具有高醇产率的嗜热性意大利热厌氧杆菌marato亚种的制作方法

专利名称：具有高醇产率的嗜热性意大利热厌氧杆菌marato亚种的制作方法
技术领域：
本发明涉及属于意大利热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter italicus)的新的分离的水解木聚糖的嗜热细菌细胞(意大利热厌氧杆菌marato亚种(T. italicus subsp.Marato))、包含所述细胞的分离的菌株、产生发酵产物的方法(包括培养所述细胞)，以及所述细胞用于产生发酵产物的用途。
背景技术：
产生发酵产物例如こ醇和乳酸的エ业面临使生产过程从相对容易转化但昂贵的淀粉质材料的发酵改变成复杂但廉价的木质纤维素生物质(例如木材和来自农作物的残渣例如禾杆)的发酵的挑战。与包含均质且易于水解的聚合物的淀粉不同，木质纤维素生物质(lignocellulosic biomass)包含纤维素(25-53%)、半纤维素(20-35%)、多酌 木质素(10-25%)和其它可提取组分。一般地，木质纤维素生物质的利用中的第一歩骤是预处理步骤，以分级分离木质纤维素材料的组分和増加其表面积。最常使用的预处理法是酸水解，其中使木质纤维素材料经历酸例如硫酸，由此糖聚合物纤维素和半纤维素被部分或完全水解成它们的组成性糖単体。另ー种类型的木质纤维素水解是蒸汽爆破，其包括通过蒸汽注射将木质纤维素材料加热至190-230°C的温度。第三个方法是湿氧化法，其中在150-185°C下用氧处理材料。预处理后可进行酶促水解以完全释放糖単体。该预处理步骤导致纤维素水解成葡萄糖，同时半纤维素被转化成戊糖木糖和阿拉伯糖以及己糖葡萄糖、半乳糖和甘露糖。因此，与淀粉不同，木质纤维素生物质的水解导致除己糖外还有戊糖的释放。这暗示着，有用的发酵生物需要能够将己糖和戊糖都转化成期望的发酵产物例如こ醇。用于例如こ醇发酵的传统微生物，啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)不代谢戍糖例如木糖和阿拉伯糖，因此,需要广泛的代谢工程来改善对木质纤维素底物的性能。革兰氏阳性嗜热菌具有优于常规こ醇生产菌株的独特有利方面。主要的有利方面是它们的广泛底物特异性和高こ醇天然产量。然而，在高温(55-70°C )下进行的こ醇发酵具有优于嗜常温(mesophilic)发酵的许多有利方面。嗜热发酵的ー个有利方面是，在连续培养中污染问题最小化，因为只有少数微生物能够在这样高的温度下在未脱毒的木质纤维素水解产物中生长。目前，取决于预处理法，通常必须将纤维素酶和半纤维素酶添加至预处理的木质纤维素水解产物中以释放糖单体。这些酶显著地增加了发酵产物的生产成本。然而，许多嗜热革兰氏阳性菌株具有一系列相关的酶并且如果使用嗜热革兰氏阳性菌株，则补充物的添加可变得较便宜。在高温下进行的发酵还具有额外的有利方面高产率和高底物转化以及便利的产物回收。木质纤维素水解产物包含抑制剂例如糠醛、酚类和羧酸，其可潜在地抑制发酵生物。因此，发酵生物必须也耐受这些抑制剂。水解产物的抑制作用可通过在发酵之前应用脱毒方法来降低。然而，増加该额外处理步骤显著提高了发酵产物的总成本并且应当优选地避免。例如，已估计，柳树水解产物的超施石灰处理(overliming)使利用大肠杆菌(Escherichia coli)的こ醇生产成本增加22%(Von Sivers等人，1994)。因此，由于脱毒处、理的高成本，优选地，微生物能够从未脱毒的半纤维素或全纤维素水解产物产生发酵产物，从而使其可用于基于木质纤维素的エ业发酵过程。如果潜在的微生物能够在高浓度的木质纤维素水解产物即具有高干物质含量的木质纤维素 水解产物上生长，那么也是特别有利的。当微生物用于醇生产例如こ醇生产时，这是特别重要的，因为蒸馏成本随着醇浓度的减小而増加。US 6，555，350描述了能够将戍糖转化成こ醇的热厌氧杆菌菌株。然而,该菌株产生大量乳酸副产品，并且仅在干物质浓度低于6%wt/wt的木质纤维素水解产物中进行了测试。W02007134607描述了能够在高浓度未脱毒的水解产物中将戊糖转化成こ醇的热厌氧杆菌菌株BGl。Kozianowski等人(1997)公开了经分离用于在果胶上生长的意大利热厌氧杆菌菌株。没有证据显示，分离的意大利菌株可在木质纤维素水解产物上良好生长或编码こ酸激酶和乳酸脱氢酶的基因可通过基因修饰除去。发明目的本发明的实施方案的ー个目的是，提供能够克服上述障碍，特别地こ醇生产中的障碍的微生物。发明概述本发明人已发现，意大利热厌氧杆菌的新型亚种意大利热厌氧杆菌Marato亚种能够产生高水平的こ醇和乳酸同时产生低水平的こ酸。