专利名称：用于检测p53基因表达的引物对及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测P53基因表达的引物对及其应用。
背景技术：
P53蛋白及其编码基因p53在人类、猴、鸡和鼠等动物中相继发现后，对其进行了基因定位，人类P53基因定位于17P13. 1，鼠P53定位于11号染色体，进化程度迥异的动物中，P53有异常相似的基因结构，约20Kb长，都由11个外显子和10个内含子组成，第1个外显子不编码，外显子2、4、5、7、8、分别编码5个进化上高度保守的结构域，p53基因5个高度保守区即第13 19、117 142、171 192、236 258、270 286编码区。p53基因转录成2. 5KbmRNA，编码393个氨基酸蛋白，分子量为53KD。30年来人类对p53的认识从它是一种肿瘤病毒蛋白，发展为一个庞大的基因家族；从一种抑癌基因，发展到几十种抑癌基因群体；从一条单一细胞通路，发展成多种细胞信号网络；从一种促细胞凋亡的功能，发展出生长、生殖、发育、代谢、增殖、转移、免疫、转录、调控、干细胞等无数功能；从与肿瘤相关，发展与心血管、代谢、遗传、神经、免疫、老化等多学科、多疾病相关。在遗传稳定性方面，p53具有重要意义，在肿瘤细胞中，有70%以上的p53基因发生了突变或者表达减少，这些质或量的变化使得P53不能正常行使人体的基因卫士和细胞卫士，因此建立检测P53表达量的RT-PCR的方法对检测遗传稳定性具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测p53基因表达的引物对及其应用。本发明提供的引物对为序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的特异引物对。所述特异引物对可用于制备检测p53基因表达的试剂盒。本发明还保护一种检测p53基因表达的试剂盒，包括所述特异引物对。所述试剂盒还可包括标准品；所述标准品为序列表的序列3所示的DNA。所述试剂盒还可包括RNA提取试剂、RNA反转录试剂和PCR扩增试剂。所述特异引物对可用于检测p53基因表达。本发明还保护一种检测p53基因表达的方法，包括如下步骤(1)提取待测样本的RNA ；(2)将 RNA 进行一步法 RT-PCR ；(3)检测PCR产物，确定p53基因的表达情况。所述p53基因为如下(a)或(b)或(c)(a)具有序列表的序列3自5，末端第158-1308位核苷酸的DNA ；(b)序列表的序列3所示的DNA ；(c)GENBANK ACCESSION NO. NM 001127233. 1 所示的 DNA。
所述方法中，每10 μ L所述一步法RT-PCR的反应体系中含有序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA各5pmol。所述方法中，每10 μ L所述一步法RT-PCR的反应体系中含有待测样本的RNA 1 μ L0所述方法中，每10 μ L所述一步法RT-PCR的反应条件为50°C 30 分钟；94°C 2分钟；94°C 45秒，55°C 30秒，72°C 30秒，30个循环；72°C 10分钟。所述方法中，具体可采用蓝罡生物科技有限公司的产品目录号为LGAR001的试剂盒提取待测样本的 RNA,采用TAKARA公司的产品目录号为DRR024AJ的试剂盒进行所述一步法RT-PCR。待测样本具体可为小鼠的各个组织，小鼠脾脏、肝脏或脑组织。本发明公开了用于检测p53基因表达的特异引物对。在特异引物对的基础上，开发了检测P53基因的一步法RT-PCR方法，并优化了检测条件和检测体系。与传统免疫学和生物学检测方法相比，本发明提供的检测P53基因表达的方法具有特异性强、灵敏度高、快速简便、检测结果稳定等优点，更加适合于实际生产中的应用。
图1为RNA纯化体系选择；1 =RNA液；2 =RNA液的2倍稀释液；3 =RNA液的10倍稀释液；4 =RNA液的20倍稀释液；5 =RNA液的50倍稀释液；6 =RNA液的100倍稀释液。 图2为优化PCR反应循环数；1 =RNA液；2 =RNA液的10倍稀释液；3 =RNA液的100
倍稀释液。图3为优化引物浓度；1 =RNA液；2 =RNA液的10倍稀释液；3 =RNA液的100倍稀释液。图4为优化RNA模板量；1 =RNA液；2 =RNA液的10倍稀释液；3 =RNA液的100倍稀释液。图5为采用优化后的各个参数后得到的标准图谱；1 =RNA液；2 =RNA液的10倍稀释液；3 =RNA液的100倍稀释液。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。C57小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例1、特异引物对的设计设计一对用于检测p53基因表达量的特异引物对如下P53-A1 (上游引物)5，-TGAAGCCCTCCGAGTGTC-3，；P53-A2 (下游引物)5，-TCGGGTGGCTCATAAGGT-3，。