专利名称：表达pdh和fdh酶的遗传稳定性质粒的制作方法
表达PDH和FDH酶的遗传稳定性质粒本申请涉及并要求2009年4月8日提交的美国临时申请系列号61/167，676的优先权，通过提及而将其公开内容收入本文。序列表仅以电子格式(计算机可读形式)与本申请一起提交，并且通过提及而收入本文。在2010年4月7日创建序列表文本文件“09-203-SEQ_LIST” [大小为22，343个
字节]。发明背景发明领域本发明涉及用于表达甲酸脱氢酶(FDH)和经修饰的苯丙氨酸脱氢酶(PDHmod)的核酸分子、质粒(例如双顺反子质粒)、宿主细胞和方法。
背景技术：
二肽基肽酶IV是一种膜结合的非经典的丝氨酸氨肽酶，其位于多种组织中，包括但不限于肠、肝、肺、和肾。此酶还位于循环T-淋巴细胞上，其中将它称为⑶-26。二肽基肽酶IV在体内负责内源肽GLP-I (7-36)和胰高血糖素的代谢切割，并且已经在体外表明了其针对其它肽诸如GHRH、NPY、GLP-2和VIP的蛋白水解活性。GLP-I (7-36)是一种源自胰高血糖素原在小肠中的翻译后加工的四个氨基酸的肽。此肽在体内具有多种作用。例如，GLP-I (7-36)刺激胰岛素分泌，并抑制胰高血糖素分泌。此肽还促进饱足，并减缓胃排空。已经显示了经由连续输注外源施用GLP-I (7-36)在糖尿病患者中是有效的。然而，对于连续治疗性使用，外源肽的降解太迅速。已经开发出二肽基肽酶IV的抑制剂以加强GLP-l(7-36)的内源水平。美国专利No. 6，395，767披露了基于环丙基稠合的吡咯烷的二肽基肽酶IV抑制剂。在美国专利No. 6，395，767中以及在文献中披露了用于化学合成这些抑制剂的方法。例如，参见 Sagnard 等 Tetr. Lett. 199536 :3148-3152 ；Tverezovsky 等 Tetrahedron 199753 14773-14792 ；及 Hanessian 等 Bioorg. Med. Chem. Lett. 19988 :2123_2128。美国专利No. 6，395，767中所披露的抑制剂的例子是游离的碱，(1S，3S，5S) -2- [ (2S) -2-氨基-2-(3-羟基-三环[3.3. 1. I.3’7]癸-1-基)-1-氧代乙基]-2-氮杂二环-[3. 1.0]己烧月青。EP 0 808 824 A2中披露了用于制备在生成此二肽基肽酶IV抑制剂中所使用的中间体的方法。还可参见 Imashiro 禾口 Kuroda Tetrahedron Letters 200142 :1313-1315, Reetz 等 Chem. Int. Ed. Engl. 197918 :72，Reetz 禾口 Heimbach Chem.Ber. 1983 116 3702-3707，Reetz 等 Chem. Ber. 1983116 :3708_3724。可以在3-羟基-α-氧代三环-[3. 3. 1.13’7]癸烷乙酸向(aQ-α-氨基-3-羟基三环[3. 3. 1. I3'7]癸烷-1-乙酸的生物转化中使用酶甲酸脱氢酶(FDH)(例如来自巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris) (ATCC 20864))和苯丙氨酸脱氢酶(PDH)(例如来自中间型嗜热放线菌(Thermoactinomyces intermedius) (ATCC 33205))的重组表达，然后将所述(α S) - α -氨基-3-羟基三环[3. 3. 1. I3'7]癸烷乙酸化学转化成(α S) - α -[ [ (1，1- 二甲基乙氧基)羰基]氨基]-3-羟基三环[3. 3. 1. I3'7]癸烷-1-乙酸，即DPPIV抑制剂沙克列汀(saxagliptin)合成中的一种起始材料。先前使用含有两个相同串联启动子(针对每个酶一个启动子)以驱动表达的单一质粒来表达FDH和PDH的尝试已经获得有限的成功。特别地，在先的尝试似乎已经生成了含有两种不同细菌细胞群体的细菌培养物一种含有完整的质粒，而另一种含有FDH基因的质粒的一部分似乎已经进行过加工(截短)。对质粒的加工似乎已经随每个细胞世代而增加。如此，虽然生物转化方法已经鉴定为用于生成复杂的化学前体的方法，但是上文所讨论的生物合成方法由于遗传不稳定性而遭受产物产率的降低。如此，需要备选的重组序列和方法以供生成在化合物诸如沙克列汀的最终生成中的合成前体分子。发明概述在一方面，公开内容涉及一种分离的核酸分子，其包含(a)包含与SEQ ID NO :1为95%相同的核苷酸序列的分离的核酸序列；或(b)编码SEQ ID NO 4的多肽和SEQ ID NO 5的多肽的序列。在一方面，公开内容涉及一种分离的核酸分子，其包含SEQ ID NO :1的核苷酸序列。在一方面，公开内容涉及一种分离的核酸分子，其包含在严格杂交条件下与SEQ ID NO 1的核苷酸序列的互补物杂交的序列。在一方面，公开内容涉及一种分离的核酸分子，其包含SEQ ID NO :2的核苷酸序列。在一方面，公开内容涉及一种质粒，其包含含有SEQ ID NO 1的核酸分子。在一方面，公开内容涉及一种分离的宿主细胞，其包含含有SEQ ID NO :1的核酸分子。在一方面，公开内容涉及一种分离的宿主细胞，其包含含有SEQ ID NO :2的核酸分子。在一方面，公开内容涉及一种用于生成(aS)-a-[[(l，l-二甲基乙氧基)羧基]-氨基]-3-羟基三环[3.3. 1.13’7]癸烷-1-乙酸(式I)的方法
权利要求
1.分离的核酸分子，其包含(a)包含与SEQID NO :1为95%相同的核苷酸序列的分离的核酸序列；或(b)编码SEQID NO 4的多肽和SEQ ID NO 5的多肽的序列。
2.分离的核酸分子，其包含SEQID NO :1的核苷酸序列。
3.权利要求1的分离的核酸分子，其中所述编码SEQID NO 4的多肽和SEQ ID NO 5 的多肽的序列进一步包含单启动子区。
4.分离的核酸分子，其包含于42°C在包含50%甲酰胺、5XSSC(0. 75M NaCl、0. 075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6. 8),0. 焦磷酸钠、0. 1% SDSjP 10%硫酸葡聚糖的杂交缓冲液中，并且其后于42°C在包含0. 2X SSC^PO. 1% SDS的杂交清洗缓冲液中与核苷酸序列 SEQ ID NO 1的互补物杂交的序列。
5.分离的核酸分子，其包含SEQID NO :2的核苷酸序列。
6.质粒，其包含权利要求2的核酸分子。
7.分离的宿主细胞，其包含权利要求6的质粒。
8.权利要求7的宿主细胞，其是原核细胞。
9.用于生成(α幻-α-[[(1，1-二甲基乙氧基)羧基]_氨基]_3_羟基三环[3. 3. 1. I3’ 7]癸烷-ι-乙酸(式I)的方法
全文摘要
提供了用于表达甲酸脱氢酶(FDH)和经修饰的苯丙氨酸脱氢酶(PDHmod)的双顺反子质粒。
文档编号C12N9/02GK102459610SQ201080025346
公开日2012年5月16日 申请日期2010年4月8日 优先权日2009年4月8日
发明者J.巴希, S.W.刘, S-J.蒋, T.弗朗西丝奇尼 申请人:百时美施贵宝公司