用于cd34-阴性干细胞的扩增培养基的制作方法

专利名称：用于cd34-阴性干细胞的扩增培养基的制作方法
用于CD34-阴性干細胞的扩增培养基本申请要求2009年12月23日提交的申请号为61/289，796的美国临时申请的优先权,其全部内容通过引用并入本文。本申请通篇引用了不同的出版物。这些出版物的公开内容在此通过引用并入本申请，以便更全面地描述本发明涉及的技术现状。
背景技术：
来源于骨髓和脐血的人类非造血干细胞越来越多地被用作用于患者的再生和免疫调节指征的间充质细胞。在全球范围内已经利用间充质干细胞实施了超过80例临床试
验。几乎所有的研究人员都使用含胎牛血清(FBS)的培养基作为标准血清补充物。FBS是牛源的，可以传播TSE(即可传播性海绵状脑病)和刺激接受者的免疫应答。只有无BSE的牛被权威机构核准用于人类(新西兰)，研究人员正努力研发用于促进细胞生长的替代方法。由于细胞疗法很可能在未来几年将被越来越多地使用，随之而来的将是FBS的短缺。ー些公司已经研发了无血清培养基。但是这些培养基显示出比理想的生长速率低的生长速率，骨髓源性CD34-阴性干细胞的形态和性质在这些培养基中不能如在含FBS培养基中那样广泛表征。人类凝血细胞(即血小板)已经被其他研究人员用作新鲜冰冻血浆(FFP)，用作促生长成分。血小板及其用于再生医学的潜在意义由Stellos和Gawaz,以及Langer和Gawaz分别评述。关于使用血小板或FFP的干细胞扩增可提及本领域的下列具体教导。Schallmoser等人公开了使用血小板裂解物的间充质干细胞扩増。Capelli等人公开了未过滤的人类血小板裂解物用于扩增和生产间充质基质细胞的用途。Kocaoemer等人公开了人类AB血清和凝血酶激活的富血小板血浆在扩增来自脂肪组织的间充质干细胞中的用途。Muller等人公开了用于分离和扩增来自人类骨髄的多潜能间充质基质细胞的无动物血清培养条件，所述条件使用FFP和血小板两者。Blande等人公开了脂肪组织间充质干细胞在无动物血清培养基中的扩增，所述无动物血清培养基中补充有已经无菌过滤的人自体血小板裂解物。而且，SalvadS等人公开了血小板裂解物在培养间充质基质细胞中的用途，其中所述裂解物是无菌过滤的。尽管血小板裂解物和FFP用于培养间充质干细胞的已知用途，仍然存在未满足的需求，即更快速、更低廉和更安全地以稳定方式培养这种细胞，同时保留其以后在需要时进行分化的能力。

发明内容
本发明提供了一种细胞生长培养基，其包含(a)无直径大于O. 22 μ m的固体物质的人类血小板裂解物，其中所述裂解物构成所述细胞生长培养基的总体积的2%至15% ；
(b)无直径大于O. 22 μ m的固体物质的人类新鲜冰冻血浆(FFP)滤出物，其中所述FFP滤出物构成所述细胞生长培养基的总体积的1%至10% ；(c)浓度为所述细胞生长培养基的OU/ml至10U/ml的肝素；(d)浓度为O. 5mM至IOmM的L-谷氨酰胺；和(e)适用于哺乳动物细胞生长的无血清低葡萄糖培养基，其中所述无血清低葡萄糖培养基构成所述细胞生长培养基的总体积的75%至97%，且可以包含部分(d)的L-谷氨酰胺；其中所述细胞生长培养基允许人类CD34_干细胞的扩增，所得经扩增的CD34_干细胞保持分化的能力。本发明还提供了一种细胞生长培养基补充物，其包含
(a)无直径大于O. 22 μ m的固体物质的人类血小板裂解物，其中所述裂解物构成所述细胞生长培养基补充物的总体积的17%至94% ;和(b)无直径大于O. 22 μ m的固体物质的人类新鲜冰冻血浆(FFP)滤出物，其中所述FFP滤出物构成所述细胞生长培养基补充物的总体积的6%至83% ；其中在将所述细胞生长培养基补充物与肝素和含L-谷氨酰胺的、适用于哺乳动物细胞生长的无血清低葡萄糖培养基组合，从而构成细胞生长培养基时，所得到的细胞生长培养基允许人类CD34_干细胞的扩增，且所得经扩增的CD34_干细胞保持分化的能力，所述细胞生长培养基包含(i)3体积％至25体积％的细胞生长培养基补充物；(ii)浓度为OU/ml至10U/ml的肝素；和(iii)浓度为O. 5mM至IOmM的L-谷氨酰胺。本发明另外提供了ー种无直径大于O. 22 μ m的固体物质的人类血小板裂解物，其中根据下列步骤制备所述血小板裂解物(i)冷冻血小板浓缩物,从而使其中的血小板裂解；(ii)融化得到的经裂解的血小板；(iii)以适合使其中的固体物质成丸的速度和持续时间离心融化的经裂解的血小板；(iv)以适合使其中的固体物质成丸的速度和持续时间再次离心来自步骤(iii)的上清液；和(V)使用孔径渐减的过滤器至少两次过滤来自步骤(iv)的上清液，其中使用具有至少5 μ m的孔的过滤器实施第一次过滤，和使用具有不大于O. 22 μ m的孔的过滤器实施最后一次过滤。本发明还另外提供了ー种无直径大于O. 22 μ m的固体物质的人类新鲜冰冻血浆(FFP)滤出物，其中根据下列步骤制备所述FFP滤出物⑴融化FFP ；(ii)以适合使其液体部分和固体部分分离的速度和持续时间离心融化的FFP ;和(iii)使用孔径渐减的过滤器至少两次过滤得到的液体部分，其中使用具有至少5 μ m的孔的过滤器实施第一次过滤，和使用具有不大于O. 22 μ m的孔的过滤器实施最后ー次过滤。本发明还提供了ー种用于扩增人类⑶34_干细胞的试剂盒，其在分开的区室中包含
(a)无直径大于O. 22 μ m的固体物质的人类血小板裂解物，和(b)无直径大于O. 22 μ m的固体物质的人类新鲜冰冻血浆(FFP)滤出物，其中⑴所述裂解物构成(a)和(b)合并的体积的17%至94%; (ii)所述FFP滤出物构成(a)和(b)合并的体积的6%至83%，和(iii)在将所述裂解物和所述滤出物与肝素和含L-谷氨酰胺的、适用于哺乳动物细胞生长的无血清低葡萄糖培养基组合，从而构成细胞生长培养基时，所得到的细胞生长培养基允许人类CD34_干细胞的扩增，且所得经扩增的CD34—干细胞保持分化的能力，其中(i)所述试剂盒的内容物构成所述培养基体积的3%M 25% ;和(ii)肝素的浓度为OU/ml至I OU/ml 0本方明还提供了ー种物质组合物，其包含(a)人类⑶34_干细胞和(b)上述任意 实施方式的主题细胞生长培养基。本发明另外提供了一种用于制备无直径大于O. 22 μ m的固体物质的人类血小板裂解物的方法，其包括下列步骤(i)冷冻血小板浓缩物,从而使其中的血小板裂解；(ii)融化得到的经裂解的血小板；(iii)以适合使其中的固体物质成丸的速度和持续时间离心融化的经裂解的血小板；(iv)以适合使其中的固体物质成丸的速度和持续时间再离心来自步骤(iii)的上清液；和(V)使用孔径渐减的过滤器至少两次过滤来自步骤(iv)的上清液，其中使用具有至少5 μ m的孔的过滤器实施第一次过滤，和使用具有不大于O. 22 μ m的孔的过滤器实施最后一次过滤。本发明还另外提供了一种用于制备无直径大于0.22 μ m的固体物质的人类新鲜冰冻血浆(FFP)滤出物的方法，其包括下列步骤⑴融化FFP ；(ii)以适合使其液体部分和固体部分分离的速度和持续时间离心融化的FFP ;和(iii)使用孔径渐减的过滤器至少两次过滤得到的液体部分，其中使用具有至少5 μ m的孔的过滤器实施第一次过滤，和使用具有不大于O. 22 μ m的孔的过滤器实施最后ー次过滤。本发明还提供了一种用于制备细胞生长培养基的方法，其包括组合下列物质的步骤(a)无直径大于O. 22 μ m的固体物质的人类血小板裂解物，其中所述裂解物构成所述细胞生长培养基的总体积的2%至15% ；(b)无直径大于O. 22 μ m的固体物质的人类新鲜冰冻血浆(FFP)滤出物，其中所述FFP滤出物构成所述细胞生长培养基的总体积的1%至10% ；(c)其量足够产生所述细胞生长培养基的OU/ml至10U/ml的浓度的肝素；(d)其量足够产生O. 5mM至IOmM的浓度的L-谷氨酰胺；和(e)适用于哺乳动物细胞生长的无血清低葡萄糖培养基，其中所述无血清低葡萄糖培养基构成所述细胞生长培养基的总体积的75%至97%，且所述无血清低葡萄糖培养基可包含部分(d)的L-谷氨酰胺；
