专利名称：用于同步糖化和发酵以生产乙醇的方法
用于同步糖化和发酵以生产乙醇的方法本申请要求于2009年12月23日提交的美国临时专利申请61/289749的优先权。发明领域本发明涉及用于由纤维素生物质生产乙醇的方法。具体地讲，在用于生产高浓度乙醇的特定同步糖化和发酵方法条件下来使用发酵单胞菌属(Zymomonas)。
背景技术：
由可再生资源生产燃料乙醇是针对全球的化石燃料短缺、能源成本增加、以及与大气二氧化碳含量提高相关的全球变暖效应的一种长期解决方案。来自可再生资源的燃料乙醇通过糖发酵来生产。目前在美国来源于玉米粒的葡萄糖是用于乙醇生产的最丰富的糖来源。由于对作为饲料和食品供应的玉米粒的需求，正在研发将多种类型的纤维素生物质(包括半纤维素)转化成可发酵糖的方法。来源于这种生物质来源的糖是己糖和戊糖的混 合物，主要是葡萄糖和木糖。作为开发纤维素生物质加工方法的结果，可释放高浓度的这些糖并将其用于高浓度发酵以产生乙醇，同时减少水消耗并具有较高的生产能力。同样地，将生物质转化成乙醇通过向化石燃料提供潜在地经济上可行的替代方案，提出了对于改善环境影响的极大可能性。将纤维素生物质转化成乙醇的典型方法包括三个步骤；化学和/或物理处理生物质以降低生物质的木质素含量并制备酶水解可利用的多糖；糖化或消化或水解，其中将多糖酶促转化成可发酵糖；以及发酵，其中通过用于产生乙醇的产乙醇生物(ethanologen)消耗可发酵糖。在一些情况下，取决于条件和产乙醇生物的性质，组合糖化和发酵步骤可能是能量上最高效的。需要优化这些步骤中的每一步以生产高浓度乙醇。产乙醇生物通常为酵母(例如糖酵母属(Saccharomyce))或细菌(例如发酵单胞菌属)。发酵单胞菌属适用于乙醇生产，因为它一般生命力强，在相对高的葡萄糖浓度下生长良好，并且能够经工程化以利用C5糖例如木糖和阿拉伯糖(常见的糖化产物)产生乙醇。然而，发酵单胞菌属的有效利用需要改善使用发酵单胞菌属作为产乙醇生物的方法。发酵单胞菌属作为产乙醇生物的用途是已知的(Saddler等人，Can.J. Microbiol. (1982)，28 (12)，1311-19 :Golias 等人，J. Biotechnol.，(2002 年 6 月 26 日)
(96)2，第 155168 页；Ma 等人，Renewable Energy (2009) 34 :1466-1470)，然而发酵单胞菌属对由多种生物质预处理方法产生的高浓度乙酸敏感。可通过例如洗涤经预处理的生物质的方法降低乙酸水平(Teixeira 等人，Appl. Biochem. Biotechnol. , (Spring, 2000)第 84-86卷，第 111-127页)。在同步糖化和发酵中利用木糖的发酵单胞菌属的用途也是已知的，其中所述生物质用氢氧化钠处理，随后用过乙酸处理并洗漆(Teixeira等人，同上)。Eklund等人(Enzymeand Microbial Technology (1995), 17 (3), 255-9)展不了使用发酵单胞菌属作为产乙醇生物的同步糖化和发酵，其中所述生物质用蒸汽和二氧化硫进行预处理并洗涤，然后发酵在烧瓶和发酵罐中以约10%的总不溶性固体浓度进行，同时进行一定地搅拌，其中所述乙醇产量为约28g/L。
此外，McMillan等人(Appl. Biochem. Biotechnol. (1999) Vol. 77-79 :649-665)展示了发酵单胞菌属在同步糖化和发酵方法中的用途，其中所述发酵单胞菌属菌株经改造以适用于杨树水解产物，所述生物质用稀酸预处理，然后用MTBE萃取，糖化酶为纤维素酶，并且其中发酵在发酵罐中以11. 5%的不溶性固体浓度和150RPM的搅拌速度进行。使用这种方法，作者能够获得约35g/L的乙醇产量。上述方法说明发酵单胞菌属可用于用来生产乙醇的同步糖化和发酵方法中。然而，使用这些方法的乙醇产量低并且清楚的是所述方法需要进行优化以影响商业数量的乙
醇产量。发明概沭通过确定允许在糖化和发酵混合物中使用的高输入不溶性固体含量并维持 原核产乙醇生物生产以便获得高乙醇产量,本发明的方法寻求解决优化原核产乙醇生物在同步糖化和发酵(SSF)方法中的使用的问题。使用本发明方法的乙醇产量可超过60g/L。因此本发明提供了用于生产乙醇的方法，包括a)提供包含不溶性固体和多糖的经预处理的生物质；b)提供至少一种用于将多糖转化成可发酵糖的糖化酶；c)提供原核产乙醇生物；d)在包括搅拌装置的生物反应器中制备糖化-发酵混合物，其包含a)的经预处理的生物质、b)的糖化酶、和c)的原核产乙醇生物；以及e)在所述糖化-发酵混合物中使所述原核产乙醇生物生长，其中在所述糖化-发酵混合物中的总输入不溶性固体的浓度基于每升干重计为至少约16%，并且其中所述原核产乙醇生物产生乙醇。在本发明的一个方面，本发明的所述搅拌装置提供不超过约O. 2瓦特/kg总糖化-发酵混合物的功率。