专利名称：一种快速制备重组耐热锰超氧化物歧化酶的方法
技术领域：
本发明属于生物分离工程与技术领域，具体是应用超大孔金属螯合层析介质快速 分离纯化在大肠杆菌中表达的重组耐高温锰超氧化物歧化酶(SOD)的方法，产品纯度达 85%以上。
背景技术：
SOD是体内一种重要的氧自由基清除剂，能够平衡机体的氧自由基，从而避免当体 内超氧阴离子自由基浓度过高时引起的不良反应，同时SOD是一种很有用途的药用酶。医 学界已经证明它具有抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、抗缺血、提高人体免疫力等作用(Bioehem J， 1991，274 :153-158)。目前SOD酶已作为一种保健医药产品广泛应用于医药、食品、饮料、化 妆品等行业，具有非常广阔的市场。热变性是导致酶失活的常见原因，在实际应用中，SOD的热稳定性是决定其能否 商业化的一个主要因素。从极端耐热微生物中克隆SOD基因，然后在大肠杆菌中重组表 达，从而制备耐高温SOD成为一个研究热点(Extremophiles，2005，9 :1-6 J Mol Biol, 270 259-274 JBiochem, 1999,126 218-225)。在本发明中我们从嗜热栖热菌 Thermus thermophilus HB27中克隆SOD基因，构建重组载体，在大肠杆菌中表达耐高温Mn_S0D。目前，从基因工程菌中分离SOD的方法主要有多级离心分离、双水相萃取、超滤、 层析等。然而，多级离心分离、双水相萃取、超滤分离的SOD纯度不高，通常只能得到粗酶制 品，作为医药级产品达不到应用标准。层析法虽然能够得到高纯度的S0D，但是现有的生物 大分子层析介质均属于软基质(琼脂糖、葡聚糖、纤维素等)，孔径小，分离速度慢，很难进 行工业放大。美国生物系统公司上世纪90年代开发了一种超大孔聚苯乙烯树脂(J Chromatog, 1990，519 :1_29)，粒径8-10 μ m,平均孔径有IOOnm和400nm两种，被用于反相 色谱和离子交换色谱对生物大分子进行快速、高分离度的制备分离。这种超大孔介质机械 强度高，传质速度快，有效降低了“停滞流动相的传质阻力”，分离速度比常规介质快10-100 倍。但由于微球制备方法复杂，重复性差，近年来少有POROS介质的应用报道。Gustavsson 等人依据这一原理(J. Chromatogr. A，1999，830 (2) 275-284)，将琼脂糖制成同时具有特 大孔和扩散孔的色谱介质，用于生物大分子的分离，分离时间比常规琼脂糖珠体分别快5 和3倍。但是由于琼脂糖微球自身属于多糖类软凝胶，机械强度是该微球应用的一个限制 因素。目前，在蛋白质等生物大分子分离纯化领域，超大孔介质的应用报道较少，或局限于 实验室规模分离模型蛋白，应用于分离纯化耐高温SOD酶的研究还未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种操作简单，易于放大的重组耐高温SOD酶快速分离制备 方法。本发明采取的技术路线是
1.以嗜热栖热菌(T. thermophilus HB27)基因组DNA为模板，采用PCR技术克隆 SOD基因，PCR产物经EcoR I和Sal I双酶切后，连接到经同样处理的pET28aw克隆/表 达载体上，产生重组质粒P28AS0D，将重组载体p28AS0D导入大肠杆菌(E. coli)，获得基因 重组工程菌E. coli/p28AS0D。2.将重组大肠杆菌培养至0D600约为0. 6 (37°C，250rpm)，加入诱导剂IPTG至浓 度为ImM;继续培养8小时。3.取步骤2得到的发酵液500ml，离心15min (离心条件为4 °C，离心力为 1000 X g)，用IM的TE Buffer (pH 8. 0) 5-lOml清洗菌体，再离心15min,弃去上清液，加入 IM的TE Buffer (pH 8.0) 5ml，混合均勻；用超声波细胞粉碎机对其进行菌体破碎(超声条 件声波时间2s，间隔3s，次数99次)；超声之后离心15min，取上清液备用。4.利用超大孔金属螯合介质层析柱对步骤3所得上清液进行上样，洗脱，一步得 到目标产品。本发明步骤4中所用的超大孔金属螯合介质为自制，平均粒径55 μ m，孔径 300-500nm,金属螯合配基为亚氨基二乙酸(IDA)，金属离子为Ni2+，金属螯合量为40 μ mol/ ml介质。本发明步骤4中超大孔介质的金属螯合配基还可以为次氨基三乙酸(NTA)、羧甲 基天冬氨酸(CM-Asp)、N，N, N-三羧甲基乙二胺(TED)，金属离子还以为Cu2+，Co2+，Zn2+。金 属离子螯合量范围10-120 μ mol/ml介质。本发明中的技术路线4是关键步骤，所用超大孔介质的孔径范围在lOO-lOOOnm。 如果所用超大孔介质孔径过小(< lOOnm)，则传质速率变慢，操作压力过高，无法保证分离 速度；如果超大孔介质孔径过大(> Iym)则介质的机械强度降低，容易变形或破碎，无法 保证正常操作。本发明产生的技术效果本发明所述耐高温SOD酶的快速分离工艺，仅涉及离心、破碎、上柱分离三个步 骤，分离速度快，可达常规色谱分离速度5倍以上，SOD酶活性损失小，回收率高，纯度达到 85%以上，为低成本、高纯度SOD酶的批量生产提供了科学依据。
图1实施例一 2528cm/h流速下SOD酶的分离色谱中PO为穿透峰，Pl为洗脱峰；流动相流速为2528cm/h。图2实施例二 3251cm/h流速下SOD酶的分离色谱中PO为穿透峰，Pl为洗脱峰；流动相流速为3251cm/h。图3实施例三1806cm/h流速下SOD酶的分离色谱中PO为穿透峰，Pl为洗脱峰；流动相流速为1806cm/h。从以上三个图中可以看出，不同流速下洗脱峰均只有一个，且峰形完好。