在ー个方面，本发明涉及分离的意大利热厌氧杆菌细胞，其包含含有选自下列的序列的 16S rDNA SEQ ID NO 3,SEQ ID NO 4,SEQ ID N05、SEQ ID NO 6,SEQ ID NO 7,SEQID NO 8及其任意组合。在另ー个方面，本发明涉及分离的意大利热厌氧杆菌细胞，其特征在于具有与SEQID NO 9具有至少99. 7%的同一性的16S rDNA序列。在另ー个方面，本发明涉及分离的菌株，其包括根据任ー前述方面的意大利热厌氧杆菌细胞。在另ー个方面，本发明涉及产生发酵产物的方法，包括在适当的条件下培养根据本发明的细胞或根据本发明的菌株。在另ー个方面，本发明涉及根据本发明的分离的细胞或根据本发明的菌株用于生产选自酸、醇、酮和氢的发酵产物的用途。在另ー个方面，本发明涉及分离的水解木聚糖的嗜热性意大利热厌氧杆菌细胞，其产生选自酸、醇、酮和氢的发酵产物，并且其中已插入、缺失或大体上失活选自乳酸脱氢酶(EC I. I. I. 27)、こ酸激酶(EC2. 7. 2. I)、磷酸こ酰转移酶(EC 2.3. I. 8)、多糖酶、丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的ー个或多个基因。附图
简述參考附图在下文更详细地公开本发明，其中图I举例说明基于16S rRNA基因的系统发生树。条棒代表0. 01或1%的DNA序列差异；图2显示，在无搅拌的条件下在基础培养基中生长24小时后BG4和BGlO的宏观形态学(macroscopic morphology);图3 显不 BG4 和 BGlO 的显微镜分析。使用 Kappa Image Base (Metreo Module)測量细菌的大小。条棒代表5 的大小。大小测量的结果列于表2中；图4示意性显示A:ptal和akl基因在BG4和BGlO的基因组中的相对位置。包括了导致2581bp PCR产物的引物位点(pta-out-lf和AK-out-lR)，与基因组的同源性百分比示于括号中；B:用于从BG4和BGlO的基因组消除ptal和akl的敲除构建体。箭头(ptalUp)和(akldown)举例说明经构建用于介导同源重组的DNA区段；图5显示来自野生型菌株和突变体的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳(利用1%的琼脂糖凝胶)的结果。箭头指向突变体，其中Ptal和akl已被成功缺失；
·
图6显示来自野生型分离株BG4和各突变体BG4pkal的发酵产物。木糖示于左边的轴上。こ醇、乳酸(“乳酸”)和こ酸(“こ酸”)浓度示于右方的轴上(g/L)；图7显示不同实施方案的rDNA序列。本发明的详细公开内容定义在本说明书中，术语“突变体”意欲包括细菌细胞，其中基因组(包括ー个或多个染色体或潜在的染色体外DNA)已在ー个或多个位置上被改变或其中已添加或除去了 DNA。在本说明书中，术语“后代”意欲包括细菌繁殖的产物。新的生物体由ー个或多个
亲代产生。在本说明书中，术语“增殖产物”意欲包括细菌増殖、分裂或繁殖的产物。本发明的具体实施方案如上文中提及的，在ー个方面，本发明涉及分离的细胞，其包含选自下列的16SrDNA序列SEQ ID NO 3，SEQ ID NO 4，SEQ ID NO 5，SEQ ID NO 6，SEQ ID NO 7，SEQ ID NO8及其任意组合。在一个实施方案中，16S rDNA包括SEQ ID NOS 4_7的全部。在ー个方面，本发明涉及分离的意大利热厌氧杆菌细胞，其具有与SEQ ID NO 9具有至少99. 7%的同一性的16S rDNA序列。任选地，16S rDNA包含选自SEQ ID NO 3、SEQID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8 及其任意组合的序列。本发明的一个实施方案是包含具有SEQ ID NO 9的序列的16S rDNA序列的分离的细胞。位置63和68上的核苷酸可独立地选自A、T、C和G。在独立的实施方案中，位置63和68上的核苷酸分别选自A和G以及C和T。本发明的另ー个实施方案是包含由SEQID NO 9的序列组成的16S rDNA序列的分离的细胞。本发明的一个实施方案是具有包含SEQ ID NO I的16S rDNA序列的分离的细胞。本发明的一个实施方案是具有包含SEQ ID NO 2的16S rDNA序列的分离的细胞。本发明的一个实施方案是分离的细胞，其为BGlO (DSMZ登录号23015)。本发明的一个实施方案是分离的细胞，其为BG4(DSMZ登录号23012)。本发明基于分离的细菌菌株BGlO和BG4，所述菌株包含分别与SEQ ID NO I具有100%和99. 9%的同一性(分别地SEQ ID NO I和SEQ ID NO 2)的16S rDNA序列。所述菌株已根据布达佩斯条约于2009年9月30日分别在DSMZ登录号DSM 23015和DSM 23012下保藏在 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B，38124Braunschweig, Germany。