在另一方面，本发明提供了用于生产乙醇的方法，包括a)提供粒度等于或小于约100 μ m或粒度等于或大于约600 μ m的经预处理的生物质，所述经预处理的生物质包含不溶性固体和多糖；b)提供至少一种用于将多糖转化成可发酵糖的糖化酶；c)提供原核产乙醇生物；d)在包括搅拌装置的生物反应器中制备糖化-发酵混合物，其包含a)的经预处理的生物质、b)的糖化酶、和c)的原核产乙醇生物；以及e)在所述糖化-发酵混合物中使所述原核产乙醇生物生长，其中I)在所述糖化-发酵混合物中的总输入不溶性固体的浓度基于每升干重计为至少约16% ;并且2)其中所述原核产乙醇生物产生乙醇。在另一方面，本发明提供糖化-发酵体系，包括a)包含不溶性固体和多糖的经预处理的生物质；b)至少一种用于将多糖转化成可发酵糖的糖化酶；和c)原核产乙醇生物；其中(a)的生物质、(b)的酶、和(C)的产乙醇生物在糖化-发酵混合物中混合，所述混合物具有基于每升干重计至少约16重量％的总输入不溶性固体浓度。
附图
简沭、牛物保藏和序列描沭申请人:已经按照国际承认的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约的有关条款进行了以下生物保藏保藏菌株信息·
国际
保藏人鉴定保藏所
参考文献_命名__保藏日期_
发酵单胞菌属ZW658 ATCC No PTA-7858 2006年9月12日图I为显示了固体载量和搅拌RPM对SSF的效应的图，所述SSF使用重组发酵单胞菌属和稀氨预处理过的玉米芯，其具有15mg的H3A蛋白/g葡聚糖+木聚糖。图2为显示了在SSF条件下RPM和固体载量对重组运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)活力的效应的图,所述SSF使用稀氨预处理过的玉米芯,其具有15mg的H3A蛋白/g葡聚糖+木糖。图3A和B为显示了不同粒度对使用重组运动发酵单胞菌进行的发酵的效应的图，所述发酵在25%的固体载量中使用具有不同粒度的Ballotini玻璃小珠。A和B是使用不同粒度范围的不同实验。图4为显示了来自IL SSF级别的乙醇、木糖和葡萄糖浓度的图，其具有两个Rushton 6叶片叶轮(直径45mm)，转速为100RPM。图5为显示了来自IL SSF级别的乙醇、木糖和葡萄糖浓度的图，其具有两个船用式6叶片叶轮(直径45mm)，转速为150RPM。图6为显示了在SSF运行中的乙醇产量的图，该运行具有初始的25重量％的生物质加入量并在250或750RPM下搅拌(A);或者分开加入生物质并在80或250RPM下搅拌⑶。图7A为显示了 SSF运行中的搅拌速率(Njs)的图，该运行具有22. 5%的固体，使用菌株AR3 7-31和两个不同的载入酶。图7B是在相同SSF运行中的乙醇产量图。图8为显示了在使用玉米秸杆水解产物和两个不同载入酶的SSF运行中的乙醇产量的图。图9为显示了在SSF运行样品中的葡萄糖、木糖和乙醇浓度的图，该运行样品使用酵母、大肠杆菌、或运动发酵单胞菌作为生物催化剂。下列序列符合37C. F. R. I. 821-1. 825 (“对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求一序列规则”)，并且与世界知识产权组织(WIPO)标准ST. 25(1998)和EPO和PCT的序列列表要求(规则5. 2和49. 5 (a-bis)，并且行政指导的208节和附录C相一致)。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C.F.R. § I. 822中列出的规定。SEQ ID NO : I是Fv43D的氨基酸序列，其包括对应于位点I至20的预测信号序列。SEQ ID NO 2是未成熟的Fv3A的序列，其包括对应于位点I至23的预测信号序列。SEQ ID NO 3是未成熟的Fv51A的序列，其包括对应于位点I至19的预测信号序列。SEQ ID NO :4是未成熟的Xyn3的序列，其包括对应于位点I至16的预测信号序列。SEQ ID NO 5是里氏木霉(T. reesei) β -葡糖苷酶BglI的氨基酸序列。发明详沭本发明涉及原核产乙醇生物例如发酵单胞菌属在用于由纤维素生物质生产乙醇的同步糖化和发酵(SSF)方法或混合糖化和发酵(HSF)方法中的通途。由可再生资源生产用作燃料添加剂的乙醇将解决化石燃料短缺问题、降低能耗并影响全球变暖。SSF或HSF方法在乙醇生产中是优选的，因为它们提高从原料纤维素生物质到乙醇的转化过程中的总体