其中所述细胞生长培养基允许人类CD34_干细胞的扩增，所得经扩增的CD34_〒_胞保持分化的能力。本发明提供了ー种用于扩增人类CD34_干细胞群的方法，其包括在适当的温度下在主题细胞生长培养基中培养所述干细胞的步骤。本发明还提供了一种人类CD34_干细胞，其⑴具有分化的能力，和(ii)由人类CD34_干细胞群的扩增获得，其中所述扩增包括在适当的温度下在主题细胞生长培养基中培养所述干细胞群。最后，本发明提供了人类CD34_干细胞群，其⑴具有分化的能力，和(ii)由人类CD34_干细胞群的扩增获得，其中所述扩增包括在适当的温度下在主题细胞生长培养基中培养所述干细胞群。


IS I在不同组成的培养基中MSC的倍增时间。IS 2在不同培养基中MSC的增殖速率。IS 3在Bio-I中MSC生长的动力学。图4MSC特异性表面蛋白质的表达。图5通过流式细胞仪对MSC种群的分析。左侧在IMDM+20% FBS中培育的MSC ;右侧在Bio-I中培育的MSC。S 6Bio-I中MSC生长的诱导分化。S 7MSC的倍增时间(天)。红(柱4-6):用FFP培养的MSC的倍增时间，所述FFP通过至少40 μ m的过滤器或具有更小孔径的过滤器过滤。蓝(柱1-3):用没有过滤或者仅通过100 μ m的过滤器过滤的FFP培养的MSC的倍增时间。S 8在12天后达到的倍增量。红(柱4-6):用FFP培养的MSC达到的倍増，所述FFP通过至少40 μ m的过滤器或具有更小孔径的过滤器过滤。蓝(柱1-3):用没有过滤或者仅通过100 μ m的过滤器过滤的FFP培养的MSC达到的倍増。图9在培育4天之后进行显微镜分析。通过40 μ m、40 μ m或O. 22 μ m过滤器来过滤FFP明显增加了 MSC的生长速率。仅通过100 μ m的过滤器的过滤只是稍微改善了效果。
图10MSC的倍增时间(天)。在含有通过40 μ m过滤器的FFP的培养基中培育的MSC的倍增时间(红，柱4-6)，是用未经过滤的FFP培养的MSC的倍增时间(蓝，柱1-3)的大约一半。图 11在培育9天之后的显微镜分析。在所述分析中使用晚代的MSC，这解释了衰老MSC典型的长倍增时间和扁平化的形态(图1-4)。但是在含有经过滤的FFP的培养基中的培养不仅提高了细胞生长速率，而且还改善了细胞的形态(图5-8)。图12 对不同TK和FFP制备物中MSC生长的对照。TK和FFP都经过不同的过滤步骤。显微图片示出培育7天之后的细胞生长。用都经过40 μ m和O. 20 μ m的过滤器过滤的TK和FFP制备的培养基提供了最高效的MSC生长(样品2)，即使在所得到的培养基又经过O. 20 μ m的过滤器过滤时也是如此(样品5)。在所有情况下都充分促进了细胞生长。图13对在经过不同过滤步骤制备的Bio-I中生长的⑶41+MSC的分析。所述分析使用来自供体AP00029、AP00042和AP00045的MSC。(A) I-对照；2-TK O. 8 μ m/0. 2 μ m+FFP ；3-TK+FFP 0. 8 μ m/0. 2 μ m ;4_Tk 0. 8 μ m/0. 2 μ m+FFP0. 8 μ m/0. 2 μ mo (B)ト对照；2-TK 8 μ m+FFP ； 3-TK+FFP 8ym ；4-ΤΚ 8 μ m+FFP 8 μ m。(C) I-对照；2-TK 8 μ m/0. 8 μ m/0. 2 μ m+FFP ；3-TK+FFP 8 μ m/0. 8 μ m/0. 2 μ m ;4_TK8 μ m/0. 2 μ m+FFP 8 μ m/0. 8 μ m/0. 2 μ m。(D) I-对照；2_TK O. 8 μ m/0. 2 μ m+FFP0. 8 μ m/0. 2 μ m+Bio—10· 8 μ m/0. 2 μ m ;3_TK8 μ m/0. 8 μ m/0. 2 μ m+FFP8 μ m/0. 8 μ m/0. 2 μ m+Bio-10. 8 μ m/0. 2 μ m。图 14对在Bio-I中生长的MSC的分析，所述Bio-I含有(I)标准FFP和⑵无冷沉淀物的FFP。发明的详细说明本发明提供了ー种新型生长培养基，所述培养基允许人类CD34_干细胞出人意料地快速扩增。经扩增的干细胞不分化，直至另外诱导才分化。因此，本发明的生长培养基，以及其相关的方法构成了快速地、安全地和廉价地产生临床上有效数量的CD34_干细胞用于治疗疾病的能力的显著进歩。特别地，本发明提供了一种细胞生长培养基，其包含(a)无直径大于O. 22 μ m的固体物质的人类血小板(即凝血细胞)裂解物，其中所述裂解物构成所述细胞生长培养基的总体积的2%至15% ；(b)无直径大于O. 22 μ m的固体物质的人类新鲜冰冻血浆(FFP)滤出物，其中所述FFP滤出物构成所述细胞生长培养基的总体积的1%至10% ；(c)浓度为所述细胞生长培养基的OU/ml至10U/ml的肝素；(d)浓度为O. 5mM至IOmM的L-谷氨酰胺；和(e)适用于哺乳动物细胞生长的无血清低葡萄糖培养基，其中所述无血清低葡萄糖培养基构成所述细胞生长培养基的总体积的75%至97%，且可包含部分(d)的L-谷氨酰胺；其中所述细胞生长培养基允许人类CD34_干细胞的扩增，且其中得到的经扩增的CD34_干细胞保持分化的能力。
这种细胞生长培养基的优选实施方案包括如下(i)所述裂解物构成所述细胞生长培养基的总体积的3%至8%，5%至7%，和优选6% ；(ii)所述FFP滤出物构成所述细胞生长培养基的总体积的2%至7%，4%至6%，和优选5%肝素的浓度为所述细胞生长培养基的O. 8U/ml至I. 2U/ml，和优选lU/ml ； (iv)L-谷氨酰胺的浓度为O. 5mM至IOmM,和优选2mM ;和(V)所述无血清低葡萄糖(lmg/ml)培养基是含L-谷氨酰胺的低葡萄糖DMEM(达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco’ s Modified Eagle Medium)),且构成所述细胞生长培养基的总体积的85 %至93 %，87 %至91 %，和优选89 %。在另外优选的实施方案中，经扩增的⑶34_干细胞具有下列表现型⑶347⑶45_/⑶73+/⑶105+/⑶90+。对于所述表现型，它意味着在测试标志物⑶34和⑶45 (例如使用流式细胞仪分析)吋，这种标志物在经扩增的细胞上出现0% ±10% (和优选±0.5%)。同样地，在测试标志物⑶73、⑶105和⑶90时，所述标志物在经扩增的细胞上出现100% ±10%(和优选+0. 5% ) ο 如本文所用的，“⑶34_干细胞”应表示在其表面上缺少⑶34的干细胞。⑶34_干细胞可来源于组织，例如骨、脐带和脂肪细胞。例如在Lange C等人的Accelerated and safeexpansion of human mesenchymal stromal cells in animal serum-free medium fortransplantation and regenerative medicine. J. Cell Physiol. 2007，Apr. 25[印刷目！]电子出版(Epub ahead ofprint)]中描述了⑶34-干细胞及其分离方法。[54]在本发明的一种实施方案中，术语新鲜冰冻血浆(FFP)指的是已经冷冻和保存的人类血液的液体部分。在实施方案中术语FFP尤其指采集后6小时内已经离心、分离和在-18 °C下冷冻成固体的人类血液的流体部分。[55]适用于哺乳动物细胞生长的无血清的低葡萄糖培养基可以包含例如各种氨基酸、维生素、盐和其它化合物。在本发明的优选实施方案中，所述无血清低葡萄糖培养基是低葡萄糖的(DMEM)，其还可包含L-谷氨酰胺。下面的表I和2中作为实例提供了两种几乎一致的生长培养基配方。表I低葡萄糖达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)DMEM 包含(mg/ml)无机盐:0. 0002mg CaCl0. 000 Img Fe (NO3) X 9H200. 0004mg KCl0. 0000977mg MgSO40. 0064mg NaCl0.000125mg NaH2PO4 X 2H200. 0037mg NaHCO3氨基酸:0. 000084mg L-精氨酸 X HCl0. 000048mg L-胱氨酸0. 000584mg L-谷氨酰胺
