专利名称：动物成纤维细胞向乳腺上皮样细胞转化的定向诱导方法
背景技术：
目前在生物学和生物技术领域，哺乳动物胚胎工程、组织工程以及同源重组转基因动物的研制成为新的研究热点，这三大领域的研究均需要以哺乳动物胚胎干细胞(ESC)为基点。而ESC的建系本身，就是一大难题，成为上述领域的限速步骤，也成为世界范围生物学家研究的难点、热点和焦点。胚胎干细胞(Embryonic stem cell，ESC)是一种可以在体外培养，能无限自我更新，又具有分化为动物个体各种组织细胞(包括生殖细胞)的潜能的细胞。正是由于这些特征，使ES细胞成为生物高科技的核心技术。然而ESC的建系本身，就是一大难题，成为上述领域的限速步骤。众所周知，哺乳动物胚胎干细胞系，除小鼠ESC技术比较成熟外，其它哺乳动物的ESC系技术还不成熟，只有个别实验室获得了人、牛、猪等ESC，且细胞系并不稳定，重复性差。ESC的建系研究需要昂贵的经费，实验条件要求苛刻，不定因素很多，取材难，体外培养也非常困难，且随机分化难以控制，因此，获得稳定ESC系是相当困难的。而成纤维细胞，取材容易，体外培养条件要求较宽松，不需要添加细胞因子，因而成本比ESC要低的多，技术容易掌握，细胞特性和传代相对稳定，重复性强。不足之处与ESC相比，成纤维细胞传代代数有限，分化的全能性较差。目前，科学家们已开始用成纤维细胞进行基因同源重组，并已有成功报道[沈子龙等，中国药科大学学报，2002，33(2)81～86]，但靶位的选择受到极大的限制，成功率也很低，(受到靶基因位点活化或抑制状态的限制，ESC同样受此限制)，因为，外源基因大多趋向于整合到处于松散(解聚)、“敏感”即活化状态的染色质部位，通常是转录活跃的区域。而转基因时的细胞(通常是受精卵、胚胎干细胞或成纤维细胞)通常并不处于所需状态，即目标基因靶位并不处于活化状态，造成外源基因不能整合到正确靶位。因此如果用适当诱导因子对细胞进行诱导，使细胞可以定向分化，以达到有选择地活化目标基因靶位就可以提高外源基因整合的准确性。根据这一原理，我们尝试用相应激素(雌激素和孕激素和胰岛素)诱导成纤维细胞向乳腺上皮样细胞分化，致使细胞处于泌乳或受孕似的模拟状态，使相应基因族活化，人为制造目标靶位的敏感区，使外源基因更准确整合到目标靶位上或提供更多的正确的整合位点(这对于ESC同样重要和适用)，提高基因打靶的效率。这一发明的直接应用就是可以克服转基因技术的瓶颈一外源基因随机整合所致转基因动物的遗传与基因表达的不确定性，通过细胞转染，筛选同源重组克隆。其次，提示哺乳类成纤维细胞同哺乳动物ESC一样也具有定向诱导分化的潜力，成纤维细胞可以替代或部分替代胚胎干细胞用做组织工程或胚胎工程的细胞平台。
本发明所述的定向诱导动物成纤维细胞向特定组织分化的方法，包括来源于不同发育时期、不同组织来源的成纤维细胞；各种诱导因素对成纤维细胞的诱导；分化细胞的内源特征基因的表达检测；组织特异表达的基因载体(包括报告基因)的转基因表达检测，以及细胞形态的变化。
在本发明的方法中，所述的动物成纤维细胞可以是哺乳类，也可以扩展到脊椎动物类。动物成纤维细胞的体外培养，按照常规方法[D.L.斯佩克特，R.D.戈德曼，L.A.莱因万德著，黄培堂等译。细胞实验指南，科学出版社，2001年2月第一版，p27-31(书名原文CellA LaborataryManual)进行。
所述的分化细胞的内源特征基因的表达检测，是指分化细胞或同类分化细胞特异表达基因的mRNA或蛋白检测，如RT-PCR(或RT-PCR-Southern Blot)、Northern Blot、Western Blot或Elisa检测。在我们的实验中用乳腺上皮细胞特异表达的酪蛋白基因片段为探针，用RT-PCR-Southem Blot方法检测经泌乳激素诱导后的小鼠胎儿成纤维细胞，获得了乳腺上皮细胞特异的酪蛋白基因的表达信号。结果表明，小鼠成纤维细胞在与泌乳有关的激素诱导下，促使原“沉默”的乳蛋白基因转为活化状态。使成纤维细胞在一定程度上模拟了乳腺上皮细胞的基因表达模式。
所述的组织特异表达的基因载体，是指只能在特定组织细胞中表达的基因载体，即此类载体上编码基因的表达是受到组织类型限定的。如乳腺特异表达的启动子(Promoters)α-酪蛋白(α-Casein)、β-酪蛋白(β-Casein)、β-乳球蛋白(β-Lactoglobulin)、κ-酪蛋白(κ-Casein)等的启动子调控的基因表达只能在乳腺组织中表达。通过转基因瞬时表达技术，可以验证外源乳蛋白启动子在经相应激素诱导后的小鼠胎儿成纤维细胞中是否具有功能，进而表明此成纤维细胞是否具有了乳腺上皮样细胞的内环境。进一步提供成纤维细胞向乳腺上皮细胞诱导分化的实验证据。