效率。 以下定义和缩写用于权利要求和说明书的解释。除非另外指明，本文引用的所有美国专利公开和美国专利公开申请全文以引用方式并入本文。此外，当数量、浓度或其它数值或参数以范围、优选范围或优选上限数值和优选下限数值的列表形式给出时，它应理解为具体地公开由任何范围上限或优选数值和任何范围下限或优选数值的任何一对所构成的所有范围，而无论所述范围是否被单独地公开。当本文描述数值范围时，除非另外指明，所述范围旨在包括其端点，以及所述范围内的所有整数和分数。当定义范围时，不旨在将本发明的范围限定于所列举的具体值。如本文所用，在本发明的元件或组分之前的词语“一个”、“一种”旨在表明元件或组分的实例(即出现的事物)数量为非限制性的。因此，应将“一个”和“一种”理解为包括一个(种)或至少一个(种)，并且元件或组分的词语单数形式也包括复数指代，除非有数字明显表示单数。如本文所用，术语“包含”是指如权利要求中提及的所述特征、整数、步骤或成分的存在，但它不预先排除一种或更多种其它特征、整数、步骤、成分或其组的存在或添加。术语“包含”旨在包括由术语“基本上由…组成”和“由…组成”涵盖的实施方案。类似地，术语“基本上由…组成”旨在包括由术语“由…组成”涵盖的实施方案。如本文所用，术语“约”指本发明的成分或反应物的数量变化，或用于指数值数量的变化，它们可能发生在，例如典型的测量和用于制备浓缩液或实际使用溶液的液体处理程序中；这些程序中的偶然误差中；制造、来源、或用于制备组合物或实施方法的成分的纯度的差异中；等。术语“约”还包括由于相对于由特定起始混合物所得组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否通过术语“约”来修饰，权利要求包括量的等同量。如本文所用，术语“发明”或“本发明”是非限制性术语，并且不旨在指本发明的任何单独实施方案，而是涵盖如本说明书和权利要求所述的所有可能的实施方案。术语“产乙醇生物”指通过代谢碳水化合物原料而生产乙醇的生物。术语“同步糖化和发酵(SSF) ”指生物质被糖化并且同时糖化产生的可发酵糖通过生物催化剂被用于产生某种产物的方法，其通常在相同反应容器中进行。术语“混合糖化和发酵(HSF) ”指生物质被糖化至有限程度(不完全或部分糖化)，随后继续糖化和发酵同时进行的方法。术语“可发酵糖”指在发酵过程中能被微生物用作碳源的低聚糖和单糖。术语“部分糖化”指生物质的有限糖化，其中释放的可发酵糖少于如果糖化完全的话将释放的总可发酵糖。术语“纤维质”指包含纤维素和包括半纤维素和木质素在内的附加组分的组合物。术语“糖化”指由多糖产生可发酵糖。术语“预处理的生物质”是指在糖化之前已经经过预处理的生物质。“生物质”指任何纤维质的或木质纤维质的材料并包括包含纤维素的，并且任选地还包含半纤维素、木质素、淀粉、低聚糖和/或单糖的材料。生物质也可包含附加组分例如蛋白质和/或脂质。生物质可来源于单一来源，或者生物质可包括来源于一种以上来源的混合物；例如，生物质可包括玉米芯和玉米秸杆的混合物，或草和叶片的混合物。生物质包括但不限于生物能作物、农业残余物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、来自造纸业的淤渣、庭院垃圾、木材和林业垃圾。生物质的实例包括但不限于玉米芯、作物残余例如玉米壳、玉米秸杆、草、小麦、小麦秸杆、大麦秸杆、干草、稻杆、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱，得自谷物、树、枝、根、叶、木屑、锯末、灌木及灌丛、蔬菜、水果、花和动物粪肥的研磨物的组分。“生物质水解产物”指来源于生物质糖化的产物。也可在糖化前经预处理的生物质。术语“糖化酶”指能够催化生物质组分转化成可发酵糖的酶。如果生物质为预处理的，所述酶通常更有效。术语“不溶性固体”指不溶于溶液的固体。术语“总输入不溶性固体”指在糖化-发酵混合物中包括的生物质不溶性固体的总干重。当将生物质以多个部分加入时，每部分不溶性固体的干重相加得到总输入不溶性固体。在糖化-发酵混合物中的不溶性固体的浓度用基于每升干重计的％表示，是指每升总糖化-发酵混合物的干重克数，因此例如基于每升干重计16%指每升总糖化-发酵混合物干重为160克。术语“搅拌装置”指可通过其施用功率于混合物以混合该混合物组分的机构。通常有一个旋转运动的机构通过搅拌装置进行混合。除非另外特别说明，当本文提供数值范围时，应理解它涵盖范围的端点。应理解，数值具有由有效数字位数提供的精度。例如，应将数值I理解为涵盖O. 5至I. 4的范围,而应将数值I. O理解为涵盖O. 95至I. 04的范围，包括所述范围的端值。本发明涉及在SSF方法中使用发酵单胞菌属菌株来生产乙醇的方法。所述方法如下进行在至少一种糖化酶的存在下，在低速搅拌能量条件下预处理纤维素生物质并在糖化-发酵混合物中包括高浓度不溶性固体，所述糖化-发酵混合物包含发酵单胞菌属产乙醇生物。所得方法可产生超过60g/L的乙醇。预处理过的牛物质本发明方法的生物质可通过任何方法来预处理，所述方法使生物质在糖化期间有效释放可发酵糖。预处理是本领域熟知的并且包括例如用酸性或碱性化学制品处理和/或机械处理以减小尺寸。预处理的生物质包含不溶性固体、多糖(其通常是不溶性固体的一部分)和其它组分，所述其它组分包括一些抑制发酵单胞菌属生长和乙醇生产的组分。期望在本发明方法中使用的经预处理的生物质具有足够低的发酵抑制剂含量以使在包含经预处理的生物质的糖化-发酵混合物中原核产乙醇生物如发酵单胞菌属的生长和生产最大化。
