专利名称：用于人胚胎干细胞分化的组合物和方法
用于人胚胎干细胞分化的组合物和方法
背景技术：
本发明涉及用于人胚胎干细胞分化的组合物和方法，具体地涉及用于将人胚胎干细胞向定形内胚层细胞分化的组合物和方法。人胚胎干细胞(ESC)具有卓越的无限自我更新能力以及分化成为包括发育中胚胎的三个胚层的所有细胞的潜力，这使得其作为用于再生性药物中的细胞来源和作为早期人发育模型都是有吸引力的。通过与糖原合成酶激酶(GSK-3)抑制剂温育，可以将鼠胚胎干细胞保持在自我更新的状态。例如，Bone等人(2009)中，描述了多种GSK-3抑制剂，所述抑制剂能够促进鼠胚胎干细胞的自我更新。
在体内正常发育过程中发生的事件的顺序可能为理解ESC分化的控制提供了重要的线索。定形内胚层(DE)在早期胚胎发生的原肠胚形成阶段，当原胚层、中胚层、内胚层和外胚层的形成发生时出现。在这一阶段，未分化的上胚层细胞通过称作原条(primitivestreak) (PS)的结构迁移。所述的中胚层和DE指定在PS的前部区域，并且认为是从普通的祖细胞群体，中内胚层产生(Tada等人，2005)。有效地产生定形内胚层的能力具有很大的临床重要性，所述的定形内胚层是产生内胚层衍生的细胞谱系的前体细胞类型，所述的内胚层衍生的细胞谱系包括肝脏胰腺、肺、甲状腺和肠的那些。具体地，从治疗和药学的观点看，需要衍生具有肝脏潜能的内胚层。对于移植疗法来说，缺少可用的供体肝脏。除此之外，需要用于预测毒理学的功能性肝细胞。当前，将原代人肝细胞用于药学筛选，但是伴随细胞的缺乏，以及该细胞类型的增殖和维持不充分，必须发现可替换的来源，并且来自人ESC的肝细胞带来巨大的希望。发明概述根据本发明的一个方面，提供了用于将人胚胎干细胞或者人胚胎干细胞群向定形内胚层特有的细胞或细胞群分化的方法，该方法包括将所述的细胞或者细胞群与GSK-3抑制剂温育。引人注目的是，发现了与GSK-3抑制剂在促进鼠胚胎干细胞的自我更新中的作用直接相比，当给予到人胚胎干细胞时GSK-3抑制剂能够诱导分化。根据本发明的另一个方面，提供了 GSK-3抑制剂用于将人胚胎干细胞或者人胚胎干细胞群向定形内胚层特有的细胞或细胞群分化的用途。根据本发明的另一个方面，提供了人胚胎干细胞分化组合物，所述的组合物包含GSK-3抑制剂，其中所述的组合物能够将将人胚胎干细胞或者人胚胎干细胞群向定形内胚层特有的细胞或细胞群分化。同样地，在一个实施方案中，提供了将人胚胎干细胞向定形内胚层细胞分化的组合物，所述的组合物包含GSK-3抑制剂。根据本发明的另一个方面，提供了诱导定形内胚层特有的细胞或细胞群向肝细胞样细胞或者肝细胞样细胞群分化的方法，所述的方法包括将所述的细胞或细胞群与GSK-3抑制剂温育。
根据本发明的另一个方面，提供了 GSK-3抑制剂用于诱导定形内胚层特有的细胞或细胞群向肝细胞样细胞或者肝细胞样细胞群分化的用途。根据本发明的另一个方面，提供了定形内胚层分化组合物，所述的组合物含有GSK-3抑制剂，其中所述的组合物能够将定形内胚层特有的细胞或细胞群向肝细胞样细胞或者肝细胞样细胞群分化。 同样地，在一个实施方案中，提供了定形内胚层向肝细胞样细胞分化的组合物，所述组合物包含GSK-3抑制剂。根据本发明的又一个方面，提供了用于诱导人胚胎干细胞或者人胚胎干细胞群向肝细胞样细胞或肝细胞样细胞群分化的方法，所述的方法包括将所述的细胞或细胞群与GSK-3抑制剂温育。根据本发明的另一个方面，提供了 GSK-3抑制剂用于诱导人胚胎干细胞或人胚胎干细胞群向肝细胞样细胞或肝细胞样细胞群分化的用途。根据本发明的另一个方面，提供了人胚胎干细胞分化组合物，所述组合物包含GSK-3抑制剂，其中该组合物能够将人胚胎干细胞或者人胚胎干细胞群向肝细胞样细胞或肝细胞样细胞群分化。同样地，在一个实施方案中，提供了人胚胎干细胞向肝细胞样细胞分化的组合物，所述组合物含有GSK-3抑制剂。优选地，所述的方法是体外方法。在本发明的另一个实施方案种，提供了包含在本文中描述的组合物的培养基。优选的培养基的实例包括mTeSRl (RTM)化学限定hESC培养基(来自Stem CellTechnologies)和补加了 KO血清替代物的KnockOut (KO)达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM ;Invitrogen)。