本发明的一个实施方案是包含16S rDNA的分离的细胞，所述16SrDNA包含选自SEQ ID NO 3,SEQ ID NO 4,SEQ ID NO 5,SEQ ID N06 和 SEQ ID NO 7 的序列，其中 SEQ IDNO 3,SEQ ID NO 4,SEQ ID N05、SEQ ID NO 6 和 SEQ ID NO 7 是 SEQ ID NO I 的连续部分序列。本发明的一个实施方案是包含16S rDNA的分离的细胞，所述16SrDNA包含选自SEQ ID NO 4,SEQ ID NO 5,SEQ ID NO 6,SEQ ID N07 和 SEQ ID NO 8 的序列，其中 SEQ IDNO 8,SEQ ID NO 4,SEQ ID N05、SEQ ID NO 6 和 SEQ ID NO 7 是 SEQ ID NO 2 的连续部分序列。意大利热厌氧杆菌marato亚种能够在非常高的干物质浓度的木质纤维素水解产物上生长并且产生发酵产物。在本说明书中，术语“木质纤维素水解产物”意欲命名已经历预处理步骤的木质纤维素生物质，通过该预处理步骤木质纤维素材料已至少部分分解成纤 维素、半纤维素和木质素，从而使材料的表面积增加。木质纤维素材料通常可来源于植物材料，例如禾杆、干草、花园垃圾、粉碎的木材、果壳和种壳。最常使用的预处理法是酸水解，其中将木质纤维素材料经历酸例如硫酸，由此糖聚合物纤维素和半纤维素被部分或完全水解成它们的组成性糖単体。另ー种类型的木质纤维素水解是蒸汽爆破，其包括通过蒸汽注射将木质纤维素材料加热至190-230°C的温度。第三个方法是湿氧化法，其中在150-185°C下用氧处理材料。预处理后可进行酶促水解以完全释放糖単体。该预处理步骤导致纤维素水解成葡萄糖，同时半纤维素被转化成戊糖木糖和阿拉伯糖以及己糖葡萄糖、半乳糖和甘露糖。在一些实施方案中，预处理步骤可补充有导致纤维素和半纤维素的进ー步水解的处理。此类额外的水解处理的目的是，水解在纤维素和/或半纤维素来源的酸水解、湿氧化或蒸汽爆破中产生的寡糖和可能地多糖种类，以形成可发酵的糖(例如葡萄糖、木糖和可能地其他单糖)。此类额外的处理可以是化学或酶促处理。通常通过在大约100-150°C的温度下进行酸处理(例如用含水硫酸进行处理)来实现化学水解。通常通过用ー种或多种适当的碳水化合物酶例如纤维素酶、葡糖苷酶和半纤维素酶(包括木聚糖酶)处理来进行酶促水解。令人惊讶地发现，根据本发明的细菌亚种能够在含有水解的木质纤维素生物质材料的培养基中生长，所述生物质材料具有至少10%wt/wt,例如至少15%wt/wt,包括至少20%wt/wt和甚至高达至少25%wt/wt的干物质含量。在这样的培养基中，根据本发明的细菌亚种在适当的条件(例如实施例6或7中描述的条件)下具有至少Ig糖/升发酵体积/小时(g/1/h),例如至少2g/l/h,包括至少5g/l/h,和甚至高至至少10g/l/h的体积糖转化率(volumetric sugar conversion rate)。如先前提及的，这具有巨大的有利方面其在发酵过程之前可以不必稀释水解产物，从而可能获得更高浓度的发酵产物例如こ醇，从而可降低随后回收发酵产物的成本。例如，こ醇的蒸馏成本将随醇浓度的降低而增加。根据本发明的细菌菌株为厌氧嗜热菌，其甚至能够在70°C或高于70°C的高温下生长。菌株能够在该高温下操作的事实在木质纤维素材料至发酵产物的转化中具有高度重要性。当在高温下进行时，碳水化合物至例如こ醇的转化率快得多。例如，嗜热杆菌(thermophilic Bacillus)的体积こ醇产率达到在30°C下操作的常规酵母发酵过程的10倍。因此，对于给定的エ厂生产能力，需要更小的生产エ厂，从而降低了エ厂建造成本。还如之前提及的，高温降低了来自其它微生物的污染的风险，从而減少了停エ期，増加了エ厂生产カ和降低了原料灭菌的能量需求。高工作温度还可有助于所得的发酵产物的随后回收。许多发酵产物是可用于不同技术领域(包括食品エ业和化学エ业)的有价值的商品。