专利名称：转基因玉米检测芯片的制作方法
技术领域：
本发明属于生物芯片技术领域，具体是一种转基因玉米检测芯片。
背景技术：
现有技术中，有关转基因产品的检测芯片报道有中国实用新型专利 ZL01214517. 3公开了一种用于转基因产品鉴定的基因检测芯片，即在平面型支撑载体的平 面上被覆有带正电荷材料的膜层，在该膜层的表面以微点阵方式排布有供转基因产品判断 用的异源基因探针。但在其说明书中未提供任何有关检测探针序列及待检靶基因扩增引物 的信息，仅有芯片说明无配套试剂盒故根本无法应用于实际工作中。中国发明专利03150523. 6公开了一种用于转基因产品检测的寡核苷酸芯片的制 造方法及其应用，是根据已知转基因产品基因组中所含的异源插入基因、物种内标基因、特 异性边界序列等设计特异性的寡核苷酸探针及相应引物，然后将探针固定在载玻片上构成 转基因产品检测芯片。该专利利用15-35聚探针，TM值在60度左右。这种长度的探针因 为较短，特异性太强，对某个位点发生突变无法检测。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有用于转基因产品鉴定的基因检测芯片所 存在的过的短探针特异性太强，对某个位点发生突变无法检测的弊端及过长的探针长度特 异性不强，容易造成假阳性的技术缺陷，为人们提供一种兼容性和特异性都较好的转基因
玉米检测芯片。
本发明的目的是通过下述技术方案来实现的。
本发明的转基因玉米检测芯片，其特征在于，针对CaMV-P、Nos-T等13个待检靶基因检测玉米产品 R5I是否拥有相关基因，设计55-59聚探针，探针的Tm值即解链温度基本相IhJ
异源长Tm
探针
插入基因度值
CaMV-PATTGAGTCGTAAGAGACTCTGTATGAACTGTTCGCCAGTCTTTACGGCGAGTTCTGTTA5974.5
Nos-TTTGCGGGACTCTAATCATAAAAACCCATCTCATAAATAACGTCATGCATTACATG5570.7
BarTTGGGCAGCCCGATGACAGCGACCACGCTCTTGAAGCCCTGTGCCTCCAGGGACTTCAG5982.1
NeoATGCTCTTCGTCCAGATCATCCTGATCGACAAGACCGGCTTCCATCCGAGTACGTGCTC5978.7
HptAAATCACGCCATGTAGTGTATTGACCGATTCCTTGCGGTCCGAATGGGCCGAACCCGCT5978.7
PatAATGTGTGTACAATGTAGATCCGAGGCCCAACCTTTGATGCCTATGTGACACGTAAACA5974.5
EPSPSAATCCACGCCATTGAGCTTGAGGCCATTGGCGACGGCCGAGAGGCGGTCGCTTTCCTTG5981.4
CryIAbATACCGATGTTGAAGGGCCTGCGGTACAGGGTGGAGCTCAGGGTGCGGTAGACGCCCTG5982.1
CryIACAGCATACCGTACACGAACTCGATATCTGGTAGATGTCGATGGGAAGTGAATTGGAACTT5974.5
Cry9CAGGCCCACGTTGGCTGGTGGGTTGAACACGATGGGGTCGGTGTACACCTCACGTGTCAG5981.4
GoxTTCAGTCTCAAAGCCGATGACACGCGCAGATACGAATTCGCCACCGTTCGCGATAAAAC5977.3
玉米长Tm
探针
内源基因度值
IVRTAGGCTCGAGTAGACGGAAATTCTCACGTGGTGCACGCTTGTACAGAGCGCTGCAGCAG5979.4
18STGTCACTACCTCCCTGTGTCAGGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT5578.2
4
上述方案中，根据所述待检靶基因设计有相应的带有荧光标记的 PCR扩增引物，分别为 靶基因名称引物序列(5’ -3’ )
Cy3-CACACCTGTACACGTCCCTG
CaMV-P Nos-T
Bar
Neo
Hpt Pat EPSPS CryIAb CryIAc Cry9C Gox IVR
TAGCTCATTGTCGTTGGACG Cy3-GAGAAACGGCTACCACATCCA
CCCAAAGTTCAACTACGAGC Cy3-AGCACGGTCAACTTCCGTAC
GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC Cy3-TGCTCCTGCCGAGAAAGTAT AATATCACGGGTAGCCAACG Cy3-TCAGCGAGAGCCTGACCTAT
