专利名称：mitf基因敲除剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种小眼相关转录因子(microphthalmia-associate transcription factor, mitf)基因的敲除剂，尤其涉及一种针对mitf基因的DNA序列 TTTGACTCTTATCAAAGACCTGAT 的基因敲除剂。
背景技术：
mitf基因表达一种含有螺旋-环-螺旋的亮氨酸拉链的蛋白质，最初是在小鼠毛 色突变体中发现的一种转录因子，与小鼠的毛色、眼睛的发育、破骨细胞和柱状细胞的发育 有关。mitf基因在斑马鱼、鸟类、哺乳动物中是同源的，在脊椎动物的色素细胞发育过程中 有重要作用。在斑马鱼中，mitfa基因主要在神经嵴起源的色素细胞中起作用，也在视网膜 色素上皮细胞中表达。研究mitf基因对于研究色素细胞和破骨细胞的发育有重要意义。目前研究基因的功能和信号通路主要是通过反向遗传学技术，所述反向遗传学技 术主要有传统的基因打靶技术，M0(morpholino oligonucleotide)技术、Tilling技术， RNAi，过表达技术等。传统的基因敲除技术已经有20多年的历史，在小鼠中建立了很成熟 的技术体系，可以定点敲除基因，但是该技术应用于不同的物种中，需要建立不同物种的胚 胎干细胞系，操作复杂，另外由于斑马鱼、果蝇等非哺乳动物很难建立胚胎干细胞系，难于 实施该技术。MO技术是一种常见的阻滞斑马鱼基因表达的技术，但是该技术存在以下三个 缺点一是作用的时间很短，只能在胚胎发育的前两三天对基因进行阻滞；二是作用的范 围有限，该技术只能对胚胎发育早期启动基因起作用；三是产生的表型不能遗传。Tilling 技术是一种可以使基因产生突变的技术，但是该技术费时、费力、而且很难在定点位置进行 突变。RNAi技术和过表达技术也只是针对某个基因，在翻译水平改变基因的表达水平，不能 得到目的基因缺失的突变体。鉴于此，研发简便实用的基因敲除剂，快速定点敲除mitf基因具有重大的应用价值。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种mitf基因敲除剂，即针对 mitf基因的DNA序列TTTGACTCTTATCAAAGACCTGAT的基因敲除剂。所述mitf基因敲除剂操 作简便实用，可以在TTTGACTCTTATCAAAGACCTGAT位点快速定点敲除mitf基因。本发明所述的mitf基因敲除剂，包括两种锌指核酸酶(Zinc finger nuclease, ZFN)；其特征在于所述锌指核酸酶是锌指核酸酶ZFm和锌指核酸酶ZFN2 ；其中，锌指核 酸酶ZFNl的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示，锌指核酸酶ZFN2的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。上述锌指核酸酶ZFNl包括锌指结构ZFl、Nco I酶切位点(CCATGG)和非特异性切 割结构域Fok I-RV，其中ZFl的氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示，ZFl特异性结合序列为 AGACCTGAT。