同样地，在一个实施方案中，提供了人胚胎干细胞向定形内胚层分化的培养基，所述培养基包含GSK-3抑制剂。在另一个实施方案中，提供了定形内胚层向肝细胞样细胞分化的培养基，所述培养基包含GSK-3抑制剂。在再一个实施方案中，提供了人胚胎干细胞向肝细胞样细胞分化的培养基，所述培养基包含GSK-3抑制剂。根据本发明又一个方面，提供了按照本文所描述的方法得到的细胞或者细胞群。本发明的再一个方面涉及人胚胎干细胞和GSK-3抑制剂在制备用于在受试者中治疗肝脏疾病，或者重建受损肝脏的药物中的用途。本发明的另一个方面涉及定形内胚层细胞和GSK-3抑制剂在制备用于在受试者中治疗肝脏疾病，或者重建受损肝脏的药物中的用途。本发明的又一个方面涉及本文所描述的细胞或细胞群在制备用于在受试者中治疗肝脏疾病，或者重建受损肝脏的药物中的用途。本发明的另一个方面涉及在受试者中治疗肝脏疾病，或者重建受损肝脏的方法，所述的方法包括向受试者给予含有人胚胎干细胞和GSK-3抑制剂的组合物。本发明的又一个方面涉及用于在受试者中治疗肝脏疾病，或者重建受损肝脏的方法，所述的方法包括向受试者给予含有定形内胚层细胞和GSK-3抑制剂的组合物。
本发明的再一个方面涉及在受试者中治疗肝脏疾病，或者重建受损肝脏的方法，所述的方法包括向受试者中给予组合物，所述组合物包含本文所描述的细胞或细胞群。优选地，所述的肝脏疾病与肝脏组织的损失、损伤或者缺少相关联。肝脏疾病的实例包括肝炎、肝硬化、血色素沉着症、Wilson病、苯丙酮尿症或者影响肝脏的遗传性疾病(例如 Crigler-Najjar 综合征)。损伤的肝脏可以导致，例如，随后患肝脏疾病的延长或者随后去除部分或者全部肝脏的手术。同样地，术语“重建受损肝脏”可以指在受试者中重建全部或者部分的肝脏。优选地，所述的受试者是患肝脏疾病的患者，或者经历手术以去除全部或部分肝脏的患者。优选地，所述的受试者是人。给予根据本发明的药物所需要的步骤取决于牵涉的肝脏疾病或者肝脏重建的性质。该规程对于本领域技术人员来说是已知的，并且可以相应地进行实施。例如，其可以将 本发明的药物或者组合物通过注射直接给予到需要的部位。作为选择，所述的药物或者组合物可以在外科手术过程中给予，例如在从患者中去除一部分肝脏之后。根据本发明的又一个方面，还提供了在本文中描述的细胞或细胞群用于筛选药物毒性的用途。例如，在本文中描述的肝细胞样细胞可以用于药物毒性的筛选方法中。在本发明的一个方面，提供了评估化合物对肝脏细胞毒性的方法，所述的方法包括(i)将所述的化合物与本文所述的细胞或者细胞群温育；并且(ii)评估该化合物对所属细胞或者细胞群的毒性，其中所述的毒性指示了肝脏毒性。毒性可以通过本领域技术人员已知的方法来测量。在一个实例中，细胞死亡指示了化合物对于细胞的毒性。在一个实例中，测量从裂解的细胞释放的乳酸脱氢酶(LDH)指示了毒性。在另一个实例中，细胞形态学的改变指示毒性。在一个实例中，样品中有活力细胞的数量的降低指示了化合物的毒性。在样品中，有活力细胞的数量可以在使用活体染料染色之后进行计数。细胞毒性检测试剂盒可在市场上买到，并且该试剂盒的实例是来自Sigma Aldrich的TOXl细胞毒性比色测定试剂盒(TOXlCell toxicity Colorimetric Assay Kit),其通过线粒体脱氢酶来测量活细胞的活性。优选地,所述的细胞或细胞群是如本文所述的肝细胞样细胞或者肝细胞样细胞群。同样地，在一个实施方案中，提供了如本文所述的肝细胞样细胞或者肝细胞样细胞群用于评价化合物对肝脏细胞毒性的用途。优选地，所述的方法是体外方法。优选地，所述的方法指示该化合物的体内肝脏毒性。优选地，所述的GSK-3抑制剂是具有以下结构的化合物，或者其功能性衍生物、类
似物或者同系物
权利要求
1.一种用于诱导将人胚胎干细胞或者人胚胎干细胞群向定形内胚层特有的细胞或细胞群分化的方法，该方法包括将所述的细胞或者细胞群与GSK-3抑制剂温育。
2.一种用于诱导将定形内胚层特有的细胞或细胞群向肝细胞样细胞或肝细胞样细胞群分化的方法，该方法包括将所述的细胞或者细胞群与GSK-3抑制剂温育。