GATGTTGGCGACCTCGTATT Cy3-CGGAGAGGAGACCAGTTGAG
AGGCCAATAACAGCAACCAC Cy3-ATATCCGATTCTCGCTGTCG
CCTTCGTATCGGAGAGTTCG Cy3-CCTGGACATTGTGTCCCTCT
AACTCAGTGCCATCCAGGAC Cy3-CCTGCAGTGAAGGGAAACTT
TTCTGCGCTCTTTCCAGATT Cy3-GACCGCCAAGTACACCAACT
GTCCATGAAGTTGCTGCTCA Cy3-GAACTTGTCGCATGCGTTTA
GCACGTTTCCAGTTAGGAGC Cy3-CACACCTGTACACGTCCCTG
TAGCTCATTGTCGTTGGACG Cy3-GAGAAACGGCTACCACATCCA
Tm值 66
60
64
60 62
62 60 60 62
60
64
60 60
62 62
62 60
58 62
60
58
62 64
60
64
18SCCCAAAGTTCAACTACGAGC60通过点样仪将上述探针转移到经化学基团修饰的玻片上，经SDS(十二烷基硫酸 钠)、纯水处理制成。玻片修饰基团可选自醛基、异硫氰基或巯基之一。抽提待检玉米基因 组DNA，用有荧光标记的引物对待检靶基因进行PCR(聚合酶链式反应)扩增，所得产物与寡 核苷酸探针阵列杂交，通过扫描仪获得待检玉米产品的相关信息。本说明书和权力要求书中使用的下列异源插入基因名称缩写除非特别说明具有 如下含义CaMV-P 花椰菜花叶病毒基因组的35S启动子；Nos-T =Ti胭脂碱合成酶基因终止子；Bar 来源于链霉菌Sti^ptomyces viridochromogenes，其编码产物为草丁磷乙酰 转移酶；Neo 大肠杆菌E. coli新霉素-磷酸转移酶基因；Hpt 潮霉素磷酸转移酶；Pat 来源于链霉菌Sti^ptomyces viridochromogenes，其编码产物为草丁磷乙酰 转移酶；EPSPS 5-莽草酸_3_磷酸合成酶基因；CryIAb胃 Bacillus thuringiensissubsp. Kurstaki crylA(b)基因；CryIAc胃 Bacillus thuringiensissubsp. Kurstaki crylA(c)基因；Cry9C^ Bacillus thuringiensissubsp. KurstakiS cryI9C 基因；Gox 细菌Ochrobactrum anthropi草甘膦氧化还原酶基因；IVR 玉米的转化酶1基因；18S 真核生物18S核糖体RNA基因。本发明之转基因产品所检测目的基因PCR扩增片段及探针标记序列如下CaMV-PGaggatctaacagaactcgccgtgaagactggcgaacagttcatacagagtcttttacgactcaatgac aagaagaaaatcttcgtcaacatggtggagcacgacactctcgtctactccaagaatatcaaagatacagtctcaga agaccaaagggctattgagacttttcaacaaagggtaatatcgggaaacctcctcggattccattgcccagctatct gtcacttcatcaaaaggacagtagaaaaggaaggtggcacctacaaatgccat该核酸序列部分为CaMV 35S启动子基因PCR扩增片段，下划线部分为探针杂交区域。Nos-TAagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgt aataattaacatRtaatRcatRacRttatttatRaRatRRRtttttatRattaRaRtcccRcaattatacatttaat acgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaa该核酸序列部分为Nos终止子基因PCR扩增片段，下划线部分为探针杂交区域。