目前，日益增长的全球能源需求已导致对化石燃料的能源替代品产生日益増加的关注，并且来源于植物材料的こ醇(生物こ醇)作为石油来源的液体碳氢化合物产物的潜在替代物或补充物已受到特别关注。根据本发明的菌株具有能够产生许多不同发酵产物，包括酸、醇、酮和氢的潜能。在一个实施方案中，醇选自こ醇、丁醇、丙醇、甲醇、丙ニ醇和丁ニ醇。在其它实施方案中，酸为乳酸、丙酸、こ酸、琥珀酸、丁酸或甲酸并且酮为丙酮。意大利热厌氧杆菌marato亚种菌株为从包含大量预处理的木质纤维素生物质的反应器分离的野生型菌株，并且具有几个木质纤维素生物质材料的转化所需的高度有利的特征。因此，该基础菌株具有用于将戊糖和己糖转化成不同发酵产物例如乳酸和こ醇的全部遗传机制。
如根据下面的实施例变得显然的，完整16S rDNA序列的检查显示，两个密切相关的菌株BG4和BGlO都与意大利热厌氧杆菌相关，尽管16rDNA序列明确地将它们置于分开的亚种中。下列实施例显示，marato亚种的成员具有十分不同的形态学。预期，该亚家族的非常长的成员例如BGlO可有利地用于其中需要快速沉降的发酵概念。此类概念可包括其中提供细胞的浓缩物而无需使用或限制使用过滤或离心设备的概念。在下面的实施例中显示，可在有利的实施方案中修饰意大利热厌氧杆菌Marato亚种的成员例如BG4和BG10，以获得具有改善的特征的突变体或衍生物。因此，在一个实施方案中，提供了根据本发明的细菌菌株，其为意大利热厌氧杆菌Marato亚种的变体或突变体，其中ー个或多个基因已被插入、缺失或大体上失活。所述变体或突变体通常能够在40°C或高于40°C的温度下，在包含具有至少10%，至少15或至少25%wt/wt的干物质含量的水解的木质纤维素生物质材料的培养基中生长。在一个实施方案中，所述突变体能够在适当的条件下，例如在实施例6或7中描述的条件下具有极高的こ醇产率，例如至少I. 5g/L/h，至少I. 9g/L/h或至少约2g/L/h。在另ー个实施方案中，提供了用于制备意大利热厌氧杆菌Marato亚种的此类变体或突变体的方法，其中如本文中所述，插入、缺失或大体上失活ー个或多个基因。如下列实施方案中所显示的，发现编码磷酸こ酰转移酶(EC 2. 3. I. 8)和こ酸激酶(EC 2. 7. 2. I)的基因的缺失在W02007/134607中公开的相关物种马瑞氏热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter mathranii)BGl中是不可能的。已发现，使用的抗生素抗性标志整合入染色体中的不同位置，这使こ酸产生不受影响。不受理论束缚，所述基因在BGl中似乎是必需的或，其缺失太具抑制性以至于不允许明显的生长。令人惊讶地，当在意大利热厌氧杆菌Marato亚种(由菌株BG4和BGlO代表的)中尝试相同的缺失时，抗生素抗性标志被成功地整合并且替代了 Ptal和akl基因。因此，所得的突变体菌株显示几乎无こ酸产生。本发明的一个实施方案是分离的细胞，其为BGlOpka(DSMZ登录号23216)或BG4pka (DSMZ 登录号 23013)。因此，预期根据本发明的亚种可以是所述亚种的成员的修饰形式，其中已通过缺失编码磷酸こ酰转移酶(EC 2. 3. I. 8)和/或こ酸激酶(EC2. 7. 2. I)的基因而使所述基因失活，或其中已通过在所述基因中突变、缺失或插入ー个或多个氨基酸而使所述基因大体上失活。已发现，相关物种马瑞氏热厌氧杆菌BGl的こ醇生产能力可通过使编码乳酸脱氢酶(LDH) (EC I. I. I. 27)的基因失活而得到显著增強。因此，预期根据本发明的亚种可以是所述亚种的成员的修饰形式，其中已通过编码乳酸脱氢酶(LDH) (EC I. I. I. 27)的基因的缺失而使所述基因失活，或其中已通过在所述基因中突变、缺失或插入ー个或多个氨基酸而使所述基因大体上失活。本发明的一个实施方案是分离的细胞，其为BG10XL(DSMZ登录号23017)或BG4XL (DSMZ 登录号 23014)。还预期根据本发明的亚种可以是所述亚种的修饰的成员，其中已通过编码乳酸脱氢酶(LDH) (EC I. I. I. 27)的基因以及编码磷酸こ酰转移酶(EC 2. 3. I. 8)和/或こ酸激酶(Ec 2.7.2. I)的基因的缺失而使所述基因失活，或其中已通过在所述基因中突变、缺失或 插入ー个或多个氨基酸而使所述基因大体上失活。本发明还提供了用于制备所述亚种的此类修饰成员的方法，包括通过编码磷酸こ酰转移酶(EC 2. 3. I. 8)、こ酸激酶(EC 2. 7. 2. I)和/或酸脱氢酶(LDH) (EC I. I. I. 27)的基因的缺失来使所述基因失活，或通过在所述基因中突变、缺失或插入ー个或多个氨基酸而使所述基因大体上失活。在一个实施方案中，所述方法包括使编码乳酸脱氢酶(LDH) (ECI. I. I. 27)的基因以及编码磷酸こ酰转移酶(EC 2. 3. I. 8)和/或こ酸激酶(EC