所述与泌乳相关的诱导物，包括激素、蛋白因子及有机分子。其中所述的激素有催产素、孕酮、胰岛素、催乳素和生长激素；具有建立和维持乳腺泌乳系统和促进乳汁蛋白表达功能的蛋白因子，如胰岛素样生长因子、表皮生长因子、血管生长因子、肿瘤坏死因子；有机分子涉及某些具相同功能的甾醇类分子。在我们的实验中用到了三种结构不同的激素，蛋白类-胰岛素、环肽类-催产素、甾醇类-孕酮，均获得了阳性结果，表明具相同功能的物质均可作为同向分化的诱导物。
Prime-a-Gene Labeling System和限制性内切酶均购自Promega公司，α-P32-dATP为北京亚辉生物医药工程公司产品；PCR试剂盒购自日本TaKaRa Biotechnology(大连)有限公司；尼龙杂交膜为Hybond公司产品；Reverse Transcription kit是日本TAKARA产品；DNA纯化试剂盒为鼎国科技有限公司产品；细胞培养基D-MEM、Trizol Reagent为GiBco BRL产品；细胞转染试剂盒Lipofectamine Reagent为Invitrogen产品；缩宫素注射液(Oxytocin Injection，10单位/ml，又称催产素)，南京新天生物化学制药有限公司；黄体酮注射液(Pregnendione；Progesterone Injection，20mg/ml，又称孕烯二酮、孕[甾]酮、孕烯醇酮)，上海通用药业股份有限公司；胰岛素注射液(Insulin Injection，400单位/10ml)，中国徐州万邦生化制药有限公司。其它试剂均是国产分析纯。(2)荧光倒置显微镜，Olympus CK40/U-RFLT50(日本产)。(3)实验动物.昆明白小鼠。(4)基因、基因构件和引物以质粒pEGFP-N1(CLONTECH产品)的结构为基本骨架，基因构件的5’上游启动子-CMV启动子用乳蛋白基因的启动子替代，报告基因为增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)，共构建了三种乳腺细胞特异表达的基因载体牛α-s1-casein-EGFP，绵羊β-Casein-EGFP，绵羊β-Lactoglobulin-EGFP(见
图1)。牛α-s1-casein的克隆见文献[陈瑞环，汪波，张玉芝等，生物工程学报19928(3)218-226]，绵羊β-Casein启动子和β-乳球蛋白β-Lactoglobulin启动子序列，均由本室克隆，经测序鉴定(上海生工)，所获基因序列与GenBank中登录的已知序列完全相符(β-Casein登录号为X79703；β-Lactoglobulin为X12817)。小鼠α-s-casein cDNA(650bp)和β-Casein cDNA(420bp)片段(为本室克隆)用做Southern杂交探针。(5)RT-PCR-Southem杂交方法检测内源α-s1-casein和β-Casein基因的表达引物依据α-s1-casein和β-Casein蛋白编码区序列(GenBank登录号分别为M36780和BC013332)设计的(由上海生工公司合成)，α-s1-caseinF引物5’-CTCATCCTCACCTGCCTCG-3’，R引物5’-GTGCCTGATCCACTACACTCAT-3’；β-Casein F引物5’-GGTGAATCTCATGGGACA-3’，R引物5’-GAAGGGTGCTACTTGCTG-3’。以小鼠β-actin mRNA做为内对照RT-PCR检测(参见序列GenBankAccession No.AB004047)，F引物5′-AGGGAAATCGTGGGTGACATCAAA-3′和R引物5′-ACTCATCGTACTCCTGCTTGCTGA-3′。(6)小鼠胚胎成纤维细胞的培养与激素诱导小鼠胚胎成纤维细胞的培养，按照文献[D.L.斯佩克特，R.D.戈德曼，L.A.莱因万德著，黄培堂等译。细胞实验指南，科学出版社，2001年2月第一版，p27-31(书名原文CellA Laboratary Manual)]。