BarGcacggtcaacttccgtaccgagccgcaggaaccgcaggagtggacggacgacctcgtccgtctgcggg agcgctatccctggctcgtcgccgaggtggacggcgaggtcgccggcatcgcctacgcgggcccctggaaggcacgc aacgcctacgactggacggccgagtcgaccgtgtacgtctccccccgccaccagcggacgggactgggctccacgct ctacacccacctgctgaagtccctggaggcacagggcttcaagagcgtggtcgctgtcatcgggctgcccaacgacc cgagcgtgcgcatgcacgaggcgctcggatatgccccccgcggcatgctgcgggcggccggcttcaagcacgggaac tggcatgacgtgggtttctggcagctggacttc该核酸序列部分为Bar基因PCR扩增片段，下划线部分为探针杂交区域。NeoTgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctac ctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcagg atgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggc gaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcat cgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatatt该核酸序列部分为Neo基因PCR扩增片段，下划线部分为探针杂交区域。HptTcagcgagagcctgacctattgcatctcccgccgtgcacagggtgtcacgttgcaagacctgcctgaaa ccgaactgcccgctgttctgcagccggtcgcggaggccatggatgcgatcgctgcggccgatcttagccagacgagc gggttcggcccattcggaccgcaaggaatcggtcaatacactacatggcgtgatttcatatgcgcgattgctgatcc ccatgtgtatcactggcaaactgtgatggacgacaccgtcagtgcgtccgtcgcgcaggctctcgatgagctgatgc tttgggccgaggactgccccgaagtccggcacctcgtgcacgcggatttcggctccaacaatgtcctgacggacaat ggccgcataacagcggtcattgactggagcgaggcgatgttcggggattcccaatacgaggtcgccaacatc该核酸序列部分为Hpt基因PCR扩增片段，下划线部分为探针杂交区域。PatCggagaggagaccagttgagattaggccagctacagcagctgatatggccgcggtttgtgatatcgtta accattacattgagacgtctacagtgaactttaggacagagccacaaacaccacaagagtggattgatgatctagag aggttgcaagatagatacccttggttggttgctgaggttgagggtgttgtggctggtattgcttacgctgggccctg RaaRRctaRRaacRcttacRattRRacaRttRaRaRtactRtttacRtRtcacataRRcatcaaaRRttRRRcctaR RatccacattRtacacacatttRCttaaRtctatRRaRRcRcaaRRttttaaRtctRtRRttRCtRttataRRCCt该核酸序列部分为Pat基因PCR扩增片段，下划线部分为探针杂交区域。EPSPSAtatccgattctcgctgtcgccgccgccttcgcggaaggggcgaccgtgatgaacggtctggaagaact ccgcgtcaaggaaagcgaccgcctctcggccgtcgccaatggcctcaagctcaatggcgtggattgcgatgagggcg agacgtcgctcgtcgtgcgcggccgccctgacggcaaggggctcggcaacgcctcgggcgccgccgtcgccacccat ctgcatcaccgcatcgccatgagcttcctcgtcatgggcctcgtgtcggaaaaccctgtcacggtggacgatgccac gatgatcgccacgatcttcccggagttcatggacctgatggccgggctgggcgcgaagatcgaactctccgatacga agg该核酸序列部分为EPSPS基因PCR扩增片段，下划线部分为探针杂交区域。CryIAb