例如，乙酸是经预处理的生物质的组分，它抑制发酵单胞菌属。可通过洗涤经预处理的生物质来降低经预处理的生物质中的乙酸含量以除去乙酸和其它抑制剂。作为另外一种选择，特定的预处理可导致乙酸含量与发酵单胞菌属生长和生产相容。在预处理中使用氨可导致经预处理的生物质中的抑制剂例如乙酸的含量降低。申请人已经发现氨处理的生物质可具有大于约I的乙酰胺/乙酸根的摩尔比以及大于60%，例如大于约65%，或大于约70%的乙酰基转化率。因此由于抑制剂浓度降低，过滤和洗涤步骤不是获得改善的糖收率所必需的，并且因为与这些步骤相关联的成本可对所述方法的经济性产生不利影响，优选地不进行生物质的过滤和洗涤。因此在本发明方法中优选使用氨预处理的生物质。按照在共有的美国专利公开7，781，191中公开的预处理方法，优选地使用相对于生物质干重小于约12重量％的氨浓度。此外，不同的发酵单胞菌属或其它产乙醇生物菌株可具有对经预处理的生物质中 存在的乙酸和/或其它抑制剂的不同耐受性水平。发酵单胞菌属菌株可对例如4_5g/L的乙酸水平敏感。此外，可制备具有改善的乙酸耐受性的发酵单胞菌属菌株，例如通过在共有的和共同未决的美国专利申请公布US 2009-0203099A1中公开的基因工程制备上述菌株。此外，可通过适应包含乙酸的培养基获得改善的乙酸耐受性，这公开于共有的和共同未决的美国专利申请12/641642中，该专利申请以WO 2010/075241公布，其以引用方式并入本文。使用该公开适应方法制备的发酵单胞菌属菌株对至少约9-10g/L的乙酸具有合适的耐受性。为了最大化发酵单胞菌属的生长和乙醇产量，在包含糖化-发酵混合物的经预处理的生物质中的乙酸水平与用于乙醇生产的发酵单胞菌属菌株的乙酸耐受性水平之间存在相容性，其基于发酵单胞菌属菌株的耐受性水平，其中耐受性指菌株在具有特定乙酸水平的培养基中生长并制备乙醇的能力与在具有更少乙酸或无乙酸的培养基中生长并制备乙醇的能力相似。同步糖化和发酵本发明方法涉及同步糖化和发酵(SSF)。制备糖化-发酵混合物，其包括预处理的生物质、原核产乙醇生物和至少一种酶，所述酶将经预处理的生物质的多糖转化成可发酵糖。附加的培养基组分例如糖、盐、生长增强剂、和/或对应于产乙醇生物细胞中的抗生素抗性基因的抗生素通常不是必需的，但是可包括它们。通过一种或更多种糖化酶将经预处理的生物质的组分糖化、或水解以释放可发酵糖如葡萄糖和木糖。从预处理的生物质中逐渐释放糖。通过产乙醇生物代谢释放的糖以产生乙醇作为产物。糖化糖化酶参见Lynd, L. R.等人(Microbiol. Mol. Biol. Rev.，66 :506-577, 2002)。使用至少一种酶，并且通常使用糖化酶聚生体，其包括一种或更多种糖苷酶。糖苷酶水解二糖、低聚糖和多糖的醚键，并且存在于广义“水解酶”(EC 3.)的酶分类EC 3. 2. I. X (EnzymeNomenclature 1992, Academic Press, San Diego, CA,以及增补 I (1993)、增补 2 (1994)中、增补 3(1995、增补 4(1997)和增补 5[分别在 Eur. J. Biochem. ”，223 :1_5，1994 ;“Eur.J. Biochem. ”，232 :1_6，1995 ;“Eur. J. Biochem. ”，237 :1_5，1996 ;“Eur. J. Biochem. ”,250 :1-6，1997 ;和 “Eur. J. Biochem. ”，264 :610-650 1999 中])中。本发明的方法中可用的糖苷酶能根据它们水解的生物质组分进行分类。可用于本发明方法中的糖苷酶包括纤维素水解糖苷酶(例如，纤维素酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶)、半纤维素水解糖苷酶(例如木聚糖酶、内切木聚糖酶、外切木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯木聚糖酶、甘露聚糖酶、半乳糖酶、果胶酶、葡糖醛酸糖苷酶)和淀粉水解糖苷酶(例如淀粉酶、α -淀粉酶、β -淀粉酶、葡糖淀粉酶、α -葡糖苷酶、异淀粉酶)。此外，它可用于将其它活性加入到糖化酶聚生体中，例如肽酶(EC 3. 4. X. y)、脂肪酶(EC 3. I. I. x和3. I. 4. X)、木素酶(EC I. 11. I. X)和阿魏酸酯酶(EC3. I. I. 73)以有助于从生物质的其它组分中释放多糖。本领域熟知的生产多糖水解酶的微生物常常表现出某种活性，例如纤维素降解，该活性由多种酶或一组具有不同底物特异性的酶(或“酶聚生体”)催化。因此，来自微生物的“纤维素酶”可包括一组酶、一种或更多种酶或所有酶，它们都可有助于纤维素降解活性。