用于RT-PCR-Southem杂交检测的激素诱导按常规方法将细胞传至25毫升的培养瓶(105×细胞/瓶)中，于37℃、5％CO2中培养至90％汇合度(confluence)时，换新鲜培养基，并按表加入不同激素。
用于基因转染的激素诱导将细胞按3×104/孔传代到6孔板(或35mm)，正常培养(D-MEM+5％胎牛血清+青霉素+链霉素)细胞至90％汇合度(confluence)时，进行转染[方法见(9)]，换新鲜培养基，并按下表加入不同激素。
继续培养三天，分别收集细胞，待提取总RNA。(7)提取总RNA按试剂说明进行，主要有用Trizol reagent 0.5ml(对于25毫升培养瓶培养的细胞数)吹打细胞，使之破解。加入氯仿与水饱和酚混合液，抽提两次。取上清液，加入等倍体积的异丙醇，充分混合，10,000rpm离心10分钟，取沉淀，用70％乙醇洗一次。(8)RT-PCR-Southern杂交检测内源酪蛋白基因的表达用总RNA约1微克，以olig(dT)14为引物，进行反转录合成cDNA第一条链(按照试剂盒说明书进行)。PCR反应系统按照试剂盒说明进行，以2ul cDNA第一链为模板，每一反应含上游引物和下游引物各30pmol。分别以小鼠α-s1-casein和β-Casein片段为阳性对照(已经测序证明序列正确)，PCR循环95℃180sec，46℃60sec，72℃60sec，一个循环；进入35循环94℃60sec，50℃60sec，72℃60sec。α-s1-casein的PCR长度770bp，β-Casein的PCR长度460bp。取5ul PCR反应液进行电泳(0.8％琼脂糖凝胶)，再进行Southern转膜，和常规Southern杂交(65℃)[Sambrook J，Fritsch E F，Maniatis T.Molecular Cloning.A LaboratoryManual.2nd ed.New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press.1989.中译本，金冬雁黎孟枫等译.分子克隆，实验指南.第二版.北京科学出版社，1992，474～504]。杂交探针为阳性模板的PCR片段，用α-P32-dATP随机引物法标记。β-actin PCR条件95℃180sec，46℃60sec，72℃60sec，一个循环；56℃60sec，72℃60sec，94℃60sec，35循环，PCR长度为478bp。(9)小鼠胚胎成纤维细胞的基因转染与观察用Lipofectamine Reagent将上述三种乳腺特异表达的基因载体对正常培养的成纤维细胞(90％汇合度)进行转染，每一基因构件转染经不同激素诱导的5孔细胞，方法按试剂盒说明，每一转染反应用约1微克质粒DNA。转染5小时后，用含不同激素的DMEM-胎牛血清(10％)换掉转染液，继续在37℃、5％CO2下培养，直至显微镜下观察。结果1.乳腺上皮细胞特异表达的酪蛋白基因在小鼠成纤维细胞中的诱导表达小鼠胎儿成纤维细胞在经胰岛素、黄体酮、缩宫素以及这三种激素的混合诱导三天后，经RT-PCR-Southern杂交检测，结果表明对于α-Casein基因，胰岛素和混合激素均可诱导其表达；缩宫素信号很微弱；未诱导对照组和黄体酮组均未见其mRNA信号(图2A)。对于β-Casein基因，三种激素分别诱导和混合诱导均使该基因进行了表达，但表达水平有差异；而未经诱导的对照组则无特征信号(图2B)。由此证明，在体外培养体系，与泌乳有关的激素可以直接作用于胎儿成纤维细胞，促使原“沉默”的乳蛋白基因转为活化状态。但不同激素其作用机制也不相同，故表现为表达水平的差异。
内源酪蛋白基因的表达是具有严格的组织特异性的，正常情况下只能在乳腺上皮细胞中表达，上述结果也符合这一特征不管是S-1-Casein基因或者是β-Casein基因，未经激素诱导的对照组均未见其表达。2.乳腺特异表达基因构件在胎儿成纤维细胞中的转基因瞬时表达将三种乳腺特异表达基因构件牛S-1-Casein启动子指导的绿色荧光蛋白基因表达载体(α-Casein-EGFP-N1)、绵羊β-Casein启动子指导的绿色荧光蛋白基因表达载体(β-Casein-EGFP-N1)和绵羊β-乳球蛋白启动子指导的绿色荧光蛋白基因表达载体(β-LG-EGFP-N1)分别转染胎儿成纤维细胞，再分别用胰岛素、黄体酮、缩宫素，以及这三种激素混合诱导。