2.7. 2. I)的基因失活或大体上失活。如上文中所提及的，意大利热厌氧杆菌Marato亚种具有使得其能够将己糖和戊糖转化成一系列期望的发酵产物包括こ醇的遗传机制。然而，对于某些实施方案，还可能期望将ー个或多个额外的基因插入根据本发明的菌株。因此，为了提高特定发酵产物的得率，可以有利地将ー个或多个编码多糖酶的基因插入根据本发明的菌株。因此，在具体的实施方案中，提供了根据本发明的菌株和方法，其中插入了一个或多个编码多糖酶的基因，所述多糖酶选自纤维素酶(例如EC 3.2. 1.4)；^ -葡聚糖酶，包括葡聚糖-1，3 P -葡糖苷酶(外-1，3 P -葡聚糖酶，例如EC 3. 2. I. 58)、1，4-0-纤维ニ糖水解酶(例如EC 3. 2. 1.91)和内-1,3(4)-3-葡聚糖酶(例如EC
3.2.1.6);木聚糖酶，包括内-1，4-0-木聚糖酶(例如EC 3.2. 1.8)和木聚糖1，4-0-木糖苷酶(例如EC3. 2. I. 37);果胶酶(例如EC 3. 2. I. 15) ； a -葡糖醛酸糖苷酶、a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶(例如EC 3. 2. I. 55)、こ酰酯酶(例如EC 3. I. I.-)、こ酰木聚糖酯酶(例如EC 3. I. I. 72)、a淀粉酶(例如EC 3. 2. I. I)、P -淀粉酶(例如EC 3. 2. I. 2)、葡糖淀粉酶(例如EC 3. 2. I. 3)、支链淀粉酶(例如EC 3. 2. I. 41)、3 -葡聚糖酶(例如EC 3. 2. I. 73)、半纤维素酶、阿拉伯糖苷酶、甘露聚糖酶包括甘露聚糖内-1，4-P -甘露糖苷酶(例如EC
3.2.1.78)和甘露聚糖内-1，6-a-甘露糖苷酶(例如EC 3.2. I. 101)、果胶水解酶、多聚半乳糖醛酸酶(例如EC 3. 2. I. 15)、外多聚半乳糖醛酸酶(例如EC 3. 2. I. 67)和果胶酸裂合酶(例如 EC 4. 2. 2. 10)。取决于期望的发酵产物，预期在某些实施方案中有益地插入编码丙酮酸脱羧酶(例如EC 4. I. I. I)的基因或插入异源醇脱氢酶(例如ECl. I. I. I、EC I. I. I. 2、ECI. I. I. 71或EC I. 1.99.8)或上调已存在的醇脱氢酶。
根据本发明，还提供了产生发酵产物的方法，包括在适当的条件下培养根据本发明的菌株。根据本发明的菌株是严格厌氧微生物，因此优选地，通过在严格厌氧条件下进行发酵过程来产生发酵产物。此外，根据本发明的菌株是嗜热微生物，从而当在约40-95°C的范围内，例如约50-90°C范围内，包括约60-85°C的范围内，例如约65_75°C的范围内的温度下进行操作时，所述过程可最佳地进行。为了产生某些发酵产物，可有用地选择特定发酵过程，例如分批发酵过程，包括分批补料过程或连续发酵过程。同样地，可以有用地选择发酵反应器，例如固定的细胞反应器、流化床反应器或膜生物反应器(membrane bioreactor)。根据本发明，所述方法可用于产生许多种发酵产物包括酸、醇、酮和氢。因此，可根据本发明产生发酵产物例如こ醇、丁醇、丙醇、甲醇、丙ニ醇、丁ニ醇、乳酸、丙酸、こ酸、琥珀酸、丁酸、甲酸和丙酮。 现于下列非限定性实施例和附图中进ー步描述本发明。实施例I材料和方法下列材料和方法用于下列实施例中培养和分离从经设计具有逐渐升高的抑制剂浓度的连续富集发酵(ref反应器设计)进行未被污染的(axenic)培养物的分离和随后培养。用环境样品的复杂混合物接种富集反应器(Enrichment reactor),用预处理的麦杆(ref预处理)运行所述反应器。在70°C下在缺氧的条件下分离所有菌株，最终将其培养在补充有2g/L酵母提取物的基础厌氧基本培养基(BA) (Larsen等人1997)中。在添加有植物凝胶的相同培养基上使用Hungate RollTubes (Hungate 1969)以固体表面培养进行最終的分离。在第一次分离后,重复固体表面分离2次，以确保分离培养物是未被污染的。酶和试剂除非另外提及，否则酶由MBI Fermentas (Germany)提供并且按照提供商的推荐进行使用。