Cctggacattgtgtccctcttcccgaactacgactcccgcacctacccgatccgcaccgtgtcccaact gacccgcgaaatctacaccaaccccgtcctggagaacttcgacggtagcttcaggggcagcgcccagggcatcgagg gctccatcaggagcccacacctgatggacatcctcaacagcatcactatctacaccgatgcccaccgcggcgagtac tactggtccggccaccagatcatggcctccccggtcggcttcagcggccccgagtttacctttcctctctacggcac gatgggcaacgccgctccacaacaacgcatcgtcgctcagctgggccagggcgtctaccgcaccctgagctccaccc tgtaccgcaggcccttcaacatcggtatcaacaaccagcagctgtccgtcctggatggcactgagtt该核酸序列部分为CryIAb基因PCR扩增片段，下划线部分为探针杂交区域。CryIAcCctgcagtgaagggaaactttctttttaatggttctgtaatttcaggaccaggatttactggtggggac ttagttagattaaatagtagtggaaataacattcagaatagagggtatattgaagttccaattcacttcccatcgac atctaccagatatcgagttcgtgtacggtatgcttctgtaaccccgattcacctcaacgttaattggggtaattcat ccattttttccaatacagtaccagctacagctacgtcattagataatctacaatcaagtgattttggttattttgaa agtgccaatgcttttacatcttcattaggtaatatagtaggtgttagaaattttagtgggactgcggagtgataata gacagatttgaatttattccagttactgcaacactcgaggctgaatataatctggaaagagcgcagaa该核酸序列部分为CryIAc基因PCR扩增片段，下划线部分为探针杂交区域。Cry9CGaccgccaagtacaccaactactgcgagacctggtacaacaccggtctggaccgcctgaggggcaccaa caccgagagctggctgcgctaccaccagttccgcagggagatgaccctggtggtgctggacgtggtggccctgttcc cctactacRacRtRCRCCtRtaccccaccRRcaRcaacccccaRctRacacRtRaRRtRtacaccRaccccatCRtR ttcaacccaccaRccaacRtRRRCCtRtRccRcaRRtRRRRcaccaacccctacaacaccttCaRCRaRCtRRaRaa cgccttcatcaggccaccccacctgttcgaccgcctgaacagcctgaccatcagcagcaatcgattccccgtgagca gcaacttcatggac该核酸序列部分为Cry9C基因PCR扩增片段，下划线部分为探针杂交区域。GoxTaacttgtctcacgcctttaccaagggaatccttatcgaagagaacggtcacaccatcaacccacaagg tctCRtRactctcttRtttCRtCRtttcatCRCtaaCRRtRRaRaRttcRtRtctRCtCRtRttatCRRattCRaRa ctgaaggtcgtgctctcaagggtatcaccaccaccaacggtgttcttgctgttgatgcagctgttgttgcagctggt gcacactccaagtctcttgctaactcccttggtgatgacatcccattggataccgaacgtggataccacatcgtgat cgccaacccagaagctgctccacgtattccaactaccgatgcttctggaaagttcatcgctactcctatggagatgg gtcttcgtgttgctggaaccgttgagttcgctggtctcactgctgctcctaactggaagcgtgc该核酸序列部分为Gox基因PCR扩增片段，下划线部分为探针杂交区域。IVRCacacctgtacacgtccctgtacgcgccgtcgtggtctcccgtgatcctgccccgtcccctccacgcg RccacRCCtRCtRCaRCRCtctRtacaaRcRtRcaccacRtRaRaatttccRtctactcRaRcctaRtaRttaRac gggaaaacgagaggaagcgcacggtccaagcacaacactttgcgcgggcccgtgacttgtctccggttggctgag ggcgcgcgacagagatgtatggcgccgcggcgtgtcttgtgtcttgtcttgcctatacaccgtagtcagagactg tgtcaaagccgtccaacgacaatgagcta该核酸序列部分为IVR基因PCR扩增片段，下划线部分为探针杂交区域。18S