0. 000030mg 甘氨酸
0. 000042mg L-组氨酸 XHClXH2O
0. 000105mg L-异亮氨酸
0. 000105mg L-亮氨酸
0. 000146mg L-赖氨酸 XHCl
0. 00003mg L-甲硫氨酸
0. 000066mg L-苯丙氨酸
0. 000042mg L-丝氨酸
0. 000095mg L-苏氨酸
0. 000016mg L-色氨酸
0. 000072mg L-酪氨酸
0. 000094mg L-缬氨酸
维牛素
0. 000004mg D-泛酸钙
0. 000004mg氯化胆碱
0. 000004mg叶酸盐/酷
0. 0000072mg 肌-肌醇
0. 000004mg 烟酰胺
0. 000004mg 吡哆醛 XHCl
0. 0000004mg 核黄素
0. 000004mg 硫胺 XHCl
其他成分
0. OOlmg D-葡萄糖
0. 000015mg 苯酚红
0. OOOllmg丙酮酸钠
0. 9862567mg H2O
水
0. 9862567mg
表2
达尔伯克改良伊格尔培养基，DMEM低葡萄糖化合物配方mg/L
部分A:无机盐
氯化钙(无水)200.00
硝酸铁0.10
硫酸镁200.00
氯化钾400.00
碳酸氢钠3700.00 氯化钠6400.00
磷酸钠，H2O125.00
部分B:其他成分
D-葡萄糖1000.00
苯酚红15.00
丙酮酸钠110.00
部分C:氨基酸
L-盐酸精氨酸84.00
L-胱氨酸48.00
L-谷氨酰胺584.00
甘氨酸30.00
L-盐酸组氨酸42.00
L-异亮氨酸105.00
L-亮氨酸105.00
L-赖氨酸 HCl146.00
L-甲硫氨酸30.00
L-苯丙氨酸66.00L-丝氨酸42.00
L-苏氨酸95.00
L-色氨酸16.00
L-酪氨酸72.00
L-缬氨酸94.00
部分P:维生素
D-泛酸钙4.00
氯化胆碱4.00
i-肌醇7.20
烟酰胺4.00
盐酸吡哆醛4.00
盐酸硫胺4.00
叶酸4.00
核黄素0.40[pH 7. O 渗透摩尔浓度324_333m0sm]
人类血小板(即凝血细胞)可以从全血获得或从单采血液成分法获得。血小板可以来源于单个供体或相匹配的混合供体。在优选的实施方案中，使用单个供体单采血液成分法。同样，FFP可以从全血获得或从单采血液成分法获得。优选地，使用单采血液成分方法来制备FFP。血小板浓缩物以及FFP浓缩物可以根据常规方法制备，例如在欧洲委员会推荐的“血液成分的制备、使用和质保指南(Guide to the preparation,use and qualityassurance of blood components) ”；和“用于血液疗法的输血法则(Transfusionsgesetzand Richtlinien zur HSmotherapie ) ”(德国)中描述的那些方法。在优选的实施方案中，所用的血小板単位具有下列特征体积为200_300ml ;凝血细胞含量为2-4X1011/単位血小板；红细胞含量< 3X IO9/単位血小板；白细胞含量<1X106/単位血小板；且供体对HLA抗体是阴性的(对于避免免疫并发症重要)。这些是根据制造商许可的特征。也可以使用其他的血小板単位。在主题细胞生长培养基的优选实施方案中，根据下列步骤制备部分(a)的血小板裂解物(i)冷冻人类血小板浓缩物,从而使其中的血小板裂解；(ii)融化得到的经裂解的血小板；(iii)以适合使其中的固体物质成丸的速度和持续时间离心融化的经裂解的血小板；(iv)以适合使其中的固体物质成丸的速度和持续时间再离心来自步骤(iii)的上清液；和(V)使用孔径渐减的过滤器至少两次过滤来自步骤(iv)的上清液，其中使用具有至少5 μ m的孔的过滤器实施第一次过滤，和使用具有不大于O. 22 μ m的孔的过滤器实施最后一次过滤。在本发明的一种实施方案中，省略了过滤步骤(V)。在一种实施方案中，如下制备步骤(i)的人类血小板浓缩物离心血小板并从而使其成丸；分离成丸的血小板与液相；和在FFP中重悬(reconstituting)得到的血小板。以下是用于制备血小板裂解物的这种方法的特定额外优选的实施方案在_20°C至_80°C，优选在_80°C冷冻人类血小板浓缩物；在18°C至37°C，优选在37°C融化经裂解的血小板；在9000 X g至55000 X g,优选在10000 X g下离心融化的经裂解的血小板10至20分钟，优选20分钟；在3000Xg至5000Xg，优选在4000Xg下再次离心来自步骤(iii)的上清液10分钟；和使用孔径渐减的过滤器，即40 μ m±5 μ m、5 μ m± I μ m和0. 22 μ m的过滤器过滤来自步骤(iv)的上清液三次。重悬的血小板随后可以经过上述的步骤(i)，冷冻步骤。这种程序可以实现血浆中血型抗原和同族凝集素之间良好的血型相容性。在步骤(ic)中用于重悬血小板的FFP可以根据任一种下面描述的方法来制备。而且，在主题细胞生长培养基的优选实施方案中，根据下列步骤制备部分(b)的FFP滤出物⑴融化人类FFP;(ii)以适合使其液体部分和固体部分分离的速度和持续时间离心融化的FFP ;和(iii)使用孔径渐减的过滤器至少两次过滤得到的液体部分，其中使用具有至少5 μ m的孔的过滤器实施第一次过滤，和使用具有不大于O. 22 μ m的孔的过滤器实施最后ー次过滤。在本发明的一种实施方案中，省略了过滤步骤(iii)。在本发明的另ー种实施方案中，如下制备部分(b)的FFP滤出物(i)融化人类FFP ；(ii)冷冻融化的人类FFP ; (iii)融化所得的人类FFP;和(iv)以适合使其液体部分和固体部分分离的速度和持续时间离心得到的融化的FFP。优选地，在离心步骤(iv)之前至少再一次冷冻和融化来自步骤(iii)的融化的FFP。在一种实施方案中，还省略了对得自步骤(iv)的液体部分的过滤。以下是用于制备FFP滤出物的这种方法的特定优选的实施方案在18°C至37°C，优选在37°C融化FFP ;在9000 X g至55000 X g,优选在10000 X g下离心融化的FFPlO至20分钟，优选20分钟；和使用孔径渐减的过滤器，即40 μ m±5 μ m、5 μ m±l μ m和O. 22 μ m的过滤器过滤来自步骤(ii)的液体部分三次。理想地是，主题细胞生长培养基不含动物血清。这减少了在将非人源抗原引入人受试者时可引起的并发症。优选地，在主题细胞生长培养基中，血小板裂解物和FFP滤出物与血型抗原ABO和Rh相匹配。也就是说，血小板裂解物和FFP滤出物优选来源于具有相同血型抗原的受试者(例如裂解物和滤出物都来源于0+/Rh+受试者)。下面将更详细地讨论这个题目。本发明还提供了一种细胞生长培养基补充物，其包含(a)无直径大于O. 22 μ m的固体物质的人类血小板裂解物，其中所述裂解物构成所述细胞生长培养基补充物的总体积的17%至94% ;和(b)无直径大于O. 22 μ m的固体物质的人类新鲜冰冻血浆(FFP)滤出物，其中所述FFP滤出物构成所述细胞生长培养基补充物的总体积的6%至83% ；其中在将所述细胞生长培养基补充物与肝素和含L-谷氨酰胺的、适用于哺乳动物细胞生长的无血清低葡萄糖培养基组合，从而构成如下细胞生长培养基时其包含(i)3体积％至25体积％的细胞生长培养基补充物；(ii)浓度为OU/ml至10U/ml的肝素；和