结果显示β-Casein启动子指导的绿色荧光蛋白基因表达载体的成纤维细胞，经过缩宫素、胰岛素，“混合激素”诱导后，均可检测到绿色荧光蛋白的瞬时表达(图3A，B，C)；转染S-1-Casein启动子指导的绿色荧光蛋白基因表达载体的成纤维细胞，经过黄体酮(图3D)和“混合激素”诱导的细胞可检测到绿色荧光蛋白基因的瞬时表达；经缩宫素诱导的β-LG-EGFP-N1也可以表达(图3E)。而未经激素诱导的成纤维细胞对照组，同样转染了上述三种基因构件，均未观察到绿色荧光蛋白的表达。这一结果进一步证明经过激素的诱导后，成纤维细胞的基因表达模式(patterns)确实发生了变化使得细胞由处于成纤维细胞内环境状态向乳腺上皮细胞内环境转换，进而使得乳汁蛋白基因位点转为活化状态。也就是说经上述处理的成纤维细胞在一定程度上模拟了乳腺上皮样细胞的内环境或生理状态。但不同激素对不同基因启动子的作用是有差异的。3.形态学变化经三种激素分别诱导或混合诱导的小鼠胎儿成纤维细胞，在培养一周后，形态开始发生变化；培养两周后，形态差异较大，且未经诱导和缩宫素诱导的细胞已呈现死亡迹象，而经胰岛素、黄体酮以及三激素混合诱导的细胞仍生活状态良好(图4)。上述结果提示1)成纤维细胞可能具有相当大的可诱导性或多能性分化的潜力。
2)作用于分化末端组织的激素(如本文用到的三种激素，尤其是黄体酮和缩宫素)，除了其正常的生理功能外，还可能具有其它的生物学作用，而不是通常认为的那样，功能单一或局限于某一方面。胰岛素的促细胞生长和促蛋白合成的作用，已有文献报道。但其可以直接作用于胎儿成纤维细胞却是首次发现。而黄体酮和缩宫素直接与胎儿成纤维细胞作用更是首次发现。
3)可以通过不同诱分化因子如激素、细胞因子和其它物理因素等定向诱导成纤维细胞向不同方向进行分化，为基因打靶和组织工程提供可进行遗传修饰的细胞平台。
总上所述，与泌乳相关的这三种激素，不仅可以改变成纤维细胞的基因表达模式，而且，还可以在一定程度上使其形态发生了改变。小鼠成纤维细胞在泌乳激素作用下确实可以向乳腺上皮样细胞---一种末端分化组织细胞转化。
权利要求
1.一种利用成纤维细胞定向诱导细胞分化的方法，其特征在于成纤维细胞通过与泌乳相关的诱导物作用，定向向乳腺上皮样细胞分化的方法，该方法还涉及相关的分子生物学检测方法。
2.根据权利要求1所述的方法，其中成纤维细胞取自脊椎动物的胎儿组织、成体组织的肌肉、皮肤、内脏、骨骼及血液等经培养得到的成纤维样细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述的与泌乳相关的诱导物有激素、蛋白因子及有机或无机分子。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述的激素有催产素、孕酮、胰岛素、催乳素和生长激素；蛋白因子有表皮生长因子、血管生长因子、肿瘤坏死因子等；有机分子涉及某些甾醇类分子。
5.根据权利要求1所述的方法，应用于制备乳腺反应器或定向诱导成纤维细胞向特定组织转化，以及提供组织工程所需的细胞。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述的相关的生物学检测方法包括乳腺上皮细胞特异表达的基因一内源性乳汁蛋白mRNA水平和蛋白水平的检测；转基因瞬时表达一由乳汁蛋白启动子或5’上游调控序列与报告基因和/或目标基因构建乳腺上皮细胞特异表达载体，通过基因导入方法将基因构件导入细胞，报告基因或特征基因获得表达；细胞形态学的变化细胞由纤维状向上皮状转变。
全文摘要
本发明提供了一种动物成纤维细胞向乳腺上皮样细胞诱导分化的方法。包括使用诱导因子，如与泌乳相关的激素(如催产素、孕酮、胰岛素、催乳素等)、具有诱导作用的蛋白因子、有机分子及基因诱导等，以适当浓度和条件与细胞作用；使用分子杂交技术进行内源性乳汁蛋白mRNA水平和蛋白水平的检测；构建乳腺上皮细胞特异表达载体；使用转基因瞬时表达技术检测外源乳腺上皮细胞特异的基因表达；诱导后细胞形态学发生变化细胞由纤维状向上皮细胞状转变。
文档编号C12N5/06GK1472311SQ0212718
公开日2004年2月4日 申请日期2002年7月30日 优先权日2002年7月30日
发明者张靖溥, 王森, 朱少侠 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所