8
Gagaaacggctaccacatccaaggaaggcagcaggcgcgcaaattacccaatcccgacacggggaggta ^tgacaataaatactgatacagggctcttttgggtcttgtaattggaatgagtacaatttaaatcccttaacgagga acaattagagggcaagtctggtgccagcagccgcggtaattccagctctaatagcgtatattaaatttgttgcagtt aaaaagctcgtagttgaaacttggg本发明整体构思是1.通过政府及国际组织网站NCBI、GENEBANK等核酸数据库、专 利数据库收集多种已商品化的转基因产品的基因构建图及相应的异源插入基因，并通过克 隆和测序给予补充和验证。这些异源插入基因可分为两类外源基因序列、边界序列A.启 动子、终止子和标记基因；B.性状基因(目标基因，既能改变植物形状的异源核苷酸片段)， 根据这些异源插入基因设计相应的探针和引物。2.选取一段与ISSrRNA产物相配对的寡核 苷酸片段，作为阳性参照，用于监控杂交反应中假阴性的出现。3.选取一段与内标基因IVR 产物相配对的寡核苷酸片段，作为玉米的物种特异性对照。4.将各类探针分别固定在一张 玻片的不同区域内便可达到并行对转基因玉米内多种异源插入基因片段进行筛查。本发明是发明人通过长期实践探索开发出来的科学实用的就是方案，提供了一种 可以测定上述目的基因的用于转基因玉米及其加工产品检测的基于寡核苷酸芯片技术的 高灵敏度、高通量的转基因玉米检测芯片，其探针经过特别设计，长度适中，并且克服了现 有技术中短探针特异性太强，对某个位点发生突变无法检测的弊端及过长的探针长度特异 性不强，容易造成假阳性的缺陷，为人们提供一种兼容性和特异性都较好的转基因玉米检 测芯片。下面通过实施例进一步描述本发明，本发明不仅限于所述实施例。
图1为与表4对应的芯片点阵排布设计示意2为CaMV-P理论杂交图，图3为CaMV-P实际杂交图。图4为cryIAb理论杂交图，图5为cryIAb实际杂交图。图6为EPSPS理论杂交图，图7为EPSPS实际杂交图。图8为neo理论杂交图，图9为neo实际杂交图。图10为nos-T理论杂交图，图11为nos-T实际杂交图。图12为pat理论杂交图，图13为pat实际杂交图。图14为bar理论杂交图，图15为bar实际杂交图。图16为18S理论杂交图，图17为18S实际杂交图。
具体实施例方式实施例1首先，要在醛基化芯片表面固定的DNA分子必须具有一个伯胺基。5’-氨基，又称 为连接氨基，具有通过6-12个碳原子间隔臂连接在5’核苷酸的磷酸基团上的一个伯胺基。 而为了使探阵分子在芯片上伸展开来，利于靶标探针的杂交，故合成时在每个探针的5’加 上了一个氨基和15个T。探针(如表1所示)和引物(如表3所示)是人工合成的一串寡核苷酸链，均由 核酸合成仪进行合成。
将合成好的探针用超纯水溶解，使其终浓度为40 μ Μ。然后将溶解的探针和点样缓 冲液(晶芯基因芯片点样液)充分混勻分装到384孔板中，另外还将Hex及阳性(PC)和阴 性(NC)内参装入384孔板的对应位置。之后将384孔板和醛基芯片放入芯片点样仪中进 行点样，点制好的芯片阵列如表4所示基因芯片点阵排布情况。芯片点制好后进行芯片的固定过程，探针牢固的结合到芯片上。固定的基本流程 为湿盒过夜——清洗液清洗——miIliQ水清洗——封闭液封闭——miIliQ水清
、他_亩J、、田不
优 闻;L·、尼丁。湿盒过夜将大芯片盒的下半部分清理干净，放入一块无尘布，再在无尘布内加入 15ml的milliQ水，将芯片盒放入大自封袋内，折叠好后放入37度烘箱内烘至少16小时。清洗液洗涤往大烧杯内加入588ml的milliQ水，同时加入10%的SDS 12ml，将 湿盒中取出的芯片放在芯片架上放入清洗液中，75rpm缓慢摇动5min。milliQ水清洗在另外一个大烧杯内加入750-800ml的milliQ水，将清洗液中的 芯片架取出，放入水中上下提拉芯片架30次(迅速)，换干净的milliQ水重复一次。封闭液封闭(封闭液提前配制)向烧杯中加入405ml的milliQ水，IOX的PBS 45ml，硼氢化钠1. 5克，待完全溶解后加入150ml的无水乙醇，玻璃棒迅速搅拌。将还在上 一步milliQ水的芯片架取出，放入封闭液中75rpm缓慢摇动5min。milliQ水清洗在另外一个大烧杯内加入750_800ml的milliQ水，将清洗液中的 芯片架取出，放入水中上下提拉芯片架30次(迅速)，换干净的milliQ水重复一次。离心甩干，避光静置备用。