取决于获取酶制剂时利用 的纯化方案，商业或非商业酶制剂，如纤维素酶，可包括多种酶。糖化酶可以分离形式商购获得,例如Spezyme CP纤维素酶(Danisco US, Inc.,Rochester, NY)和Multifect 木聚糖酶(Danisco US, Inc.)。此外糖化酶可为未纯化的并以细胞提取物或完整细胞制剂的形式提供。可使用已经经工程化以表达多个糖化酶的重组微生物制备所述酶。本领域的技术人员将懂得如何测定在本发明的SSF方法中使用的酶的有效量，以及如何调节条件以在SSF中获得最佳酶活性。本领域的技术人员也将懂得如何优化此类酶的所需活性，以在选择条件下获得给定经预处理的生物质的最佳糖化效果。混合糖化和发酵此外，本发明的方法可进行为混合糖化和发酵(HSF)。在这个方法中糖化在发酵前一段时间发生，其中发生部分而非完全的糖化。在这个方法中在经预处理的生物质和糖化酶混合后一段时间加入产乙醇生物以便在未进行发酵的情况下发生一些糖化。在加入产乙醇生物前的时间段可不同并且通常在一小时至多个小时的范围内，以便释放可发酵糖并在加入产乙醇生物时已经呈现期望的浓度。在实施例4中例示了 HSF，其中在加入糖化酶一小时后加入发酵单胞菌属细胞。原核产乙醇牛物本发明的糖化-发酵混合物最初包括来自原核产乙醇生物菌株的种子细胞种菌。高效生产乙醇的任何原核细胞可被用作产乙醇生物。使用的细胞可天然产生乙醇、经工程化以产生乙醇、或者可为经工程化以具有改善乙醇产量的天然乙醇生产者。原核产乙醇生物的实例包括但不限于梭菌属(Clostridium) (Stevenson和Weimer (2005)Appliedand Environmental Microbiology 71 :4672-4678)、经工程化以生产乙醇的大肠杆菌菌株(US 5，000，000)、经工程化以生产乙醇的嗜热葡糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillusthermoglucosidasius)菌株(Cripps 等人(2OO9)Metabolic Engineering 11 :398-408) >经工程化以生产乙醇的产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)菌株(Ohta等人(1991)Applied and Environmental Microbiology 57 :2810-2815)、发酵杆菌属(Zymobacter)(Yanase 等人(2007) Appl. Environ. Mirobiol. 73 :2592-2599)、以及发酵单胞菌属。优选的原核产乙醇生物是发酵单胞菌属，它天然发酵葡萄糖以产生乙醇。发酵单胞菌属菌株已经经工程化以用于木糖利用率(美国专利公开5，514，583,5, 712，133、6，566，107、PCT 专利申请号 WO 95/28476，Feldmann 等人(1992) Appl MicrobiolBiotechnol 38:354-361，Zhang 等人(1995) Science 267 :240-243)，它可用于本发明的方法。已经通过基因工程和/或适应制备出具有改善的与乙醇产量相关的特性的发酵单胞菌属菌株。优选地是具有多个工程化和/或适应改善的发酵单胞菌属菌株，其用于本发明方法中以最大化乙醇产量。已经进行了可存在的改善，其包括但不限于1)工程化并适应改善的木糖利用率(美国专利公开7，223，575和共有的美国专利公开7，741，119、US-2009-0246876A1和US-2009-024 6846A1) ；2)减少不利于乙醇生产的副产物的合成(共有的US 7，741，119) ；3)工程化以改善乙酸耐受性(共有的和共同未决的美国专利申请公布US2009-0203099A1，以及公布为 WO 2010/075241 的美国专利申请 12/641642)。如WO 2010/075241中公开的方法制备的具有改善的乙酸耐受性的发酵单胞菌属菌株优选地用于本发明方法。由于使用这些菌株，在本发明的糖化-发酵混合物中可包括高浓度的经预处理的生物质，同时保留不妨害乙醇生产的乙酸水平，不需要进行大量的洗涤以从经预处理的生物质中除去乙酸。通常期望的发酵单胞菌属菌株作为种子培养物进行培养。种子培养物可例如在由以下组分组成的培养基中生长5-20g/L的酵母提取物，2-4g/L的磷酸氢二钾，l-5g/L的硫酸镁七水合物和100-200g/L的葡萄糖，所述培养物在32°C -33°C,pH 5. 5-5. 8的上述培养基中生长至0D600nm为10。种子培养物用于启动SSF，其加入体积等同于糖化-发酵混合物体积的约10%。SSF中的不溶件固体为了最大化SSF中的乙醇产量，在糖化-发酵混合物中包括高水平的存在于经预处理的生物质中的不溶性固体量。