实施例2、特异引物对应用时相关参数的选择实施例中，均采用序列表的序列3所示DNA作为PCR体系中的阳性对照模板。一、RNA纯化体系选择1、分别采用 TRIZOL 法(TRIZOL Reagent, Invitrogen, Cat no : 15596-018，Lotno 13706)和RNA抽提试剂盒(蓝罡生物科技有限公司产品LGAR001，动物组织总RNA纯化试剂盒)提取C57小鼠脾脏的RNA。C57小鼠脾脏的质量为0. Ig,获得RNA的浓度在3000ng/ μ L-42000ng/y L 之间。2、用50 μ L DEPC水溶解提取的RNA，进一步稀释成为1 μ g/ μ L RNA溶液。3、将1 μ g/ μ L RNA溶液分别进行2倍、10倍、20倍、50倍、100倍稀释，得到各个
浓度的稀释液。4、以0. 4 μ L稀释液为模板，采用One step RT-PCR试剂盒(TAKARA公司，目录号 DRR024AJ)和实施例1的特异引物对进行一步法RT-PCR，PCR反应体系见表1，PCR反应条件见表2。表1 一步法RNA PCR反应体系
权利要求
1.序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的特异引物对。
2.权利要求1所述特异引物对在制备检测p53基因表达的试剂盒中的应用；所述p53 基因为如下(a)或(b)或(c)(a)具有序列表的序列3自5’末端第158-1308位核苷酸的DNA；(b)序列表的序列3所示的DNA；(c)GENBANKACCESSION NO. NM_001127233. 1 所示的 DNA。
3.检测p53基因表达的试剂盒，包括权利要求1所述特异引物对； 所述P53基因为如下(a)或(b)或(c)(a)具有序列表的序列3自5’末端第158-1308位核苷酸的DNA；(b)序列表的序列3所示的DNA；(c)GENBANKACCESSION NO. NM_001127233. 1 所示的 DNA。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括标准品；所述标准品为序列表的序列3所示的DNA。
5.如权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括RNA提取试剂、RNA 反转录试剂和PCR扩增试剂。
6.权利要求1所述特异引物对在检测p53基因表达中的应用；所述p53基因为如下(a) 或(b)或(C)(a)具有序列表的序列3自5’末端第158-1308位核苷酸的DNA；(b)序列表的序列3所示的DNA；(c)GENBANKACCESSION NO. NM_001127233. 1 所示的 DNA。
7.一种检测p53基因表达的方法，包括如下步骤(1)提取待测样本的RNA；(2)将RNA进行一步法RT-PCR；(3)检测PCR产物，确定p53基因的表达情况； 所述P53基因为如下(a)或(b)或(c)(a)具有序列表的序列3自5’末端第158-1308位核苷酸的DNA；(b)序列表的序列3所示的DNA；(c)GENBANKACCESSION NO. NM_001127233. 1 所示的 DNA。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于每10μ L所述一步法RT-PCR的反应体系中含有序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA各5pmol。
9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于每10μ L所述一步法RT-PCR的反应条件为50°C 30 分钟；94°C 2 分钟；94°C 45 秒，55°C 30 秒，72°C 30 秒，30 个循环；72°C 10 分钟。
10.如权利要求7至9中任一所述的方法，其特征在于采用蓝罡生物科技有限公司的产品目录号为LGAR001的试剂盒提取待测样本的RNA ；采用TAKARA公司的产品目录号为 DRR024AJ的试剂盒进行所述一步法RT-PCR。
全文摘要
本发明公开了一种用于检测p53基因表达的引物对及其应用。本发明提供了序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的特异引物对。所述特异引物对可用于制备检测p53基因表达的试剂盒，并用于检测p53基因表达情况。本发明引物对的基础上，开发了检测p53基因的一步法RT-PCR方法，并优化了检测条件和检测体系。与传统免疫学和生物学检测方法相比，本发明提供的检测p53基因表达的方法具有特异性强、灵敏度高、快速简便、检测结果稳定等优点，更加适合于实际生产中的应用。
文档编号C12N15/11GK102443581SQ201010504389
公开日2012年5月9日 申请日期2010年10月9日 优先权日2010年10月9日
发明者任芳丽, 刘艳, 夏永静, 孙小军, 常智杰, 王银银, 窦琳 申请人:清华大学