上述锌指核酸酶ZFN2包括锌指结构ZF2、Nco I酶切位点(CCATGG)和非特异性 切割结构域Fok I-DA，其中ZF2的氨基酸序列如SEQ ID No. 4所示，ZF2特异性识别序列 TTTGACTCT 的互补序列为 AGAGTCAAA。ZFNl和ZFN2结构大致相同，都包括锌指结构(Zinc finger, ZF)和一个非特异性 切割结构域，ZFNl的切割结构域Fok I-RV与ZF2的切割结构域Fok I-DA结合成异元二聚 体特异作用于两端识别序列之间的6个碱基TATCAA，切割出粘性末端，在生物体的修复过 程中，通过非同源末端连接修复的方式在这个位点产生永久性突变。本发明所述的mitf基因敲除剂的制备主要包含以下三个步骤[1]通过两步法PCR合成锌指核酸酶ZFNl和ZFN2的锌指结构ZFl和ZF2 ；[2]构建两个表达质粒，分别包含锌指核酸酶ZFNl和ZFN2的核酸序列；[3]体外表达锌指核酸酶ZFNl和ZFN2，并纯化这两种蛋白。本发明所述的mitf基因敲除剂在各种生物的mitf基因定点敲除中的应用本发明所述的mitf基因敲除剂可应用于对斑马鱼、小鼠、鸟类等的mitf基因进行 定点敲除，进而可深入研究mitf基因的功能和相关的信号通路。本发明所述的mitf基因敲除剂具备的优势是(1)应用范围广，可以在体外培养的细胞、胚胎细胞、个体水平进行。(2)基因敲除的位点特异性强，针对斑马鱼mitfa基因的DNA序列的第 2968-2988个碱基对(TTTGACTCTTATCAAAGACCTGAT)，也可以针对小鼠的进化保守位点 TTTGACTCTTATCAAAGACCTGAT。(3)操作过程简单，仅需要一名技术人员。(4)操作过程所需时间短，理论完成周期仅为2个月。
图1 :mitf基因敲除剂的锌指结构核酸序列合成的结果。图中数字表示泳道，第1 泳道是DNA marker,自上到下条带依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp。第2泳道 为锌指结构ZF1，第3泳道为锌指结构ZF2。本图说明通过两步法合成的两段锌指结构序列 的大小是正确的。图2 :mitf基因敲除剂的锌指结构ZFl的测序结果。第一个序列为测序结果，第二 个序列为设计的锌指序列。根据测序结果比对，通过两步法合成的锌指结构ZFl序列是准 确的。图3 :mitf基因敲除剂的锌指结构ZF2的测序结果。第一个序列为测序结果，第二 个序列为设计的锌指序列。根据测序结果比对，通过两步法合成的锌指结构ZF2序列是准 确的。图4 :mitf基因敲除剂的切割结构域Fok I序列的扩增。图中数字表示泳道，第1 泳道为 DNA marker,自上到下条带依次为 2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、lOObp。第 2泳道是FOK I-DA的扩增结果，第3泳道是FOK I-RV的扩增结果。图5 :mitf基因敲除剂的锌指核酸酶ZFNl蛋白的表达纯化检测。图中数字表示泳 道，第 1 泳道为 Protein marker 自上到下依次为 116KD、66KD、45KD、35KD、25KD、18. 4KD。第 2泳道是诱导前菌株的蛋白表达情况，第3泳道为诱导后菌体总蛋白，第4泳道为诱导后上清中表达的蛋白，第5泳道为诱导后沉淀中表达的蛋白，第6泳道为纯化后蛋白的检测。本 图说明含有质粒PET-ZFNl-30a的大肠杆菌菌株，诱导后在30KD处有显著的表达，纯化的结 果几乎没有杂带，可以用于进一步的实验。图6 :mitf基因敲除剂的锌指核酸酶ZFN2蛋白的表达纯化检测。图中数字表示泳 道，第 1 泳道为 Protein marker 自上到下依次为 116KD、66KD、45KD、35KD、25KD、18. 4KD。第 2泳道是诱导前菌株的蛋白表达情况，第3泳道为诱导后菌体总蛋白，第4泳道为诱导后上 清中表达的蛋白，第5泳道为诱导后沉淀中表达的蛋白，第6泳道为纯化后蛋白的检测。本 图说明含有质粒PET-ZFN2-30a的大肠杆菌菌株，诱导后在30KD处有显著的表达，纯化的结 果几乎没有杂带，可以用于进一步的实验。图7 :mitf基因敲除剂的体外检测结果。图中数字表示泳道，第1泳道是DNA marker,自上到下依次为 15000bp、10000bp、7500bp、5000bp、3000bp、1500bp、lOOObp、 500bp。