经预处理的生物质中包括的不溶性固体量与在SSF期间可生成的可发酵糖量相关联，它继而关联可从发酵单胞菌属细胞中代谢可发酵糖生成的乙醇量。取决于所用的特定预处理以及是否包括任何洗涤步骤，相对于经预处理的生物质制剂中的固体量的不溶性固体量将不同。洗涤将增溶不溶解的固体，在总固体中留下较高的不溶性固体百分比。一些酸预处理可将多达30%的未预处理的生物质固体转化成可溶固体,从而留下的总固体的70 %为不溶性固体。与之相反，用低氨预处理的固体量和不溶性固体量在经预处理的生物质中可能是相似的。相对于经预处理的生物质样品中的总固体的不溶性固体量通常可在约70%至约99%的范围内。例如，在本文实施例中使用的低氨预处理的生物质中，不溶性固体占总固体的90% -91%。在本发明的方法中，糖化-发酵混合物包括的来自经预处理的生物质的总输入不溶性固体量对原核产乙醇生物的乙醇生产的输入功率效应是重要的。在本发明的方法中，糖化-发酵混合物中载入的不溶性固体总量为每升总糖化-发酵混合物至少约160克干重或16%。为了辅助混合糖化-发酵混合物，可将经预处理的生物质分成两个或更多个部分加入。当加入初始部分时，不溶性固体浓度可小于16%。在较低的不溶性固体浓度下调节PH和温度有促进作用。然后可加入附加的经预处理的生物质使得总输入不溶性固体重量为至少约16%。可在载入酶和/或发酵单胞菌属之前或之后加入附加的生物质。可将附加的生物质分成一个或更多个部分加入。载入的总输入不溶性固体可为至少约16%、17%、18%、19%、20%、21%、24%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、或更高，包括所述列出数值间的任何整数。
随着SSF运行进行，由于SSF中存在的糖化酶糖化经预处理的生物质，不溶性固体量降低。在给定的SSF运行约120小时后，不溶性固体通常可减少至约一半、或更少的初始量。搅拌装置的功率在生物反应器中使用搅拌装置搅拌糖化-发酵混合物以混合组分，所述组分包括经预处理的生物质、糖化酶、发酵单胞菌属细胞、以及任选的其它培养基组分。申请人已经发现当在包含例如约25%或更多不溶性固体的糖化-发酵混合物的搅拌中提供高能量时，发酵单胞菌属产乙醇生物的乙醇产量受到负面影响。剧烈振荡(200RPM)具有25%不溶性固体浓度的混合物导致乙醇产量和发酵单胞菌属活力降低，而剧烈振荡具有12%固体的混合物无此类效应。
因此在SSF期间需要混合，然而需要保持发酵单胞菌属细胞的乙醇生产能力。如本文实施例5所述，申请人已经计算出搅拌器可提供给包含发酵单胞菌属产乙醇生物和至少约22. 5%不溶性固体的糖化-发酵混合物的功率以维持期望的乙醇产量。在本发明的方法中进行混合，其中通过搅拌装置提供的功率不超过约O. 2瓦特每千克总糖化-发酵混合物。对于最大化乙醇产量，优选的输入功率小于约O. 2、0. 15,0. 1、0. 05、0. 01、0. 005、或O. 003瓦特/kg总糖化-发酵混合物。搅拌装置可为任何旋转搅拌器，包括任何类型的叶轮如Rushton(6叶片)和任何类型的斜叶桨(船用式、4叶片、3片段)。可使用两种或更多种叶轮叶片，其中单个叶轮功率的总和小于约O. 2瓦特/kg。功率可随时间变化，因为糖化-发酵混合物的粘度由于生物质的糖化而降低。此外，发现在粒度范围介于100 μ m和600 μ m之间的玻璃小珠的存在下，当进行剧烈搅拌时发酵单胞菌属的乙醇生产性能降低。因此当生物质粒度在这一范围内时，如上所述减少搅拌以最大化乙醇产量。当生物质粒度小于约100 μ m或大于约600 μ m时,可使用剧烈搅拌。然而，经预处理的生物质初始可为较大粒度，但是粒度减小可在SSF运行期间发生。任何类型的生物质的粒度可对发酵单胞菌属细胞产生效应，如玻璃小珠所示。SSF的条件在具有搅拌装置的生物反应器中保留糖化-发酵混合物以生产乙醇。保持有利于发酵单胞菌属糖化并发酵的条件。通常使用苛性溶液(例如氢氧化铵、氢氧化钾、或氢氧化钠)以及或者硫酸或者磷酸将PH保持在约5和约7之间。通常使用NaOH作为碱并使用H2SO4作为酸将pH保持在5. 8。温度保持在约28°C和约37°C之间。通常温度保持在约33°C或在33°C和约28°C之间变化。SSF持续至少约40小时，通常120小时或更长时间为一次运行。所述运行可为分批形式的，其中进行极小的改变如pH调节，或者可为分批补料形式的，其中当进行SSF时将组分给料于糖化-发酵混合物。分批和分批补料培养方法在本领域内是常用的且熟知的，并且实例可见于Biotechnology :A Textbook of IndustrialMicrobiology, Crueger, Crueger,和 Brock,第二版(1989) Sinauer Associates, Inc.(Sunderland, MA)或 Deshpande, Mukund V. ,Appl. Biochem. Biotechnol. ,36,227, (1992)。在本发明方法中在分批补料运行中可加入的组分可包括附加的经预处理的生物质和/或附加的糖化酶。乙醇浓度