表1针对CaMV-P、Nos-T等13个待检靶基因检测玉米产品是否拥有相关基因,计 55-59聚探针，探针的Tm值即解链温度基本相同
表1
异源长Tm
探针
插入基因度值
CaMV-PATTGAGTCGTAAGAGACTCTGTATGAACTGTTCGCCAGTCTTTACGGCGAGTTCTGTTA5974.5
Nos-TTTGCGGGACTCTAATCATAAAAACCCATCTCATAAATAACGTCATGCATTACATG5570.7
BarTTGGGCAGCCCGATGACAGCGACCACGCTCTTGAAGCCCTGTGCCTCCAGGGACTTCAG5982.1
NeoATGCTCTTCGTCCAGATCATCCTGATCGACAAGACCGGCTTCCATCCGAGTACGTGCTC5978.7
HptAAATCACGCCATGTAGTGTATTGACCGATTCCTTGCGGTCCGAATGGGCCGAACCCGCT5978.7
PatAATGTGTGTACAATGTAGATCCGAGGCCCAACCTTTGATGCCTATGTGACACGTAAACA5974.5
EPSPSAATCCACGCCATTGAGCTTGAGGCCATTGGCGACGGCCGAGAGGCGGTCGCTTTCCTTG5981.4
CryIAbATACCGATGTTGAAGGGCCTGCGGTACAGGGTGGAGCTCAGGGTGCGGTAGACGCCCTG5982.1
CryIAcAGCATACCGTACACGAACTCGATATCTGGTAGATGTCGATGGGAAGTGAATTGGAACTT5974.5
Cry9CAGGCCCACGTTGGCTGGTGGGTTGAACACGATGGGGTCGGTGTACACCTCACGTGTCAG5981.4
GoxTTCAGTCTCAAAGCCGATGACACGCGCAGATACGAATTCGCCACCGTTCGCGATAAAAC5977.3
玉米长Tm
探针
内源基因度值
IVRTAGGCTCGAGTAGACGGAAATTCTCACGTGGTGCACGCTTGTACAGAGCGCTGCAGCAG5979.4
18S TGTCACTACCTCCCTGTGTCAGGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT55 78.2本发明的应用方法如下1.试剂准备芯片洗液根据需要及实际情况，按如下比例配制洗涤液I和II。1)洗液I :SSC终浓度为2X，SDS终浓度为0. 2%。以配制总量500ml为例，量取 440ml蒸馏水倒入IOOOml试剂瓶中，加入50ml20X SSC，混勻。再加入IOml 10% SDS，混勻，
室温存贮。或根据需求按比例配制。2)洗液II :SSC终浓度为0. 2X。以配制总量500ml为例，量取495ml蒸馏水倒入 IOOOml试剂瓶中，加入5ml20XSSC，混勻，室温存贮。或根据需求按比例配制。2. PCR扩增玉米基因组DNA2.1配制PCR反应体系在PCR配液区内，在冰上融化PCR Mix及基因组DNA，按表2体系配制反应液。本 发明之PCR扩增试剂(MIX)为混合试剂，有以下主要成分①Taq酶(DNA聚合酶，0. 5 μ 1)， ② PCR 缓冲液(10XPCR Buffer，5 μ 1)，③脱氧核苷酸混合液(dNTP ΜΙΧ(10μΜ each, 1 μ 1)，④扩增引物混合液CaMV-P (R and F 10 μ Μ, Each 0. 5 μ 1) ,Cry9C(R and F :10μΜ, Each 0· 5 μ 1)，neo (R and F :10μΜ，Each 0. 5 μ 1), pat (R and F :10μΜ，Each 0. 5 μ 1), nos-T (R and F :10μΜ, Each 0. 5 μ 1), gox(R and F :10μΜ, Each 0. 5 μ 1), IVR (R and F 10 μ Μ, Each 0. 5 μ 1),, CryIAb (R and F : 10 μ Μ，Each 0. 5 μ 1), CryIAc (R and F : 10 μ Μ， EachO. 5μ 1), 18S(R and F :10μ Μ, Each 0. 5 μ 1), hpt(R and F :10μ Μ, EachO. 5 μ 1), bar (R and F :10μΜ, Each 0· 5 μ 1)，EPSPS (R and F :10μΜ, Each 0. 5 μ 1)⑤去核酸水 (ddH20,28.5 μ 1)。表2 转基因检测PCR反应体系 2. 2 PCR 扩增将配制好的反应液置于PCR扩增仪中，按照如下PCR反应循环程序进行PCR反应。94"C 5min