具体实施例方式实施例一取发酵液500ml，离心15mm(离心条件为4°C，离心力为lOOOXg)，用IM的TEBuffer (pH 8. 0) 5_10ml清洗菌体，再离心15min，弃去上清液，加入IM的TE Buffer (pH 8.0) 5ml，混合均勻；用超声波细胞粉碎机对其进行菌体破碎(超声条件声波时间2s，间 隔3s，次数99次)；超声之后离心15min，上清液即为粗酶液。取粗酶液5ml，利用上样器上 样，在装有半制备级超大孔镍柱(300 X IOmm I. D.)的Akta purifier IOOsystem上进行层 析分离，分离条件流动相，20mM磷酸缓冲液+0. 5M NaCl+0. 12M咪唑，pH 7. 4 ；洗脱相，20mM 磷酸缓冲液+0. 5M NaCl+0. 5M咪唑，pH 7. 4 ；洗脱方式，阶跃洗脱；操作流速，2528cm/h。收 集洗脱峰(图1)即为耐高温SOD酶溶液，在此条件下SOD酶的分离时间为3min，回收率为 89. 8%，纯度为 85. 36%。实施例二取发酵液500ml，离心15min(离心条件为4°C，离心力为lOOOXg)，用IM的TE Buffer (pH 8. 0)5_10ml清洗菌体，再离心15min，弃去上清液，加入IM的TE Buffer (pH 8.0) 5ml，混合均勻；用超声波细胞粉碎机对其进行菌体破碎(超声条件声波时间2s，间 隔3s，次数99次)；超声之后离心15min，上清液即为粗酶液。取粗酶液5ml，利用上样器上 样，在装有半制备级超大孔镍柱(300 X IOmm I. D.)的Akta purifier IOOsystem上进行层 析分离，分离条件流动相，20mM磷酸缓冲液+0. 5M NaCl+0. IM咪唑，pH 7. 4 ；洗脱相，20mM 磷酸缓冲液+0. 5M NaCl+0. 5M咪唑，pH 7. 4 ；洗脱方式，阶跃洗脱；操作流速，3251cm/h。收 集洗脱峰(图2)即为耐高温SOD酶溶液，在此条件下SOD酶的分离时间为2min，回收率为 89. 6%，纯度为 83. 84%。实施例三取发酵液500ml，离心15min(离心条件为4°C，离心力为lOOOXg)，用IM的TE Buffer (pH 8. 0) 5-10ml清洗菌体，再离心15min，弃去上清液，加入IM的TE Buffer (pH 8. 0) 5ml，混合均勻；用超声波细胞粉碎机对其进行菌体破碎(超声条件声波时间2s，间隔 3s,次数99次)；超声之后离心15min，上清液即为粗酶液。取粗酶液5ml，利用上样器上样， 在装有半制备级超大孔镍柱(300 X 10mm I. D.)的Aktapurifier IOOsystem上进行层析分 离，分离条件流动相，20mM磷酸缓冲液+0. 5M NaCl+0. IM咪唑，pH 7. 4 ；洗脱相，20mM磷酸 缓冲液+0. 5M NaCl+0. IM咪唑，pH 5 ；洗脱方式，阶跃洗脱；操作流速，1806cm/h。收集洗脱 峰(图3)即为耐高温SOD酶溶液，在此条件下SOD酶的分离时间为4min，回收率为94. 1%, 纯度为86. 05%.
权利要求
一种快速制备重组耐热锰超氧化物歧化酶的方法，是以装有超大孔金属螯合介质的色谱柱处理粗酶液，通过一步洗脱获得SOD酶，分离速度快，产品纯度高。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的超大孔金属螯合介质基质为球形 有机树脂，平均孔径范围lOO-lOOOnm，优选500nm。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的超大孔金属螯合介质螯合配体选 自次氨基三乙酸(NTA)、羧甲基天冬氨酸(CM-Asp)、N，N, N-三羧甲基乙二胺(TED) —种或 几种。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的超大孔金属螯合介质金属离子可 为Cu2+，Ni2+，Co2+，Zn2+中任一种，金属离子螯合量范围10-120 μ mol/ml介质。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，除了所分离的SOD酶，还可快速分离其他 带有组氨酸标签的人工重组蛋白。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的层析操作流速可在180-3612cm/h 范围内变动，优选2528cm/h.
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的层析操作，根据实际情况既可以是 线性梯度洗脱，也可以是阶跃梯度洗脱。
全文摘要
本发明提供了一种快速制备重组耐热锰超氧化物歧化酶的方法，属于生物分离工程技术领域，主要是应用金属螯合层析分离技术，采用自制的超大孔金属螯合介质，经过发酵液离心、细胞破碎、破碎液离心和层析四个简单步骤，即可从重组大肠杆菌中快速分离高纯度的耐高温锰超氧化物歧化酶，可达常规色谱分离速度5倍以上，SOD酶活性损失小，回收率高，纯度达到85％以上，为低成本、高纯度SOD酶的批量生产提供了可能。
文档编号C12N9/08GK101985614SQ201010504469
公开日2011年3月16日 申请日期2010年10月13日 优先权日2010年10月13日
发明者刘建国, 吕建仁, 曲剑波, 朱虎 申请人:中国石油大学(华东)