专利名称：一株低温降解多环芳烃菌株及其在石油烃污染场地地下水生物修复中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于环境工程和微生物工程技术领域，尤其涉及一株低温降解多环芳烃的新鞘氨醇杆菌及其在石油烃污染场地地下水生物修复中的应用。
背景技术：
多环芳烃分子中含有两个以上的苯环结构，属不饱和烃，主要包括双环芳烃 (萘)、三环芳烃(蒽、菲)以及三环以上芳烃(如苯并芘、苯并蒽)，其中以两环、三环芳烃最为常见，其广泛存在于原油和石油制品(汽油、煤油、柴油等)中。随着石油及制品的生产与广泛使用，各种途径造成的多环芳烃污染也日趋严重， 其中石油烃直接渗入及雨水、灌溉水对土壤淋溶或是地表水体渗透均导致了许多国家和地区的地下水受到多环芳烃的严重污染。由于多环芳烃及其衍生物具有致癌性、致突变性和致畸性，以及急性毒性和亚致死作用，使得多环芳烃污染地下水的控制与修复已迫在眉睫。目前典型的地下水污染修复方法主要有异位修复方法和原位修复方法。异位修复 (抽出处理技术)被广泛用于易挥发且易溶解污染质(V0Cs，SV0CS，FUelS)的恢复和治理中， 但由于多环芳烃的溶解度相对较低且难以挥发，使其在多环芳烃污染地下水修复中的应用受到了限制。和异位修复相比，原位修复不但修复费用相对节省，而且还能最大程度减少污染物的暴露和对土地环境的扰动，其中原位生物修复被认为是一种很有发展前景的地下水修复技术。原位生物修复，是指在基本不破坏土壤和地下水自然环境的条件下，对受污染环境对象不作搬运或输送，而在原场所进行生物修复。能够影响生物修复效率的因素有许多，其中功能微生物的污染物降解能力与效率最为重要。因此，对于多环芳烃污染而言，国内外进行了大量多环芳烃降解生物的筛选工作。到目前为止，已分离出具有多环芳烃降解能力的菌种主要有以下各属的菌株假单胞菌属(Pseudomonas)、粪产碱杆菌属(Alcaligenes faecalis)、拟诺卡氏菌属(Nocardioides)、气单胞菌属(Aeromonas)、 微球菌属(Micrococcus)、莫拉氏菌属(Moraxella)、拜叶林克氏菌属(Bei jerinckia)、 分枝杆菌属(Mycobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、弧菌属(Vibrio)、解环菌属 (Cycloclasticus)、海杆菌属(MarincAacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、鞘氨醇单胞菌属 (Sphingomonas)、硫酸盐还原菌(SRB)等细菌，以及酵母菌和白腐真菌等真菌；其中对细菌中假单胞菌和拟诺卡氏菌的多环芳烃降解研究最为广泛与深入，而真菌的降解研究则相对较少。从上述多环芳烃降解菌种的筛选、降解能力及机理的研究中可知降解菌种的工作温度大多为30-38°C左右，多环芳烃浓度(以萘、菲为例)多为几百mg/L-几十g/L，目标多环芳烃多为一种或两种，测试条件下多环芳烃降解效率较高。然而实际多环芳烃污染场地的地下水环境温度较低(10-15°C )、多环芳烃种类较多且较低(10 μ g/L-20mg/L),这使得已筛选的多环芳烃降解菌很难用于实际的地下水生物修复工程中，其中以温度影响最为突出。因此，本发明是针对地下水环境低温、多环芳烃浓度低等工程特点，经过独特的分离、富集策略而筛选的低温多环芳烃降解菌，用于石油烃污染场地地下水的生物修复。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足之处而提供一种低温降解多环芳烃菌株、该菌株的筛选方法以及该菌株用于治理石油烃污染地下水的生物修复技术，该菌株是具有在低温条件下降解多种多环芳烃的新鞘氨醇杆菌，在治理石油烃污染地下水中可以应用。为达到上述目的，本发明是这样实现的本发明提供的新鞘氨醇杆菌 (Novosphingobium sp.)，于2009年10月12日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号CGMCC No. 33沈。地址北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所。