(iii)浓度为O. 5mM至IOmM的L-谷氨酰胺；所得到的细胞生长培养基允许人类CD34_〒_胞的扩增，且所得到的经扩增的CD34_干细胞保持分化的能力。该细胞生长培养基补充物实际上被用作“浓缩物”添加到标准生长培养基如DMEM中。因此，所述补充物优选带来前面讨论的优选浓度的血小板裂解物和FFP滤出物(例如血小板裂解物和FFP滤出物分别构成所述补充物的54. 5%和45. 5% )。在一种实施方案中，主题细胞生长培养基补充物另外包含肝素，其中在将所述细胞生长培养基补充物与含L-谷氨酰胺的、适用于哺乳动物细胞生长的无血清低葡萄糖培养基组合，从而构成细胞如下生长培养基时其包含3体积％至25体积％ (优选11体积％ )的细胞生长培养基补充物，并且含有OU/ml至10U/ml (优选lU/ml)的肝素，所得到的细胞生长培养基允许人类CD34_干细胞的扩增，且所得到的经扩增的CD34_干细胞保持分化的能力。在主题细胞生长培养基补充物中优选地，根据下列步骤制备部分(a)的血小板裂解物 (i)冷冻人类血小板浓缩物,从而使其中的血小板裂解；
(ii)融化得到的经裂解的血小板；(iii)以适合使其中的固体物质成丸的速度和持续时间离心融化的经裂解的血小板；(iv)以适合使其中的固体物质成丸的速度和持续时间再离心来自步骤(iii)的上清液；和(V)使用孔径渐减的过滤器至少两次过滤来自步骤(iv)的上清液，其中使用具有 至少5 μ m的孔的过滤器实施第一次过滤，和使用具有不大于O. 22 μ m的孔的过滤器实施最后一次过滤。在本发明的一种实施方案中，省略了过滤步骤(V)。在主题细胞生长培养基补充物中还优选，根据下列步骤制备部分(b)的FFP滤出物⑴融化人类FFP;(ii)以适合使其液体部分和固体部分分离的速度和持续时间离心融化的FFP ;和(iii)使用孔径渐减的过滤器至少两次过滤得到的液体部分，其中使用具有至少5 μ m的孔的过滤器实施第一次过滤，和使用具有不大于O. 22 μ m的孔的过滤器实施最后ー次过滤。在本发明的一种实施方案中，省略了过滤步骤(iii)。正如主题生长培养基的所有实施方案，这种细胞生长培养基补充物理想地也是不包动物血清。在主题细胞生长培养基中还优选，血小板裂解物和FFP滤出物与血型抗原ABO和Rh相匹配。这又与前面关于主题生长培养基的讨论一祥。本发明另外提供了ー种无直径大于O. 22 μ m的固体物质的人类血小板裂解物，其中根据下列步骤制备所述血小板裂解物(i)冷冻人类血小板浓缩物,从而使其中的血小板裂解；(ii)融化得到的经裂解的血小板；(iii)以适合使其中的固体物质成丸的速度和持续时间离心融化的经裂解的血小板；(iv)以适合使其中的固体物质成丸的速度和持续时间再离心来自步骤(iii)的上清液；和(V)使用孔径渐减的过滤器至少两次过滤来自步骤(iv)的上清液，其中使用具有至少5 μ m的孔的过滤器实施第一次过滤，和使用具有不大于O. 22 μ m的孔的过滤器实施最后一次过滤。在本发明的一种实施方案中，省略了过滤步骤(V)。本发明还另外提供了ー种无直径大于O. 22 μ m的固体物质的人类新鲜冰冻血浆(FFP)滤出物，其中根据下列步骤制备所述FFP滤出物⑴融化人类FFP;(ii)以适合使其液体部分和固体部分分离的速度和持续时间离心融化的FFP ;和(iii)使用孔径渐减的过滤器至少两次过滤得到的液体部分，其中使用具有至少5 μ m的孔的过滤器实施第一次过滤，和使用具有不大于O. 22 μ m的孔的过滤器实施最后ー次过滤。在本发明的一种实施方案中，省略了过滤步骤(iii)。本发明还提供了ー种用于扩增人类⑶34_干细胞的试剂盒，其在分开的区室中包含(a)无直径大于O. 22 μ m的固体物质的人类血小板裂解物，和(b)无直径大于O. 22 μ m的固体物质的人类新鲜冰冻血浆(FFP)滤出物，其中⑴所述裂解物构成(a)和(b)合并体积的17%至94% (优选54.5% );
(ii)所述FFP滤出物构成(a)和(b)合并体积的6%至83% (优选45. 5% )，和(iii)在将所述裂解物和所述滤出物与肝素和含L-谷氨酰胺的、适用于哺乳动物细胞生长的无血 清低葡萄糖培养基组合，从而构成细胞生长培养基时，所得到的细胞生长培养基允许人类CD34_干细胞的扩增，且所得到的经扩增的CD34_干细胞保持分化的能力，其中(i)所述试剂盒的内容物构成所述培养基体积的3%至25% (优选11% );和(ii)肝素的浓度为OU/ml 至 10U/ml (优选 lU/ml)。在主题试剂盒的ー种实施方案中，所述试剂盒在分开的区室中包含(a)无直径大于O. 22 μ m的固体物质的人类血小板裂解物，(b)无直径大于O. 22 μ m的固体物质的人类新鲜冰冻血浆(FFP)滤出物，和(c)肝素，其中⑴所述裂解物构成(a)-(c)合并体积的17%至94% (优选54. 5%) ；(ii)所述FFP滤出物构成(a)-(c)合并体积的6%至83% (优选45.5%)，和(iii)在将所述裂解物、所述滤出物和肝素与含L-谷氨酰胺的、适用于哺乳动物细胞生长的无血清低葡萄糖培养基组合，从而构成细胞生长培养基时，所得到的细胞生长培养基允许人类CD34_干细胞的扩增，且所得到的经扩增的CD34_干细胞保持分化的能力，其中(i)所述试剂盒的内容物构成所述培养基体积的3%至25% (优选11% );和(ii)肝素的浓度为OU/ml至IOU/ml (优选 lU/ml)。本方明还提供了ー种物质组合物，其包含(a)人类⑶34_干细胞和(b)任ー种实施方式的主题细胞生长培养基。如本发明所预想的，在对受试者施用这种培养基和干细胞的组合物的情况下，优选所述组合物与患者的血型是免疫相容的。在这点上，存在与这种物质组合物的临床应用有关的几种优选的实施方案。在第一种优选实施方案中，血小板裂解物是O型(万能供血血型)，FFP是AB型(万能供血血型)，将该组合物对具有任意血型(即0、Α、Β或AB)的患者施用。在第二种优选实施方案中，血小板裂解物、FFP滤出物和患者均具有相同的血型。在第三种优选实施方案中，FFP滤出物是AB型，血小板裂解物和患者具有相同的血型并且可以是任意血型(例如FFP滤出物是AB型，血小板裂解物和患者都是O型)。最后，如果患者是O型，所用FFP可以具有任意血型。关于Rh因子，优选但不是必须的，患者血型与FFP滤出物和血小板裂解物类型相匹配。本发明另外提供了一种用于制备无直径大于O. 22 μ m的固体物质的人类血小板裂解物的方法，其包括下列步骤(i)冷冻人类血小板浓缩物,从而使其中的血小板裂解；(ii)融化得到的经裂解的血小板；