940C 30secn
56°C 30sec [ 40 cycles 72 °C 30sec^72 °C 5min4 "C ①
本例所采用的带有荧光标记的PCR扩增引物，如表3所示。3.杂交及结果判读3. 1杂交及洗片将杂交液在42°C溶化，按下面体系配制杂交液，杂交BufTer95°C变性3分钟，冰浴 3分钟，备用。
标记产物7μ1 I
\ Total 15μ1 95°C 3min，冰浴 5min ,吸取 14μ1 与芯片杂交 杂交液 8μ1 J打开芯片杂交盒，将杂交盒平放在桌面上，在杂交盒底部凹槽内加入约80μ 1灭 菌水。将芯片正面朝上(围栏面朝上，标签朝向操作者)放入杂交盒内两个定位销之间；放 上芯片盖片，注意有凸台的一面朝向芯片，上端先接触芯片，再缓缓盖下；然后用移液器通 过盖片加样孔缓慢注入15 μ 1变性后的杂交液，杂交液会凭借液体表面张力在盖片下面的 凸台和芯片表面之间形成一道液膜。注意不要震动盖片或芯片以避免破坏液膜。盖紧杂交 盒盖。放入42°C恒温水浴中，静置，杂交2小时或过夜均可。杂交后，取出芯片放在42°C预热好的洗液I中，42°C震荡清洗4分钟，再用42°C预 热好的洗液II，42°C震荡清洗4分钟(冬季洗液II可清洗两次，每次2分钟)，最后用42°C 预热好清水清洗一次，清洗后的芯片1500rpm离心1分钟以去除芯片表面的液体，此芯片可 避光保存，在4小时内扫描都有效。3.2芯片扫描及结果判读洗净的芯片使用微阵列芯片扫描仪进行扫描，通过配套软件自动对扫描结果进行 判读分析，给出检测结果，可对结果进行存储、打印和查询。本例上述时间、温度、配方等工 艺条件可在适当范围内调整，不仅限于所述实施例。表4为基因芯片点阵排布情况，图2-图17为用图1所示的基因芯片对各种转基 因玉米进行实际的检测结果，理论杂交图与实际杂交图的对比情况。表5为表4和图1中 各探针的名称与含义解释。本发明所述转基因玉米检测芯片，可与各种结构的芯片围栏、半封闭式围栏，折叠 式杂交盒、转基因生物芯片检测试剂盒等配套使用。表3带有荧光标记的PCR扩增引物
靶基因名称
CaMV-P
Nos-T
Bar
引物序列(5’ -3’ ) Cy3-CACACCTGTACACGTCCCTG
TAGCTCATTGTCGTTGGACG Cy3-GAGAAACGGCTACCACATCCA
CCCAAAGTTCAACTACGAGC Cy3-AGCACGGTCAACTTCCGTAC
GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC
Tm值 66
60
64
60 62
62
12Neo
Hpt
Pat
EPSPS
CryIAb
CryIAC
Cry9C
Gox
IVR
18S
Cy3-TGCTCCTGCCGAGAAAGTAT
AATATCACGGGTAGCCAACG Cy3-TCAGCGAGAGCCTGACCTAT
GATGTTGGCGACCTCGTATT Cy3-CGGAGAGGAGACCAGTTGAG
AGGCCAATAACAGCAACCAC Cy3-ATATCCGATTCTCGCTGTCG
CCTTCGTATCGGAGAGTTCG Cy3-CCTGGACATTGTGTCCCTCT
AACTCAGTGCCATCCAGGAC Cy3-CCTGCAGTGAAGGGAAACTT
TTCTGCGCTCTTTCCAGATT Cy3-GACCGCCAAGTACACCAACT
GTCCATGAAGTTGCTGCTCA Cy3-GAACTTGTCGCATGCGTTTA
GCACGTTTCCAGTTAGGAGC Cy3-CACACCTGTACACGTCCCTG
TAGCTCATTGTCGTTGGACG Cy3-GAGAAACGGCTACCACATCCA
CCCAAAGTTCAACTACGAGC 表4基因芯片点阵排布情况
60
60 62
60
64
60 60
62 62
62 60
58 62
60
58
62 64
60
64
60 表5为表4和图1中各探针的名称与含义
权利要求