3.一种用于诱导将人胚胎干细胞或者人胚胎干细胞群向肝细胞样细胞或肝细胞样细胞群分化的方法，该方法包括将所述的细胞或者细胞群与GSK-3抑制剂温育。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述的GSK-3抑制剂是具有以下结构的化合物，或者其功能性衍生物、类似物或者同系物
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述的GSK-3抑制剂选自具有以下结构之一的化合物，或者其功能性衍生物、类似物或者同系物
6.通过根据前述权利要求中任一项所述的方法得到的细胞或细胞群。
7.GSK-3抑制剂用于诱导人胚胎干细胞或人胚胎干细胞群向定形内胚层特有的细胞或细胞群分化的用途。
8.GSK-3抑制剂用于诱导定形内胚层特有的细胞或细胞群向肝细胞样细胞或肝细胞样细胞群分化的用途。
9.GSK-3抑制剂用于诱导人胚胎干细胞或人胚胎干细胞群向肝细胞样细胞或肝细胞样细胞群分化的用途。
10.人胚胎肝细胞和GSK-3抑制剂在制备用于在受试者中治疗肝脏疾病或者重建受损肝脏的药物中的用途。
11.定形内胚层细胞和GSK-3抑制剂在制备用于在受试者中治疗肝脏疾病或者重建受损肝脏的药物中的用途。
12.根据权利要求7到11中任一项所述的用途，其中所述的GSK-3抑制剂是具有以下结构的化合物，或者其功能性衍生物、类似物或者同系物
13.根据权利要求12所述的用途，其中所述的GSK-3抑制剂选自具有以下结构之一的化合物，或者其功能性衍生物、类似物或者同系物
14.一种将人胚胎干细胞向定形内胚层细胞分化的组合物，所述的组合物包含GSK-3抑制剂。
15.一种将定形内胚层向肝细胞样细胞分化的组合物，所述的组合物包含GSK-3抑制剂。
16.一种将人胚胎干细胞向肝细胞样细胞分化的组合物，所述的组合物包含GSK-3抑制 >剂。
17.根据权利要求14到16中任一项所述的组合物，其中所述的GSK-3抑制剂是具有以下结构的化合物，或者其功能性衍生物、类似物或者同系物
18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述的GSK-3抑制剂选自具有以下结构之一的化合物，或者其功能性衍生物、类似物或者同系物
19.一种培养基，其包含根据权利要求14到18中任一项所述的组合物。
20.一种用于在受试者中治疗肝脏疾病或者重建受损肝脏的方法，该方法包括向受试者给予包含人胚胎干细胞和GSK-3抑制剂的组合物。
21.一种用于在受试者中治疗肝脏疾病或者重建受损肝脏的方法，该方法包括向受试者给予包含定形内胚层细胞和GSK-3抑制剂的组合物。
22.根据权利要求20或21所述的方法，其中所述的GSK-3抑制剂是具有以下结构的化合物，或者其功能性衍生物、类似物或者同系物
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述的GSK-3抑制剂选自具有以下结构之一的化合物，或者其功能性衍生物、类似物或者同系物
24.根据权利要求6所述的细胞或细胞群在制备用于在受试者中治疗肝脏疾病或者重建受损肝脏的药物中的用途。
25.一种用于在受试者中治疗肝脏疾病或者重建受损肝脏的方法，该方法包括向受试者给予组合物，所述的组合物包含根据权利要求6所述的细胞或细胞群。
26.根据权利要求6所述的细胞或细胞群用于筛选药物毒性的用途。
27.一种用于评估化合物对肝脏细胞的毒性的方法，该方法包括 (i)将所述的化合物与根据权利要求6所述的细胞或细胞群温育；并且( )评估所述化合物对所述细胞或细胞群的毒性， 其中所述的毒性指示了肝脏毒性。
全文摘要
描述了用于诱导将人胚胎干细胞或人胚胎干细胞群向定形内胚层特有的细胞或细胞群分化的方法，所述的方法包括将所述的细胞或细胞群与GSK-3抑制剂进行温育。还描述了用于诱导将定形内胚层特有的细胞或细胞群向肝细胞样细胞或肝细胞样细胞群分化的方法，以及用于诱导将人胚胎干细胞或人胚胎干细胞群向肝细胞样细胞或肝细胞样细胞群分化的方法。还描述了由所述方法得到的细胞和该细胞在治疗及毒性筛选中的用途。
文档编号C12N5/0735GK102834505SQ201080062002
公开日2012年12月19日 申请日期2010年11月26日 优先权日2009年11月27日
发明者H·K·博恩, D·托什, M·J·威尔哈姆 申请人:干细胞安全用药有限公司