(iii)以适合使其中的固体物质成丸的速度和持续时间离心融化的经裂解的血小板；(iv)以适合使其中的固体物质成丸的速度和持续时间再离心来自步骤(iii)的上清液；和(V)使用孔径渐减的过滤器至少两次过滤来自步骤(iv)的上清液，其中使用具有至少5 μ m的孔的过滤器实施第一次过滤，和使用具有不大于O. 22 μ m的孔的过滤器实施最后一次过滤。 在本发明的一种实施方案中，省略了过滤步骤(V)。本发明还另外提供了一种用于制备无直径大于0.22 μ m的固体物质的人类新鲜冰冻血浆(FFP)滤出物的方法，其包括下列步骤⑴融化人类FFP;(ii)以适合使其液体部分和固体部分分离的速度和持续时间离心融化的FFP ;和(iii)使用孔径渐减的过滤器至少两次过滤得到的液体部分，其中使用具有至少5 μ m的孔的过滤器实施第一次过滤，和使用具有不大于O. 22 μ m的孔的过滤器实施最后ー次过滤。作为选择，根据下列步骤制备细胞生长培养基的部分(b)的FFP滤出物(i)融化人类FFP ;(ii)冷冻融化的人类FFP ; (iii)融化来自步骤(ii)的人类FFP ;和(iv)以适合使其液体部分和固体部分分离的速度和持续时间离心来自步骤(iii)的融化的FFP。在FFP的制备方法中，在离心步骤(iv)之前可至少再一次冷冻和融化来自步骤
(iii)的融化的FFP。该FFP尤其可以在低于或等于-35°C的温度下冷冻，和另外可以在5°C ±3°C的温度下过夜融化，导致通常引起所培养的MSC凝集的因子的团聚。在本发明的这种方法的另ー种实施方案中，离心步骤可以在4000X g下进行10分钟，以便沉淀上述团聚的因子。当使用上述融化和冷冻步骤时，可以省略对得自离心步骤(iv)的液体部分的过滤步骤。在使用经过冷沉淀物去除步骤预处理的FFP制备的培养基中培养的MSC的倍增时间，与经过FFP成分的过滤步骤制备的培养基中培养的MSC的倍增时间相当。本发明还提供了一种用于制备细胞生长培养基的方法，其包括组合下列物质的步骤(a)无直径大于O. 22 μ m的固体物质的人类血小板裂解物，其中所述裂解物构成所述细胞生长培养基的总体积的2%至15% (优选6%)；(b)无直径大于O. 22 μ m的固体物质的人类新鲜冰冻血浆(FFP)滤出物，其中所述FFP滤出物构成所述细胞生长培养基的总体积的1%至10% (优选5% )；(c)其量足够产生所述细胞生长培养基的OU/ml至10U/ml (优选lU/ml)的浓度的肝素；(d)其量足够产生O. 5mM至IOmM的浓度的L-谷氨酰胺；和(e)适用于哺乳动物细胞生长的无血清低葡萄糖培养基，其中所述无血清低葡萄糖培养基构成所述细胞生长培养基的总体积的75%至97% (优选89%)，且所述无血清低葡萄糖培养基可包含部分(d)的L-谷氨酰胺；其中所述细胞生长培养基允许人类CD34_干细胞的扩增，且其中得到的经扩增的CD34_干细胞保持分化的能力。本发明提供了ー种用于扩增人类CD34—干细胞群的方法，其包括在适当的温度下在主题细胞生长培养基中培养所述干细胞的步骤。优选地，适当的温度为36°C至38°C，优选 37。。。本发明还提供了一种人类CD34_干细胞，其⑴具有分化的能力，和(ii)由人类CD34_干细胞群的扩增获得，其中所述扩增包括在适当的温度下在主题细胞生长培养基中培养所述干细胞群。最后，本发明提供了人类CD34_干细胞群，其⑴具有分化的能力，和(ii)由人类CD34_干细胞群的扩增获得，其中所述扩增包括在适当的温度下在主题细胞生长培养基中培养所述干细胞群。通过參考以下的试验细节将更好地理解本发明，但本领域技术人员容易理解，具体的试验细节只是举例说明后续权利要求书中更全面地说明的本发明。
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试验细节A.干细胞相关材料的制备和用途新鮮冰冻血浆(药品)新鲜冰冻血浆是用于输血或其他分级过程的人类血浆成分，通过全血来制备或者通过由单采血液成分法采集的血浆来制备。FFP包含正常血浆水平的稳定凝血因子、白蛋白和免疫球蛋白。不稳定的凝血因子包括VIIIc因子。经由单采血液成分法采集来达到FFP的纯度。HLA和HPA抗体的测试可以对单个供体实施，从而降低同种异体免疫的可能风险。使用ABO相容的血浆(AB Rh+作为万能供血血型或ABO相匹配的)。在培养期间FFP以非常低的浓度用于MSC的扩增。为了进一歩降低病原体传播的风险，理想的是测试FFP供体的病原体并使供体对こ肝免疫。通过所述措施降低患者的同种异体免疫和病原体传播的风险。凝血细胞裂解物(来源于血小板药品)凝血细胞裂解物来源于通过单采血液成分法获得的血小板，理想的是来自单个供体。所施用的血小板単位无污染的红细胞，且包含非常少数量的白细胞(< IO5/単位)。血小板裂解物由显著支持MSC生长和纯度的无细胞的裂解物构成。Iml裂解物对应6. 5X IO8至2. OXlO9的血小板。通过使用少白细胞的单个供体单采血液成分法产品来降低同种异体免疫的可能风险。尽管血小板单位不包含红细胞(或只包含非常少量)，但只使用O Rh+血小板或相匹配的单位。通过使用单个供体的血小板和测试CMV来降低病原体传播的可能风险。如果需要的话可以进行对其他病原体例如B19微小病毒、EBV或弓形体病毒的测试。B. Bio-I组合物(即包含血小板裂解物和FFP滤出物的培养基)的研发和测试比较下列条件下MSC的培育(a) MDM+20% FBS作为标准；(b)补充有3%血小板裂解物(=TK)和5% FFP的低葡萄糖DMEM ;和(c)补充有6%血小板裂解物(=TK)和5% FFP的低葡萄糖DMHM。MSC增殖谏率
在以上三种选定条件下检验来自四个供体的MSC的増殖速率。以相同的初始密度培养和传代MSC，并在每个传代步骤期间测定増殖速率。根据Td = t*log(2)/log(q2/ql)计算倍增时间，其中Td是倍增时间，ql是初始细胞量，q2是最终细胞量，t是培养持续时间(天)。图I示出在这三种检验条件下MSC—次倍增所需的时间。在含FBS的培养基中培养的MSC的倍增时间(2. 86±0. 43天)比在DMEM+6% TK和5% FFP中生长的MSC的倍增时间(I. 78±0. 23天)更长。用较少的血小板裂解物(DMEM+3% TK和5% FFP)培育的MSC的生长速度在两者之间(2. 4 ±0.32天)。頂011+20% 85与01^] +6%1'1(和5% 两者之间的这种差异在统计学上是显著的，并对所有三种培养基进行比较以评价可再现趋势。 在图2中示出，相对于含FBS的培养基中的MSC增殖速率归ー化的在含TK的培养基中MSC的增殖速率。选择DMEM+6% TK和5% FFP培养基组合物(称为Bio-Ι)进行进ー步的详细分析。研究在延长的培育时间段MSC在Bio-I中的扩增。，将骨髓细胞培育在Bio-I (10个供体)中或MDM+20%FBS^f供体)中，得到纯的MSC培养物(通过以下示出的测试证实)。细胞生长直至达到75%至85%的饱和度(confluency),在传代期间计数并以相同的初始密度再次平板接种。以t/Td来计算细胞倍增，其中t是两次传代之间培养的持续时间(天)，Td是倍增时间。由于生长速度的大的差异，生长在两种培养基中的MSC不能同时进行传代。因此，MSC的生长动力学(图3)以趋势线表示，所述趋势线由代表两次传代之间的时间段内达到的细胞倍増量的单个数据点构建。由于接种是以低细胞密度实施的，在培育45天之后因为MSC进入衰老(数据未示出)而没有分析进ー步的传代步骤。在不同培养基中MSC特异性表面ホ不志物的表征对在上述条件下生长的MSC的表面标志物表达进行流式细胞仪分析。使用标志物的标准组合，它被描述为MSC表现型的指征和被接受为ISTH准则(Dominici，Le Blanc等人，2006)。已知MSC缺乏造血标志物⑶34和⑶45的表达，而⑶73、⑶90和⑶105是高度表达的。在表3中总结了对5个供体进行比较获得的数据。表3
表面标志物「DIDM+20% FBS Bio-1'