第2泳道是对照组，第3泳道是酶和底物比例为2 1的体外检测结果，第4泳道 是酶和底物比例为1 1的体外检测结果，第5泳道是酶和底物比例为1 2的体外检测 结果。其中第2泳道上样量是第3泳道的10倍，是第4、5泳道的5倍。经过琼脂糖电泳的 分析表明，在锌指核酸酶和底物的反应比例为1 1的时候是反应的最佳比例。在这种反 应比例下，锌指核酸酶的效果是最好的，几乎把底物质粒的所有超螺旋结构都切开了。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明进一步说明实施例1mitf基因敲除剂的合成方法主要分为以下几步[1]禾U用美国国立生物信息中心(National center for Biotechnologylnformation, NCBI)的 Nucleotide 数据库搜索得至Ij mitf 的 DNA 序 列、mRNA序列以及mitf的进化保守位点，向zinc finger tools网站中输入mitf 的DNA序列，在搜索到的所有位点中根据保守性和外显子分布区域得到靶位点 TTTGACTCTTATCAAAGACCTGAT ；[2]根据zinc finger tools网站中得到的靶位点，得到该靶位点相应的特异锌指 结构的氨基酸序列，ZFl的具体氨基酸序列见SEQ ID No. 3，ZF2的具体氨基酸序列见SEQ ID No. 4 ；[3]根据斑马鱼的密码子偏爱性得到相应的锌指结构的核酸序列，ZFl的核酸序 列见SEQID No. 5，ZF2的核酸序列见SEQ ID No. 6 ；[4]两步法合成锌指结构的核酸序列，将所得到的锌指结构氨基酸序列输入网站 DNAfforks中，将参数调好，得到输出的引物序列，经过两步法PCR得到目的基因，琼脂糖电 泳检测如图1，得到的ZFl的锌指序列的测序结果如图2，ZF2序列的测序结果如图3 ；[5]分别从质粒 PCMV-FOK I-RV 和质粒 PCMV-F0K I-DA (购自 Fermentas 公司)中 经过PCR扩增Fok I-RV和Fok I-DA的序列并各自加上Nco I和Xho I两个酶切位点，具 体检测结果见图4;[6]将ZFl与Fok I-RV通过酶切连入表达载体PET_30a (购自Fermentas公司) 中，构建表达载体PET-ZFN l-30a ；
[7]将ZF2与Fok I-DA通过酶切连入表达载体PET_30a (购自Fermentas公司) 中，构建表达载体PET-ZFN2-30a ；[8]将构建好的质粒PET-ZFNl_30a和PET_ZFN2_30a转入表达菌株中，在22°C和 0. 3mMIPTG(异丙基- β -D-硫代吡喃半乳糖苷)的诱导下，经过超声破碎后，将上清蛋白在 4°C过镍柱纯化蛋白，并用SDS(聚丙烯酰胺凝胶电泳)检测诱导前后纯化后的蛋白样品，具 体结果见图5，图6;[9]将纯化的锌指核酸酶ZFNl和ZFN2按照1 1的比例混合，得到mitf基因敲 除剂。实施例2mitf基因敲除剂切割效率的体外检测[1]按照实施例1的方法，得到mitf基因敲除剂；[2]通过PCR扩增出靶位点序列TTTGACTCTTATCAAAGACCTGAT，将靶位点连入 PEASY-Blunt质粒(购自于北京全式金生物公司)中，构建出PEASY-target-Blunt作为反 应底物；[3]将mitf基因敲除剂和底物按照1 1的比例加入体外反应体系中，在25°C下 反应2小时，利用琼脂糖电泳检测体外反应结果，见图7。实施例3mitf基因敲除剂的切割效率在斑马鱼个体水平的检测[1]按照实施例1的方法，得到mitf基因敲除剂，加入适量甘油，构成锌指核酸酶 混合物；[2]将锌指核酸酶混合物通过显微注射的方法，注射到斑马鱼单细胞胚胎中，每颗 卵注射2pmol ；[3]将注射胚胎养成成鱼；[4]提取成鱼的基因组DNA，对mitf基因靶位点处进行PCR检测；[5]mitf基因敲除的成鱼之间自交产生子代，观察子代表型，提取子代基因组 DNA,检测mitf基因突变情况。