化学药品是分子级的并且购自Sigma-Aldrich Sweden AB。在宏观和微观水平上分析分离的培养物的表型。在于70°C下生长24小时后，使用Canon数码相机(specs)拍摄分批培养物的图像。使用具有Kappa DX20H照相机的LeicaDMIRBE倒置显微镜拍摄显微图像以进行图像记录。使用Kappa Metreo模块测量单个细菌细胞的大小。HPLC使用与Cation H refill cartridge (30X 4. 6mm) (Bio-RadLaboratories, CA, USA)组合的配备有 Aminex HPX-87H 柱(3OOX 7. 8mm)(Bio-RadLaboratories, CA, USA)的 Dionex Ulitimate 3000 (Dionex corp.)通过HPLC-RI 定量糖和发酵产物。在60°C下利用4mM H2S04等度地(isocratically)分离分析物。将Iml样品用于HPLC分析。将20 yl H2SO4添加至样品中，然后涡旋30秒。以
14.000G将样品离心10分钟，将500 u I上清液用于HPLC分析。
PTA 和 AK 去除对分离株BG4和BGlO进行磷酸こ酰转移酶(PTA)和こ酸激酶(AK)的双重消除。图4中举例说明了所描述的基因敲除盒。将整合设计为使用转化的DNA的同源重组的双交换(cross-over)。通过在上述生长培养基中在100 u g/ml卡那霉素存在下进行随后的培养来选择敲除盒的成功整合。使用靶向侧翼连接插入的DNA的DNA序列的引物通过PCR验证整合。使用 PTA-out-lf (5，-ggt aaa ggt gtc cgt agt gaa aag g_3，)和 AK-out-lr 引物(5’-cca ata ctc tea acg tct tcc ac_3’)通过PCR评估成功的整合,对于成功的整合,产生1928bp的PCR产物。相应的野生型的PCR产物具有2581bp。Idh 去除单基因敲除构建体p 3TPKc2 包含1)使用引物 Idhuplf (5’ -TTCCATATCTGTAAGTCCCGCTAAAG-3’ ；SEQ ID NO:10)和 ldhup2r (5，-ATTAATACAATAGTTTTGACAAATCC-3’ ；SEQ IDNO: 11)扩增的BG4和BGlO的I-Idh基因的上游DNA片段，2)从pUC18HTK扩增的编码高度 热稳定性卡那霉素抗性的基因(Hoseki等人1999)，和3)使用引物ldhdown3f (5’ -ATATAAAAAGTCACAGTGTGAA-3， ；SEQ ID NO:12)和 ldhdown4r(5，-CACCTATTTTGCACTTTTTTTC-3， ；SEQID NO: 13)扩增的BG4和BGlO的1-ldh基因的下游DNA片段。将p3TPKc2线性化，并化学转化入BG4和BGlO。16S rRNA某闵的系统讲化分析收获I. 5ml培养物,将其用作DNA提取的模板。按照制造商所描述的,使用GenomicMini (Aabiot, Poland)提取 DNA。使用校正性 Pwo-聚合酶(A&A biotech, Poland)和预憐酸化的引物BI (5，-PHO-GAG TTT GAT CCT GGC TCA G_3’ ；SEQ ID NO: 14)和B2 (5，-PH0-ACGGCT ACC TTG TTA CGA CTT-3’ ；SEQ ID NO: 15)通过PCR扩增约 1500bp rRNA基因。从 1%琼脂糖凝胶切取所产生的PCR产物，并使用QiaExII凝胶提取试剂盒进行提取。随后将提取的产物克隆入用SAP(虾碱性磷酸酶)处理的Ecll36II降解的pUC19载体。使用限制性内切酶MboI (’ GATC)和BsuRI (GG’ CC)通过限制性片段长度多态性(RFLP)分析每ー个分离株的30个克隆。利用Euofins-MWG(Germany)对来自姆ー个独特限制性条带模式的代表进行正向和反向测序。修剪序列以消除载体和主要PCR引物序列。随后使用VectorNTI (Invitrogen)中的装配功能来组装正向和反向测序序列(reads)。使用“ Sequence Match”功能(Cole等人2003)和来自NCBI的“Blastn”(Altschul等人1990)检测每一个克隆的最近亲缘关系。使用 ClustalW (Chenna 等人 2003)进行比对，并且使用 Software MEGA4 (Kumar 等人 2001),基于邻接法(neighbor-joining) (Jukes-Cantor, Gaps: Complete deletion)构建系统发生树(用腾冲热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter tencongensis)作为外类群)。基于核苷酸比较的距离距阵示于下面表I中。图I中举例说明了相关的系统发生。表I