CD340.62±0.820.20±0.27'
CD450.38 ±0.560.08 ±0.03'
CD7399.06 ±1.59 99.87 ±0.24'
CD9094. 17±2. 72 99.92±0.05'
CD10599.28±1.07 99.83±0. 18'在含Tk和FFP的培养基中培育明显改善了所得到的培养物的表型特征。观察到所有被分析的标志物的表达趋势(见图4)。细胞活性和细胞形态通过在FACS分析中的7-AAD染色测定培育在Bio-I中的MSC活性。由来自11个供体的MSC分析计算出的平均活性为97. 61 ± I. 26%。此外，看起来在Bio-I中生长的MSC表现为在尺寸和颗粒度方面更均匀的细胞种群，与在含FBS的培养基中培育的MSC相比(见图5)尺寸更小，这被认为是MSC的更富生理机能的状态。通过显微镜分析证实了这种观察(数据未示出)。在Bio-I中牛长的MSC的功能分析在CFU-F (成纤维细胞克隆形成単位)测试(数据未示出)中证明MSC的克隆发生。可以诱导MSC的分化指向成脂细胞系、成骨细胞系和成软骨细胞系(lineage)(见图 6)。C. Bio-I组合物的进ー步研发和测试在下面的测试中，进ー步改进两种Bio-I成分血小板裂解物(TK)和新鲜冰冻血浆(FFP)的制备方法。该改进的目的在干，从培养基中除去所有尺寸大于O. 22μπι的颗粒，和获得不含在包含TK和FFP的培养基中可常见的沉淀物的澄清溶液。如下制备起始成分将血小板浓缩物冷冻(_20°C或-80°C )和融化，在18°C、10000 X g下离心20分钟和在18°C、4000Xg下离心10分钟，由此获得血小板裂解物(TK)。使用得到的上清液。在< -35°C下储存之后将FFP融化。以下描述的所有试验中，将该成分添加到浓度为6% TK和5% FFP的低葡萄糖DMEM中，所述DMEM中补充有L-谷氨酰胺和肝素。在第一个测试中，如上所述地制备培养基并使其直接通过O. 22 μ m的过滤器。在经过滤的培养基中以标准方法培育三个供体的MSC。阻止细胞生长，并在培育两周之后将培养基换成未经过滤的ー种，之后细胞重新开始生长(数据未示出)。在另ー个测试中，起始成分在分别经过离心和过滤步骤之后添加到培养基中。对培养基清晰度进行视觉分析(数据未示出)并监测MSC生长速率。FFP制备的改讲保持TK制备方法不变。如下改变FFP的制备I. FFP 4000 Xg2. FFP 4000Xg+100ym3. FFP IOOym4. FFP 40 μ m5. FFP 40 μ m+0. 22 μ m6. FFP 40 μ m+0. 45 μ m制备培养基，并培养MSC 12天。培养基样品4、5和6中生长的细胞在4天后达到85%的饱和度，并再次传代。在胰蛋白酶消化之后计数MSC并估算其生长速率(图7-9)。TK制备的改讲对在传统方法制备的TK中和在额外通过O. 45 μ m的过滤器的TK中的MSC生长进行比较。如下面指出的改变FFP的制备。估算在这些培养基中培育的MSC的倍增时间，并进行显微镜分析(图10-12)。测试经由孔较小的过滤器或不同过滤器(8 μ m、O. 8 μ m和O. 2 μ m)的组合过滤TK的效果。经测试的组合都不显著改变细胞生长速率(数据未示出)。但是，得到的培养基宏观上无颗粒并且更透明，特别是使用O. 8 μ m和O. 2 μ m过滤器吋。由于不存在沉积的血小板，与标准培养基相比，在经过过滤的培养基中生长的细胞在胰蛋白酶消化之后的细胞悬浮液中观察到更少的凝集作用。此外，可以通过对⑶41+细胞使用流式细胞仪来监测过滤的效率。在未经过滤的TK中，残留的血小板膜具有锚定MSC的能力，由此形成CD41+信号。该信号在使用小孔的过滤步骤中大部分被除去。图13中示出了上述情况的实例。对TK或FFP或者两者实施不同的过滤步骤(图13，A-C)。随后对得到的培养基进行过滤(图13，D)。应指出，所有用于研究的培养基变 化足够支持细胞生长(数据未示出)。在所有测试中，以未经过额外过滤步骤制备的标准Bio-I作为对照。通过O. 8 μ m和O. 2 μ m孔对TK进行的过滤，单独或与FFP过滤步骤组合，导致⑶41+信号的显著減少(图13A和C)。此外，这种效果的水平似乎依赖于过滤的效率，因为通过O. 8 μ m和O. 2 μ m孔对TK进行的依次过滤比単独通过O. 2 μ m孔过滤导致更明显的⑶41+减少(比较图13C、2和4)。这通过图13D示出的结果来支持。通过8μπι孔的过滤没有引起CD41+信号的显著減少，仅仅是起到了除去尺寸大的颗粒的作用，并因此使得随后通过较小孔的过滤更容易。如预期的，FFP的过滤在CD41+信号方面没有显示任何差异。讲ー步优化改变的FFP制备以下步骤的目的在干，从FFP中除去凝血因子，并防止最后培养基的凝块和细胞的凝集以及血小板裂解物残留物的沉淀。为此在< _35°C温度下冷冻FFP并在5±3°C温度下过夜融化FFP。将这些步骤再重复一次，随后在4000Xg离心FFP 10分钟。将上清液(无冷沉淀物的FFP)用于Bio-I制备。图14示出了对在标准Bio-I和在含有无冷沉淀物的FFP的Bio-I中MSC生长的比较。在这两种进行研究的培养基改变方案中的细胞实现的倍増时间是相当的，而在无冷沉淀物的FFP中的生长稍微得到改进。该培养基还几乎无污染的颗粒，从而不需要额外对FFP进行过滤。在FFP中重悬血小板丸粒，随后制备Bio-I培养基补充物为了实现如上所述的血型抗原和血浆中同族凝集素的最大血型相容性，并排除培养基补充物之间任何最終的不相容性，TK制备中的额外步骤在有些情况下可能是必要的。这在含同族凝集素的自体血浆中采集血小板浓缩物时可能是重要的。必须考虑到关于FFP的同族凝集素和凝血细胞浓缩物的血浆的相容性。为此可以如下采集血小板，即在2000Xg离心10分钟或在5000Xg离心6分钟，类似于经洗涤的血小板。收集丸粒和在FFP (标准的、经过滤的或无冷沉淀物的)中重悬并在< -20°C下冷冻。可以如前面对TK所描述的来实施之后的制备步骤。所述补充物可以添加到基础培养基中(例如DMEM或α -MEM)。根据期望的最终组成可以调节补充物的最終体积和添加到基础培养基中的量。例如，如果选择5%的血小板浓缩物和5 %的FFP用于最佳细胞生长，可以将其少量离心和重悬在200ml的FFP中之后采集200ml血小板。可以将这样生产的补充物添加到基础培养基中得到5%的最终浓度。
应注意到下列在本文中指出的关于FFP和TK量的各点。在11的Bio-I中1%的FFP对应8. O至10. Oml凝血活性的人类血浆。关于血小板裂解物，产品中血小板的最终浓度和在Bio-I中血小板的百分数取决于所用的血小板制备方法。(I)来自单釆血液成分法的TK (Apceth) :1ml的TK裂解物对应6. 5 X IO8至4. 5 X IO9的血小板。相应地，含有I % TK的11的Bio-I包含的裂解物量等于6. 5 X IO9至4. 5 X IOici的血小板。用在Bio-I中的血小板裂解物的百分数必须基于本申请中列出的在起始材料中血小板的量和体积％值来计算。