使用本发明方法可获得高乙醇产量。在本发明SSF方法中产生的特定乙醇量将取决于以下条件而不同，如使用的具体发酵单胞菌属菌株、生物质类型、生物质预处理方法、不溶性固体浓度和糖化酶。通常可生产大于约40g/L的乙醇。生产的乙醇可为例如约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、或约85g/L。
实施例本发明将在以下实施例中得到进一步阐述。应该理解，尽管这些实施例说明了本发明的优选实施方案，但仅是以例证的方式给出的。通过上述论述和这些实施例，本领域的技术人员可确定本发明的必要特征，并且在不脱离本发明的实质和范围的前提下，可对本发明进行各种变化和修改以使其适应多种用途和条件。使用的缩写词的含义如下“min”指分钟，“h”指小时，“ μ L”指微升，“mL”或“ml”指毫升，“L”指升，“nm”指纳米，“mm”指毫米，“cm”指厘米，“ μ m”指微米，“mM”指毫摩尔每升，“M”指摩尔，“mmol ”指毫摩尔，“ μ mole”指微摩尔，“g”指克，“ μ g”指微克，“mg”指毫克，“kg”指千克，“g”指引力常数，“RPM”或“rpm”指每分钟转数，“h. p. ”指马力，”为体积％，“atm”指大气，“”为重量百分比，“CFU”为菌落形成单位数，“ ”指大约，“hr”指小时，“ P ”指密度，“ μ ”指粘度，“D/’指叶轮直径，“RPS”指每秒转数，“EFT”指过去的发酵时间。一般方法适合细菌培养物维持及生长的材料和方法在领域内也是众所周知的。适用于下面实施例的技术可存在于以下文献中Manual of Methods for GeneralBacteriology,Phillipp Gerhardt,R. G. E. Murray,Ralph N. Costilow,Eugene ff. Nester,Willis A. Wood, Noel R. Krieg 和 G. Briggs Phillips,编辑，American Society forMicrobiology(Washington, DC. ) 1994,或者 Thomas D. Brock 在 Biotechnology 中的 A Textbook of Industrial Microbiology,第二 版，Sinauer Associates, Inc.(Sunderland, MA) 1989。使用的用于细菌细胞生长和维持的所有试剂和材料均得自 Aldrich Chemicals(Milwaukee, WI)> BD Diagnostic Systems(Sparks, MD) > LifeTechnologies (Rockville,MD)或Sigma Chemical Company (St. Louis,MO),除非另外说明。芯的预处理将玉米芯在酶水解之前进行预处理，所述预处理使用如共有的美国专利公开7，781，191中所述的低氨方法。使用水平Littleford Day 130L反应容器进行预处理以生成称为SSL21的预处理芯，所述反应容器包含围绕容器主体用于传输蒸汽的夹套。容器载入来自加工种子谷物(尺寸小于Imm)的芯以达到基于湿芯的46￥%的反应器填充度(57. 51bs)。使用大型微粒粉磨机(Model#lSH, Serial#10019),用I. Omm的筛网将所述芯减小到小于Imm的尺寸。在碾磨前按需加入一匙干冰到所述芯中以防止设备升温。微粒粉磨机的主要驱动装置是5h. p.马达，其最大转速为9，600RPM。它有六个旋转锤；壳，并且沿相对作用边排列。所述芯具有0. 420g/cm3的松散湿堆积密度和7. 5重量％的水分。在加入28. 9重量％的氢氧化铵溶液(11. 21bs)和水(20. Ilbs)到靠近容器顶部以提供容器中相对于生物·质干重6重量％的順3和60重量％的固体之前向容器施加真空以达到0. latm。表I列出了用于二次预处理批(称为SSL22)的芯特性和氢氧化铵与水的量。在两种情况下，均将反应器搅拌器设为70rpm并且蒸汽通过容器的夹套。当容器达到内部温度80°C时，将蒸汽导入靠近容器顶部以提高容器内部温度至145°C。保持这一温度20分钟。在保持15分钟后，停止流经夹套的蒸汽流。在预处理末期，通过排气冷凝器将反应器压力降至大气压。随后，在打开容器的底部阀门并回收经预处理的生物质之前，施加真空(大约小于latm) 15分钟以将温度降至小于60°C并从预处理芯中除去多余的氨和水。表2列出了 SSL21和SSL22批的预处理芯规程。期望小于O. 3kg順3/1001^干固体的残余氨以及大于1.0的乙酰胺对乙酸比率。测得SSL21芯预处理批的不溶性固体为总固体的90% -91 %。表I:用于二次预处理批(SSL 22)的芯特性和氢氧化铵与水的暈。