实施例4mitf基因敲除剂的核酸序列在斑马鱼中的应用[1]按照实施例1的方法中的前7步，得到表达载体PET-ZFNl_30a和 PET-ZFN2-30a,从质粒上扩增ZFNl和ZFN2，通过PCR的方法在ZFNl和ZFN2的5’端加上斑 马鱼特有的核定位信号，构建出NLS-ZFNl和NLS-ZFN2序列；[2]将NLS-ZFNl和NLS-ZFN2全序列酶切连接到质粒PEGFP-附(购自于Fermentas 公司)中，构建出注射质粒 PEGFP-NLS-ZFN1-N1 和 PEGFP_NLS-ZFN2_m ；[3]将注射质粒 PEGFP-NLS-ZFNl-m 和 PEGFP-NLS-ZFN2_m 分别线性化，按照 11的比例混合这两种质粒；[4]将混合质粒通过显微注射的方法注射到斑马鱼单细胞胚胎中，每个胚胎注射 2nl混合质粒；[5]用荧光显微镜记录注射后的胚胎的发育状况，并将注射胚胎养成成鱼；[6]提取成鱼的基因组DNA，对mitf基因靶位点处进行PCR检测；
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[7]mitf基因敲除的成鱼之间自交产生子代，观察子代表型，提取子代基因组 DNA,检测mitf基因突变情况。实施例5mitf基因敲除剂在小鼠中的应用[1]按照实施例1的方法，得到mitf基因敲除剂，加入适量甘油，构成锌指核酸酶 混合物；[2]将锌指核酸酶混合物随精子注射到小鼠的卵细胞中；[3]将注射后的小鼠受精卵培养到8细胞期，转入假孕小鼠中；[4]将子一代小鼠饲养到成鼠阶段，取鼠尾组织提取基因组DNA，检测mitf基因靶 位点的突变情况；[5]mitf基因敲除的子一代小鼠之间自交产生子二代，观察子二代表型，提取子二 代基因组DNA，检测mitf基因突变情况。
权利要求
一种mitf基因敲除剂，包括两种锌指核酸酶；其特征在于所述锌指核酸酶是锌指核酸酶ZFN1和锌指核酸酶ZFN2；其中，锌指核酸酶ZFN1的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，锌指核酸酶ZFN2的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.如权利要求1所述的mitf基因敲除剂，其特征在于所述锌指核酸酶ZFm包括锌指 结构ZF1、Nco I酶切位点和非特异性切割结构域Fok I-RV，其中ZFl的氨基酸序列如SEQ IDNo. 3所示，ZFl特异性结合序列为AGACCTGAT。
3.如权利要求1所述的mitf基因敲除剂，其特征在于所述锌指核酸酶ZFN2包括锌指 结构ZF2、Nco I酶切位点和非特异性切割结构域Fok I-DA，其中ZF2的氨基酸序列如SEQ IDNo. 4所示，ZF2特异性识别序列TTTGACTCT的互补序列为AGAGTCAAA。
全文摘要
本发明公开了一种mitf基因敲除剂，包括锌指核酸酶ZFN1和锌指核酸酶ZFN2；其中，锌指核酸酶ZFN1的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，锌指核酸酶ZFN2的氨基酸序列如SEQID No.2所示。本发明所述的mitf基因敲除剂可以快速、简单、特异的敲除mitf基因，主要应用于对斑马鱼、小鼠、鸟类等动物的mitf基因进行敲除，从而进一步研究不同物种mitf基因的功能和相关的信号通路。
文档编号C12N9/00GK101979524SQ201010503840
公开日2011年2月23日 申请日期2010年10月12日 优先权日2010年10月12日
发明者刘洪卯, 时永香, 王雯雯, 罗在礼 申请人:山东大学