(2)来自全血的血小板裂解物在50至60ml悬浮液中存在45至90 X IO9的血小板。参考文献Blande, et a_L ,“Adipose tissue mesenchymal stem cell expansion inanimal serum-free medium supplemented with autologous human platelet lysate，，，Transfusion, Vol. 49，Dec. 2009 ；2680-2685.Capelli, et al. (2007) “Human platelet lysate allows expansion andclinical grade production of mesenchymal stromal ceils from small samples of·bone marrow aspirates or marrow filter washouts. nBone Marrow Transplant. 40(8)785-91.Horn et al. (2010). “Impact of individual platelet lysates on isolationand growth of human mesenchymal stromal cells” Cytotherapy，12 :888-898.Kocaoemer，et al. ,“Human AB serum and thrombin-activated platelet-richplasma are suitable alternatives to fetal calf serum for the expansion ofmesenchymal stem cells from adipose tissue”，Stem Cells, Nov. 11,2008 ；1271-1278.Langer and Gawaz，“Platelets in regenerative medicine，，，Basic ResCardiol 103:299-307(2008).Muller, et al. (2006). “Animal serum-free culture conditions forisolation and expansion of multipotent mesenchymal stromal cells from humanBM. ” Cytotherapy 8(5) :437-44.Salvade, et al. ，“Characterization of Platelet Lysate CulturedMesenchymal Stromal Cells and Their Potential Use in Tissue-EngineeredOsteogenic Devices for the Treatment of Bone Defects.，，Tissue Eng Part CMethods. 15，2009 :185-196.Schallmoser， et al. (2008) “Rapid large-scale expansion of functionalmesenchymal stem cells from unmanipulated bone marrow without animalserum. ’’Tissue Eng Part C Methods. 14(3) :185-96.Stellos and Gawaz，“Platelet interaction with progenitor cells Potential implications for regenerative medicine”， Thromb Haemost 2007 ；98 922-929.
权利要求
1.细胞生长培养基，其包含(a)无直径大于O.22 μ m的固体物质的人类血小板裂解物，其中所述裂解物构成所述细胞生长培养基的总体积的2%至15% ；(b)无直径大于O.22 μ m的固体物质的人类新鲜冰冻血浆(FFP)滤出物，其中所述FFP滤出物构成所述细胞生长培养基的总体积的1%至10% ；(c)浓度为所述细胞生长培养基的OU/ml至10U/ml的肝素；(d)浓度为O.5mM至IOmM的L-谷氨酰胺；和(e)适用于哺乳动物细胞生长的无血清低葡萄糖培养基，其中所述无血清低葡萄糖培养基构成所述细胞生长培养基的总体积的75%至97%，且所述无血清低葡萄糖培养基可包含部分(d)的L-谷氨酰胺；其中所述细胞生长培养基允许人类CD34_干细胞的扩增，所得经扩增的CD34_干细胞保持分化的能力。
2.如权利要求I所述的细胞生长培养基，其中根据下列步骤制备部分(a)的血小板裂解物(i)冷冻人类血小板浓缩物，从而使其中的血小板裂解；( )融化所得经裂解的血小板；(iii)以适合使其中的固体物质成丸的速度和持续时间离心融化的经裂解的血小板；(iv)以适合使其中的固体物质成丸的速度和持续时间再离心来自步骤(iii)的上清液；和(v)使用孔径渐减的过滤器至少两次过滤来自步骤(iv)的上清液，其中使用具有至少5 μ m的孔的过滤器实施第一次过滤，和使用具有不大于O. 22 μ m的孔的过滤器实施最后ー次过滤。
3.如权利要求2所述的细胞生长培养基，其中如下制备步骤(i)的人类血小板浓缩物离心血小板并由此使其成丸；分离成丸的血小板和液相；并在FFP中重悬得到的血小板。
4.如权利要求I 3之一所述的细胞生长培养基，其中如下制备部分(b)的FFP滤出液融化人类FFP ;以适合使其液体部分和固体部分分离的速度和持续时间离心所得融化的FFP ;和使用孔径渐减的过滤器至少两次过滤得到的液体部分，其中使用具有至少5μπι的孔的过滤器实施第一次过滤，和使用具有不大于O. 22 μ m的孔的过滤器实施最后一次过滤。
5.如权利要求I 3之一所述的细胞生长培养基，其中如下制备部分(b)的FFP滤出液⑴融化人类FFP ； (ii)冷冻融化的人类FFP ; (iii)融化所得的人类FFP ;和(iv)以适合使其液体部分和固体部分分离的速度和持续时间离心所得融化的FFP。
6.如权利要求5所述的细胞生长培养基，其中在离心步骤(iv)之前至少再一次冷冻和融化来自步骤(iii)的融化的FFP。
7.如权利要求5或6之一所述的细胞生长培养基，其中省略对得自步骤(iv)的液体部分的过滤。
8.如权利要求I 7之一所述的细胞生长培养基，其中所述细胞生长培养基不含动物血清。
9.如权利要求I 8之一所述的细胞生长培养基，其中所述血小板裂解物和FFP滤出物与血型抗原ABO和Rh相匹配。
10.细胞生长培养基补充物，其包含(a)无直径大于O.22 μ m的固体物质的人类血小板裂解物，其中所述裂解物构成所述细胞生长培养基补充物的总体积的17%至94% ;和(b)无直 径大于O.22 μ m的固体物质的人类新鲜冰冻血浆(FFP)滤出物，其中所述FFP滤出物构成所述细胞生长培养基补充物的总体积的6%至83% ;其中在将所述细胞生长培养基补充物与肝素和含L-谷氨酰胺的、适用于哺乳动物细胞生长的无血清低葡萄糖培养基组合，从而构成细胞生长培养基时，所得到的细胞生长培养基允许人类CD34_干细胞的扩增，且所得到的经扩增的CD34_干细胞保持分化的能力，所述细胞生长培养基包含(i)3体积％至25体积％的细胞生长培养基补充物；(ii)浓度为OU/ml至10U/ml的肝素；和(iii)浓度为O. 5mM至IOmM的L-谷氨酰胺。
11.如权利要求10所述的细胞生长培养基补充物，其还包含肝素，其中在将所述细胞生长培养基补充物与含L-谷氨酰胺的、适用于哺乳动物细胞生长的无血清低葡萄糖培养基组合，从而构成细胞生长培养基时，所得到的细胞生长培养基允许人类CD34_干细胞的扩增，且所得到的经扩增的CD34_干细胞保持分化的能力，所述细胞生长培养基包含3体积％至25体积％的细胞生长培养基补充物，并且含有OU/ml至10U/ml的肝素。