权利要求
1.用于生产乙醇的方法，包括 a)提供包含不溶性固体和多糖的经预处理的生物质； b)提供至少一种用于将多糖转化成可发酵糖的糖化酶； c)提供原核产乙醇生物； d)在包括搅拌装置的生物反应器中制备糖化-发酵混合物，其包含a)的经预处理的生物质、b)的糖化酶、和c)的原核产乙醇生物；以及 d)在所述糖化-发酵混合物中使所述原核产乙醇生物生长，其中在所述糖化-发酵混合物中的总输入不溶性固体的浓度基于每升干重计为至少约16%，并且其中所述原核产乙醇生物产生乙醇。
2.权利要求I的方法，其中所述搅拌装置提供不超过约O.2瓦特/kg总糖化-发酵混合物的功率。
3.权利要求I的方法，其中所述原核产乙醇生物是选自下组的属的成员发酵单胞菌属、发酵杆菌属、梭菌属、埃希氏菌属、克雷伯氏菌属和地芽孢杆菌属。
4.权利要求I的方法，其中所述搅拌装置包括至少一个叶轮。
5.权利要求I的方法，其中c)的产乙醇生物在加入b)的糖化酶后已经发生部分糖化的时间加入。
6.权利要求I的方法，其中经预处理的生物质以至少两份被加入，所述至少两份联合提供基于每升干重计至少约16%的总输入不溶性固体浓度。
7.权利要求I的方法，其中在所述糖化-发酵混合物中的总输入不溶性固体的浓度基于每升干重计为至少约20%。
8.权利要求I的方法，其中所述原核产乙醇生物耐受所述糖化-发酵混合物中的乙酸浓度。
9.权利要求I的方法，其中生物质选自柳枝稷、废纸、来自造纸业的淤渣、玉米芯、玉米壳、玉米稻杆、草、小麦、小麦稻杆、干草、大麦稻杆、稻杆、甘鹿洛、高粱、得自谷物、树、枝、根、叶、木屑、锯末、灌木及灌丛、蔬菜、水果、花和动物粪肥的加工的组分。
10.权利要求I的方法，其中所述经预处理的生物质通过用氨处理纤维素生物质而制成。
11.权利要求10的方法，其中所述氨相对于生物质的干重为小于约12重量％。
12.权利要求I的方法，其中所述至少一种糖化酶选自纤维素水解糖苷酶和半纤维素水解糖苷酶。
13.权利要求I的方法，其中所述至少一种糖化酶是酶聚生体中的一员。
14.权利要求13的方法，其中所述糖化酶聚生体包含选自以下的酶纤维素酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β -葡糖苷酶、木聚糖酶、内切木聚糖酶、外切木聚糖酶、β -木糖苷酶、阿拉伯木聚糖酶、甘露聚糖酶、半乳糖酶、果胶酶、葡糖醛酸糖苷酶、淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、α -葡糖苷酶、异淀粉酶、肽酶、脂肪酶、木素酶和阿魏酸酯酶。
15.权利要求I的方法，其中所述多糖包括木聚糖和葡聚糖。
16.权利要求I的方法，其中所述可发酵糖包括木糖和葡萄糖。
17.权利要求I的方法，其中所述产生的乙醇的浓度为至少约40g/L。
18.用于生产乙醇的方法，包括 a)提供粒度等于或小于约100μ m或粒度等于或大于约600 μ m的经预处理的生物质，其包含不溶性固体和多糖； b)提供至少一种用于将多糖转化成可发酵糖的糖化酶； c)提供原核产乙醇生物； d)在包括搅拌装置的生物反应器中制备糖化-发酵混合物，其包含a)的经预处理的生物质、b)的糖化酶、和c)的原核产乙醇生物；以及 e)在所述糖化-发酵混合物中使所述原核产乙醇生物生长,其中 1)在所述糖化-发酵混合物中的总输入不溶性固体的浓度基于每升干重计为至少约16% ;并且 2)其中所述原核产乙醇生物产生乙醇。
19.权利要求18的方法，其中所述原核产乙醇生物是选自下组的属的成员发酵单胞菌属、发酵杆菌属、梭菌属、埃希氏菌属、克雷伯氏菌属和地芽孢杆菌属。
20.糖化-发酵体系，包括 a)包含不溶性固体和多糖的经预处理的生物质； b)至少一种用于将多糖转化成可发酵糖的糖化酶；和 c)原核产乙醇生物； 其中(a)、(b)和(C)的生物质、酶和产乙醇生物在糖化-发酵混合物中混合，所述混合物具有基于每升干重计至少约16%的总输入不溶性固体浓度。
21.权利要求20的体系，其中(a)、(b)和(C)的生物质、酶和产乙醇生物被包含在生物反应器中，所述生物反应器包括提供不超过O. 2瓦特/kg总糖化-发酵混合物的功率的功能性搅拌装置。
22.权利要求20的糖化-发酵体系，其中所述原核产乙醇生物选自发酵单胞菌属、发酵杆囷属、fe囷属、埃希氏囷属、克雷伯氏囷属和地牙抱杆囷属。
全文摘要
本发明公开了使用发酵单胞菌属作为产乙醇生物从生物质中生产高浓度乙醇的方法。在用于生产高浓度乙醇的同步糖化和发酵反应期间，使发酵单胞菌属在低叶轮搅拌、糖化-发酵混合物中的不溶性固体的高浓度条件下生长。
文档编号C12P7/06GK102933714SQ201080059411
公开日2013年2月13日 申请日期2010年12月22日 优先权日2009年12月23日
发明者W·D·希茨, T·黄, A·K·艾弗森, B·G·勒菲弗尔, C·米钦森 申请人:纳幕尔杜邦公司