一种转基因玉米检测芯片，其特征在于，针对CaMV P、Nos T等13个待检靶基因检测玉米产品是否拥有相关基因，设计55 59聚探针，探针的Tm值即解链温度基本相同异源 长 Tm 探针插入基因 度 值CaMV PATTGAGTCGTAAGAGACTCTGTATGAACTGTTCGCCAGTCTTTACGGCGAGTTCTGTTA 59 74.5Nos T TTGCGGGACTCTAATCATAAAAACCCATCTCATAAATAACGTCATGCATTACATG 55 70.7Bar TTGGGCAGCCCGATGACAGCGACCACGCTCTTGAAGCCCTGTGCCTCCAGGGACTTCAG 59 82.1Neo ATGCTCTTCGTCCAGATCATCCTGATCGACAAGACCGGCTTCCATCCGAGTACGTGCTC 59 78.7Hpt AAATCACGCCATGTAGTGTATTGACCGATTCCTTGCGGTCCGAATGGGCCGAACCCGCT 59 78.7Pat AATGTGTGTACAATGTAGATCCGAGGCCCAACCTTTGATGCCTATGTGACACGTAAACA 59 74.5EPSPS AATCCACGCCATTGAGCTTGAGGCCATTGGCGACGGCCGAGAGGCGGTCGCTTTCCTTG 59 81.4CryIAbATACCGATGTTGAAGGGCCTGCGGTACAGGGTGGAGCTCAGGGTGCGGTAGACGCCCTG 59 82.1CryIAcAGCATACCGTACACGAACTCGATATCTGGTAGATGTCGATGGGAAGTGAATTGGAACTT 59 74.5Cry9C AGGCCCACGTTGGCTGGTGGGTTGAACACGATGGGGTCGGTGTACACCTCACGTGTCAG 59 81.4Gox TTCAGTCTCAAAGCCGATGACACGCGCAGATACGAATTCGCCACCGTTCGCGATAAAAC 59 77.3玉米 长 Tm 探针内源基因 度 值IVR TAGGCTCGAGTAGACGGAAATTCTCACGTGGTGCACGCTTGTACAGAGCGCTGCAGCAG 59 79.418S TGTCACTACCTCCCTGTGTCAGGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT 55 78.2
2.根据权利要求1所述的转基因玉米检测芯片，其特征在于根据所述待检靶基因设计 有相应的带有荧光标记的PCR扩增引物，分别为靶基因名称 CaMV-PNos-TBarNeoHpt Pat引物序列(5’ -3’ ) Cy3-CACACCTGTACACGTCCCTGTAGCTCATTGTCGTTGGACG Cy3-GAGAAACGGCTACCACATCCACCCAAAGTTCAACTACGAGC Cy3-AGCACGGTCAACTTCCGTACGAAGTCCAGCTGCCAGAAAC Cy3-TGCTCCTGCCGAGAAAGTAT AATATCACGGGTAGCCAACG Cy3-TCAGCGAGAGCCTGACCTATGATGTTGGCGACCTCGTATT Cy3-CGGAGAGGAGACCAGTTGAGAGGCCAATAACAGCAACCACEPSPSCryIAbCryIAcCry9CGoxIVR18SCy3-ATATCCGATTCTCGCTGTCGCCTTCGTATCGGAGAGTTCG Cy3-CCTGGACATTGTGTCCCTCTAACTCAGTGCCATCCAGGAC Cy3-CCTGCAGTGAAGGGAAACTTTTCTGCGCTCTTTCCAGATT Cy3-GACCGCCAAGTACACCAACTGTCCATGAAGTTGCTGCTCA Cy3-GAACTTGTCGCATGCGTTTAGCACGTTTCCAGTTAGGAGC Cy3-CACACCTGTACACGTCCCTGTAGCTCATTGTCGTTGGACG Cy3-GAGAAACGGCTACCACATCCACCCAAAGTTCAACTACGAGC
全文摘要
本发明属于生物芯片技术领域，具体涉及一种转基因玉米检测芯片，其特点是针对CaMV-P、Nos-T等13个待检靶基因检测玉米产品是否拥有相关基因，设计有55-59聚探针，探针的Tm值即解链温度基本相同即在70.7-82.1的范围内，并根据所述待检靶基因设计有相应的带有荧光标记的PCR扩增引物CaMV-P、Cry9C、neo、pat、nos-T、gox、IVR、CryIAb、CryIAc、18S、hpt、bar、EPSPS，其Tm值在58-66的范围内，该芯片可与各种结构的芯片围栏、半封闭式围栏，折叠式杂交盒、转基因生物芯片检测试剂盒等配套使用，是基于寡核苷酸芯片技术的高灵敏度、高通量的转基因玉米检测芯片，其探针经过特别设计，长度适中，兼容性和特异性优异。
文档编号C12Q1/68GK101921833SQ20101014829
公开日2010年12月22日 申请日期2010年4月15日 优先权日2010年4月15日
发明者刘勇涛, 屈刚, 潘立, 郭琪琪, 钟尚勇, 黄广平 申请人:四川国兴盛生物科技有限公司