12.如权利要求10和11之一所述的细胞生长培养基补充物，其中根据下列步骤制备部分(a)的血小板裂解物(i)冷冻人类血小板浓缩物，从而使其中的血小板裂解；( )融化所得经裂解的血小板；(iii)以适合使其中的固体物质成丸的速度和持续时间离心融化的经裂解的血小板；(iv)以适合使其中的固体物质成丸的速度和持续时间再离心来自步骤(iii)的上清液；和(v)使用孔径渐减的过滤器至少两次过滤来自步骤(iv)的上清液，其中使用具有至少5 μ m的孔的过滤器实施第一次过滤，和使用具有不大于O. 22 μ m的孔的过滤器实施最后ー次过滤。
13.如权利要求10 12之一所述的细胞生长培养基补充物，其中根据下列步骤制备部分(b)的FFP滤出物⑴融化人类FFP ；( )以适合使其液体部分和固体部分分离的速度和持续时间离心融化的FFP ;和(iii)使用孔径渐减的过滤器至少两次过滤得到的液体部分，其中使用具有至少5μπι的孔的过滤器实施第一次过滤，和使用具有不大于O. 22 μ m的孔的过滤器实施最后一次过滤。
14.如权利要求10 13之一所述的细胞生长培养基补充物，其中所述细胞生长培养基补充物不含动物血清。
15.如权利要求10 14之一所述的细胞生长培养基补充物，其中所述血小板裂解物和FFP滤出物与血型抗原ABO和Rh相匹配。
16.无直径大于O.22 μ m的固体物质的人类血小板裂解物，其中根据下列步骤制备所述血小板裂解物(i)冷冻人类血小板浓缩物，从而使其中的血小板裂解；( )融化所得经裂解的血小板；(iii)以适合使其中的固体物质成丸的速度和持续时间离心融化的经裂解的血小板；(iv)以适合使其中的固体物质成丸的速度和持续时间再离心来自步骤(iii)的上清液；和(v)使用孔径渐减的过滤器至少两次过滤来自步骤(iv)的上清液，其中使用具有至少5 μ m的孔的过滤器实施第一次过滤，和使用具有不大于O. 22 μ m的孔的过滤器实施最后ー次过滤。
17.无直径大于O.22 μ m的固体物质的人类新鲜冰冻血浆(FFP)滤出物，其中根据下列步骤制备所述FFP滤出物⑴融化人类FFP ；( )以适合使其液体部分和固体部分分离的速度和持续时间离心融化的FFP ;和(iii)使用孔径渐减的过滤器至少两次过滤得到的液体部分，其中使用具有至少5μπι的孔的过滤器实施第一次过滤，和使用具有不大于O. 22 μ m的孔的过滤器实施最后一次过滤。
18.用于扩增人类CD34—干细胞的试剂盒，其在分开的区室中包含(a)无直径大于O.22 μ m的固体物质的人类血小板裂解物，和(b)无直径大于O.22 μ m的固体物质的人类新鲜冰冻血浆(FFP)滤出物，其中⑴所述裂解物构成(a)和(b)合并体积的17%至94% ；(ii)所述FFP滤出物构成(a)和(b)合并体积的6%至83%，和(iii)在将所述裂解物和所述滤出物与肝素和含L-谷氨酰胺的、适用于哺乳动物细胞生长的无血清低葡萄糖培养基组合，从而构成细胞生长培养基时，所得到的细胞生长培养基允许人类CD34_干细胞的扩增，且所得到的经扩增的CD34—干细胞保持分化的能力，其中(i)所述试剂盒的内容物构成所述培养基体积的3%至25% ;和(ii)肝素的浓度为OU/ml至I OU/ml 0
19.如权利要求18所述的试剂盒，其在分开的区室中包含(a)无直径大于O.22 μ m的固体物质的人类血小板裂解物，(b)无直径大于O.22 μ m的固体物质的人类新鲜冰冻血浆(FFP)滤出物，和 (c)肝素，其中⑴所述裂解物构成(a)-(c)合并体积的17%至94% ；(ii)所述FFP滤出物构成(a)-(c)合并体积的6%至83%，和(iii)在将所述裂解物、所述滤出物和肝素与含L-谷氨酰胺的、适用于哺乳动物细胞生长的无血清低葡萄糖培养基组合，从而构成细胞生长培养基时，所得到的细胞生长培养基允许人类CD34_干细胞的扩增，且所得到的经扩增的CD34—干细胞保持分化的能力，其中(i)所述试剂盒的内容物构成所述培养基体积的3%至25% ;和(ii)肝素的浓度为OU/ml至I OU/ml 0
20.物质组合物，其包含(a)人类⑶干细胞和(b)如权利要求I 9之一所述的细胞生长培养基。
21.用于制备无直径大于O.22 μ m的固体物质的人类血小板裂解物的方法，其包括下列步骤(i)冷冻人类血小板浓缩物，从而使其中的血小板裂解；(ii)融化所得经裂解的血小板；(iii)以适合使其中的固体物质成丸的速度和持续时间离心融化的经裂解的血小板；(iv)以适合使其中的固体物质成丸的速度和持续时间再离心来自步骤(iii)的上清液；和(v)使用孔径渐减的过滤器至少两次过滤来自步骤(iv)的上清液，其中使用具有至少.5 μ m的孔的过滤器实施第一次过滤，和使用具有不大于O. 22 μ m的孔的过滤器实施最后ー次过滤。
22.用于制备无直径大于0.22μ m的固体物质的人类新鲜冰冻血浆(FFP)滤出物的方法，其包括下列步骤⑴融化人类FFP ； ( )以适合使其液体部分和固体部分分离的速度和持续时间离心融化的FFP ;和(iii)使用孔径渐减的过滤器至少两次过滤得到的液体部分，其中使用具有至少5μπι的孔的过滤器实施第一次过滤，和使用具有不大于O. 22 μ m的孔的过滤器实施最后一次过滤。
23.用于制备细胞生长培养基的方法，其包括组合下列物质的步骤(a)无直径大于O.22 μ m的固体物质的人类血小板裂解物，其中所述裂解物构成所述细胞生长培养基的总体积的2%至15% ；(b)无直径大于O.22 μ m的固体物质的人类新鲜冰冻血浆(FFP)滤出物，其中所述FFP滤出物构成所述细胞生长培养基的总体积的1%至10% ；(c)其量足够产生所述细胞生长培养基的OU/ml至10U/ml的浓度的肝素；(d)其量足够产生O.5mM至IOmM的浓度的L-谷氨酰胺；和(e)适用于哺乳动物细胞生长的无血清低葡萄糖培养基，其中所述无血清低葡萄糖培养基构成所述细胞生长培养基的总体积的75%至97%，且所述无血清低葡萄糖培养基可包含部分(d)的L-谷氨酰胺；其中所述细胞生长培养基允许人类CD34_干细胞的扩增，且其中得到的经扩增的CD34_干细胞保持分化的能力。
24.用于扩增人类⑶34—干细胞群的方法，其包括在适当的温度下在如权利要求I 9之一所述的培养基中培养所述干细胞的步骤。
25.人类CD34—干细胞，其⑴具有分化的能力，和(ii)由人类CD34—干细胞群的扩增获得，其中所述扩增包括在适当的温度下在如权利要求I 9之一所述的培养基中培养所述干细胞群。
26.人类CD34—干细胞群，其(i)具有分化的能力，和(ii)由人类CD34—干细胞群的扩增获得，其中所述扩增包括在适当的温度下在如权利要求I 9之一所述的培养基中培养所述干细胞群。
全文摘要
本发明提供细胞生长培养基，其包含(a)无直径大于0.22μm的固体物质的人类血小板裂解物，其中所述裂解物构成所述细胞生长培养基的总体积的2％至15％；(b)无直径大于0.22μm的固体物质的人类新鲜冰冻血浆(FFP)滤出物，其中所述FFP滤出物构成所述细胞生长培养基的总体积的1％至10％；(c)浓度为所述细胞生长培养基的0U/ml至10U/ml的肝素；(d)浓度为0.5mM至10mM的L-谷氨酰胺；和(e)适用于哺乳动物细胞生长的无血清低葡萄糖培养基，其中所述无血清低葡萄糖培养基构成所述细胞生长培养基的总体积的75％至97％，并且可包含部分(d)的L-谷氨酰胺；其中所述细胞生长培养基允许人类CD34”干细胞的扩增，且其中得到的经扩增的CD34”干细胞保持分化的能力。本发明还提供了相关的细胞生长培养基补充物、无菌的人类血小板裂解物和人类新鲜冰冻血浆(FFP)滤出物、试剂盒、含CD34’干细胞的组合物，以及相关的生产和细胞扩增方法。
文档编号C12N5/0775GK102686725SQ201080059394
公开日2012年9月19日 申请日期2010年12月23日 优先权日2009年12月23日
发明者克里斯廷·冈瑟, 埃琳娜·阿塞瓦 申请人:埃普塞斯有限责任两合公司