权利要求
1.分离的意大利热厌氧杆菌(Thermoanaerobacteritalicus)细胞，其包含与SEQ IDNO 9具有至少99. 7%的同一性的16S rDNA序列。
2.包含16SrDNA序列的分离的意大利热厌氧杆菌细胞，所述16SrDNA序列包含选自下列的序列SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4、SEQ ID N05、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO8及其任意组合；任选地，其中16S rDNA序列与SEQ ID NO 9具有至少99. 7%的同一性。
3.权利要求I或2的任ー项的分离的细胞，其包含含有SEQID N09的序列的16S rDNA序列。
4.权利要求3的分离的细胞，其包含含有SEQID NO I的16S rDNA序列。
5.权利要求3的分离的细胞，其包含含有SEQID NO 2的16S rDNA序列。
6.权利要求1-4的任ー项的分离的细胞，其为BGlO(DSMZ登录号23015)。
7.权利要求1-3或5的任ー项的分离的细胞，其为BG4(DSMZ登录号23012)。
8.前述权利要求的任ー项的分离的细胞，其中所述细胞能够在包含干物质含量为至少10%wt/wt的水解的木质纤维素生物质材料的培养基中生长。
9.权利要求8的分离的细胞，其中所述干物质含量为至少15%wt/wt。
10.权利要求8的分离的细胞，其中所述干物质含量为至少20%wt/wt。
11.权利要求8的分离的细胞，其中所述干物质含量为至少25%wt/wt。
12.权利要求8的分离的细胞，其中所述水解的木质纤维素生物质材料选自花园垃圾、粉碎的木材、禾杆、干草、果壳和种壳。
13.前述权利要求的任ー项的分离的细胞，其能够在40°C或高于40°C，例如50-90°C，例如60-85°C，例如65-75°C，例如约70°C下生长。
14.前述权利要求的任ー项的分离的细胞，其能够产生选自酸、醇、酮和氢的发酵产物。
15.权利要求14的分离的细胞，其中所述醇选自こ醇、丁醇、丙醇、甲醇、丙ニ醇和丁ニ醇。
16.权利要求14的分离的细胞，其中所述酸选自乳酸、丙酸、こ酸、琥珀酸、丁酸和甲酸。
17.权利要求14的分离的细胞，其中所述酮为丙酮。
18.前述权利要求的任ー项的分离的细胞，其中已插入、缺失或大体上失活ー个或多个基因。
19.权利要求18的分离的细胞，其中已使编码乳酸脱氢酶(LDH)(EC I. I. I. 27)的基因下调或大体上失活。
20.权利要求19的分离的细胞，其中已通过编码乳酸脱氢酶(LDH)(EC I. I. I. 27)的基因的缺失使所述基因失活。
21.权利要求19的分离的细胞，其中已通过在编码乳酸脱氢酶(LDH)(EC I. I. I. 27)的基因中突变、缺失或插入ー个或多个氨基酸而使所述基因大体上失活。
22.权利要求19的分离的细胞，其为BGlOXL(DSMZ登录号23017)或BG4XL(DSMZ登录号 23014)。
23.权利要求18或19的分离的细胞，其中已使编码こ酸激酶(EC2.7. 2. I)的基因下调或大体上失活。
24.权利要求23的分离的细胞，其中已通过编码こ酸激酶(EC2.7. 2. I)的基因的缺失使所述基因失活。
25.权利要求23的分离的细胞，其中已通过在编码こ酸激酶(EC2.7. 2. I)的基因中突变、缺失或插入ー个或多个氨基酸而使所述基因大体上失活。
26.权利要求23的分离的细胞，其为BGlOpka(DSMZ登录号23216)或BG4pka(DSMZ登录号 23013)。
27.权利要求18、19或23的分离的细胞，其中已使编码磷酸こ酰转移酶(EC2. 3. I. 8)的基因下调或大体上失活。
28.权利要求27的分离的细胞，其中已通过编码磷酸こ酰转移酶(EC2. 3. I. 8)的基因的缺失使所述基因失活。
29.权利要求27的分离的细胞，其中已通过在编码磷酸こ酰转移酶(EC2. 3. I. 8)的基因中突变、缺失或插入ー个或多个氨基酸而使所述基因大体上失活。
30.权利要求27的分离的细胞，其为BGlOpka(DSMZ登录号23216)或BG4pka(DSMZ登录号 23013)。
