Thr Pro Thr lie Gln Arg Ala Lys Gly Pro Ala Thr lie Leu
Pro Asp His Cys Val Tyr Gln Ser Asp Tyr Ala Asp Tyr Tyr
Glu His Met Thr Glu Leu Lys Lys Lys Phe Asn Arg lie Cys
Lys Arg Tyr lie His Leu Thr Glu Glu Met Leu Glu Glu His
Met Ala Pro Ser Leu Asn lie Arg Gln Glu lie lie Thr Ala
Arg Asp Ala Ala Leu Lys Ala Leu Lys Glu Trp Gly Gln Pro
Leu Val Phe Cys Thr Thr Ser Gly Val Glu Met Pro Gly Ala
Leu Leu Gly Leu Glu Thr Ser Val Arg Arg Val Met Leu TyrCN 102220350 A
145150155160
His Gln Gly Cys Tyr Ala Gly Gly Thr Val Leu Arg Thr Ala Lys Asp Leu Ala Glu Asn 165170175180
Asn Ala Gly Ala Arg Val Leu Val Val Cys Ser Glu lie Thr Val Val Thr Phe Arg Gly 185190195200
Pro Ser Glu Asp Ala Leu Asp Ser Leu Val Gly Gln Ala Leu Phe Gly Asp Gly Ser Ser 205210215220
Ala Val lie Val Gly Ser Asp Pro Asp Val Ser lie Glu Arg Pro Leu Phe Gln Leu Val 225230235240
Ser Ala Ala Gln Thr Phe lie Pro Asn Ser Ala Gly Ala lie Ala Gly Asn Leu Arg Glu 245250255260
Val Gly Leu Thr Phe His Leu Trp Pro Asn Val Pro Thr Leu lie Ser 265270275
1权利要求
1.一种利用昆虫系统表达白藜芦醇芪合酶制备的方法，包括1)通过RT-PCR从葡萄组织中获得白藜芦醇芪合酶基因，并在其5’端加上BamHI酶切位点，3’端加上Sal I酶切位点，获得重组基因；2)把步骤1)获得的重组基因经BamHI和Sal I双酶切后与pFastBac HTA质粒载体连接并获得重组PFastBac ΗΤΑ-llcjy质粒；3)把步骤2)得到的重组质粒转化DHIOBac大肠杆菌感受态细胞；4)经蓝白斑筛选，挑取含有重组Bacmid的白色菌落，提取重组BacmidDNA ；5)用脂质体介导法转染昆虫细胞，获得重组病毒，保藏号CGMCC3673；6)重组病毒的鉴定及大量扩增；7)重组病毒接种家蚕蛹，28°C士2°C反应5到7天，即获得大量表达白藜芦醇芪合酶的工程蚕蛹；8)蚕蛹用0.85wt%生理盐水按重量比1 1混和后勻浆，然后多次离心后用G150分子筛纯化并脱盐后获得重组白藜芦醇芪合酶。
2.如权利要求1所述的利用昆虫系统表达白藜芦醇芪合酶制备的方法，其特征是所述 RT-PCR 的上游引物为 5 ‘ -GGAAGGATCCATGCCGAATTATTCATACACCCCCACCATCCAACGTGCCAAGGG TCCGGC，下游引物为 5 ‘ -GGGCGTCGACTTAATTTGTAACCATAGC。
3.如权利要求1所述的利用昆虫系统表达白藜芦醇芪合酶制备的方法，其特征是所述蓝白斑筛选选择含卡那霉素、庆大霉素和四环素的固体培养基。
4.如权利要求1所述的利用昆虫系统表达白藜芦醇芪合酶制备的方法，其特征是所述的重组白藜芦醇芪合酶如SEQ ID No2。
5.一种白藜芦醇的制备方法，包括1)在30°C下，把按权利要求1所述利用昆虫系统表达白藜芦醇芪合酶制备的方法制得的白藜芦醇芪合酶与西瓜皮或哈密瓜皮或葡萄皮及葡萄籽的提取液反应6 8小时，获得反应混合物；2)反应混合物用大孔树脂纯化。
6.如权利要求4所述的白藜芦醇的制备方法，其特征是所述大孔树脂纯化的方法为使用中极性的粒径在0. 30 1. 25mm的大孔树脂DM-130进行富集，在常温条件下，用质量分数为60%的乙醇作解吸剂，以2. OmL/min的流速对已吸附了样品的白藜芦醇进行洗脱，收集洗脱液，获得的洗脱液经真空旋转蒸发浓缩，去除有机溶剂，并冷冻干燥，得到白藜芦醇粗制品。
全文摘要
一种利用在昆虫表达系统中获得白藜芦醇芪合酶的方法，在采用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的同时，将白藜芦醇芪合酶基因5’端的30个碱基替换为家蚕杆状病毒多角体基因5’端的30个碱基的方式以增强白藜芦醇芪合酶基因在昆虫表达系统中高效表达。白藜芦醇芪合酶表达产物经纯化后被用于白藜芦醇的生物转化。本发明技术方案既克服了化学合成技术上所存在的问题，还克服了原核表达系统所得产物活性低的问题，操作过程简单，能充分利用果皮废弃物，符合低碳经济理念，能结合产业化生产以满足市场的需要，有较为广阔的市场前景。
文档编号C12P7/22GK102220350SQ20101014807
公开日2011年10月19日 申请日期2010年4月15日 优先权日2010年4月15日
发明者叶甫云, 吕正兵, 高然 申请人:上海科爱生物技术有限公司