31.权利要求18、19、23或27的分离的细胞，其中已插入ー个或多个基因。
32.权利要求31的分离的细胞，其中已插入一个或多个编码多糖酶的基因。
33.权利要求32的分离的细胞，其中所述多糖酶选自纤维素酶(EC3.2.1.4) -葡聚糖酶，包括葡聚糖-1，3 P -葡糖苷酶(外-1，3 P -葡聚糖酶，EC 3. 2. I. 58)、1，4- P -纤维ニ糖水解酶(EC 3. 2. 1.91)和内-1,3(4)-0-葡聚糖酶(EC 3. 2. 1.6);木聚糖酶，包括内-1，4-3-木聚糖酶(EC 3. 2. 1.8)和木聚糖1，4-3-木糖苷酶(EC 3. 2. I. 37);果胶酶(EC3. 2. I. 15) ; a -葡糖醛酸糖苷酶、a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC3. 2. I. 55)、こ酰酯酶(EC 3. I. I.-)、こ酰木聚糖酯酶(EC 3. I. I. 72)、a淀粉酶(EC 3. 2. I. I)、￠-淀粉酶(EC 3. 2. I. 2)、葡糖淀粉酶(EC3. 2. I. 3)、支链淀粉酶(EC 3. 2. I. 41)、￠-葡聚糖酶(EC3.2. I. 73)、半纤维素酶、阿拉伯糖苷酶、甘露聚糖酶包括甘露聚糖内-1，4-0 -甘露糖苷酶(EC 3.2. 1.78)和甘露聚糖内-1，6-a-甘露糖苷酶(EC3. 2. I. 101)、果胶水解酶、多聚半乳糖醛酸酶(EC 3. 2. I. 15)、外多聚半乳糖醛酸酶(EC 3. 2. I. 67)和果胶酸裂合酶(EC4.2. 2. 10)。
34.权利要求33的分离的细胞，其中已插入一个或多个编码丙酮酸脱羧酶(EC4.I. I. I)的基因。
35.权利要求33的分离的细胞，其中已插入ー个或多个编码醇脱氢酶(ECI. I. I. UECI. I. I. 2, EC I. I. I. 71、EC I. I. 99. 8)的基因。
36.前述权利要求的任ー项的分离的细胞，其中已增加ー个或多个编码醇脱氢酶(ECI.I. I. I、EC I. I. I. 2、EC I. I. I. 71、EC I. I. 99. 8)的基因的表达。
37.分离的菌株，其包含前述权利要求的任ー项的意大利热厌氧杆菌细胞。
38.一种产生发酵产物的方法,其包括在适当的条件下培养权利要求1-36的任ー项的细胞或权利要求37的菌株。
39.权利要求38的方法，其为在严格缺氧条件下进行的发酵法。
40.权利要求39的方法，其在约40-95で的范围内，例如约50-90で的范围内，例如约60-850C的范围内，例如约65-75°C的范围内的温度下运行。
41.权利要求38-40的任ー项的方法，其中所述发酵法为分批发酵法。
42.权利要求38-40的任ー项的方法，其中所述发酵法为连续发酵法。
43.权利要求38的方法，其中所述发酵产物选自酸、醇、酮和氢。
44.权利要求43的方法，其中所述醇选自こ醇、丁醇、丙醇、甲醇、丙ニ醇和丁ニ醇。
45.权利要求43的方法，其中所述酸选自乳酸、丙酸、こ酸、琥珀酸、丁酸和甲酸。
46.权利要求43的方法，其中所述酮为丙酮。
47.权利要求1-36的任一项的分离的细胞或权利要求37的菌株用于产生发醇产物的用途，所述发酵产物选自酸、醇、酮和氢。
48.一种分离的水解木聚糖的嗜热性意大利热厌氧杆菌细胞，其产生选自酸、醇、酮和氢的发酵产物，并且其中已插入、缺失或大体上失活选自乳酸脱氢酶(EC I. I. I. 27)、こ酸激酶(EC 2. 7. 2. I)、磷酸こ酰转移酶(EC 2. 3. I. 8)、多糖酶、丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的ー个或多个基因。
49.一种用于制备突变的意大利热厌氧杆菌细胞的方法，其包括在权利要求1-17的任一项的分离细胞，任选地权利要求18-36和48的任一项的分离的细胞中插入、上调、缺失或大体上失活ー个或多个基因。
全文摘要
提供了属于意大利热厌氧杆菌marato亚种nov.亚种的组的严格厌氧嗜热细菌及其突变体和衍生物。所述细菌特别适用于从木质纤维素生物质产生发酵产物例如乙醇、乳酸、乙酸和氢。
文档编号C12N9/10GK102770526SQ201080062972
公开日2012年11月7日 申请日期2010年12月21日 优先权日2009年12月22日
发明者M·J·米克尔森, R·L·安德森, T·克威斯特 申请人:比奥咖索尔Ipr有限公司