新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium sp.)是从吉林油田某污染场地中分离，并经低温强化自然富集筛选得到。菌株可在温度10 37°C，pH值6. 5 8. 5培养条件下较好生长；菌株形态特征为革兰氏阴性，杆菌，黄色，尺寸0. 3 0. 5 μ mX 1. O 1. 5 μ m，无鞭毛； 菌株LB培养24h菌落特征为圆形，菌落直径2 3mm，黄色，表面光滑，边缘整齐。本发明菌株的生理生化特性为氧化酶、接触酶、硝酸盐还原、尿素水解、产吲哚等试验项目为阳性，产、明胶液化、反硝化、油脂水解、MR、VP、柠檬酸利用、3-酮基乳糖利用、亚硝酸盐还原、产氨、淀粉水解等试验项目为阴性，石蕊牛奶凝乳酶凝固，葡萄糖氧化产酸发酵。本发明所述菌株可在温度10 37°C，pH值6. 5 8. 5培养条件下较好生长；菌株形态特征为革兰氏阴性，杆菌，黄色，尺寸0. 3 0. 5 μ mX 1. 0 1. 5 μ m，无鞭毛；菌株LB 培养24h菌落特征为圆形，菌落直径2 3mm，黄色，表面光滑，边缘整齐。菌株具有在10 20°C低温下快速降解多环芳烃的能力。作为一种优选方案，本发明所述菌株能以多环芳烃为唯一碳源和能源生长。上述低温降解多环芳烃菌株的筛选方法，可按如下步骤依次实施(1)在室外温度小于-20°C时，从油田污染场地采集距地表下5 20cm处表层土壤样品，以及地下水样品，制备成菌悬液，共同作为菌源进行低温自然富集培养；所述富集培养基含有无机盐培养基、0#柴油、葡萄糖及酵母膏；所述无机盐培养基含有K2HP04、NaH2PCV (NH4)2SO4, MgCl2 · 6H20、EDTA, ZnSO4 · 7H20、CaCl2 · 2H20、FeSO4 · 7H20、NaMoO4 · 2H20、CuSO4 · 5H20、 CoCl2 ·6Η20及MnCl2 ·2Η20 ； (2)取适量菌悬液重新接种至步骤(1)所述的富集培养基中，继续低温适应、富集；(3)连续传代培养，逐次减少葡萄糖和酵母膏用量，直至0#柴油为唯一碳源和能源生长；(4)继续低温适应、富集，同时监测富集培养基中柴油组分的降解情况， 发现0#柴油中多环芳烃被降解后，将菌悬液涂布在含0#柴油的固体无机盐培养基上；将分离得到菌种分别接种至含0#柴油的无机盐培养基中，依据各菌株所在培养基中的多环芳烃组分减少和浓度降低情况，进行分离即得目的产物低温降解多环芳烃菌株新鞘氨醇杆菌 (Novosphingobium sp. )0上述低温降解多环芳烃菌株可用于石油烃污染场地地下水的低温生物修复。具体地，本发明可采用低温降解多环芳烃菌株的生长细胞进行低温降解多环芳烃。
另外，本发明还可采用低温降解多环芳烃菌株的静基细胞进行低温降解多环芳烃。其次，本发明还可采用低温降解多环芳烃菌株的固定化细胞进行低温降解多环芳烃。本发明新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium sp.)可在温度10-37°C，pH值6. 5 8. 5 培养条件下较好生长；菌株形态特征为革兰氏阴性，杆菌，黄色，尺寸0. 3 0. 5 μ mX 1. O 1. 5 μ m,无鞭毛。新鞘氨醇杆菌(Novosphingobiumsp.)在 LB (蛋白胨 10，牛肉膏 3，NaCl 5，pH 7. 4 7. 6，单位g/L)培养M小时菌落特征为圆形，菌落直径2 3mm，黄色，表面光滑，边缘整齐。新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium sp.)的生理生化特征，见表1。表1新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium sp.)生理生化特征
权利要求
1.一株低温降解多环芳烃菌株，其特征在于，该菌株保藏名称为新鞘氨醇杆菌 (Novosphingobium sp.)，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2009年10月12日，保藏号CGMCC No. 33洸。
2.根据权利要求1所述的低温降解多环芳烃菌株，其特征在于所述菌株可在温度 10 37°C，pH值6. 5 8. 5培养条件下较好生长；菌株形态特征为革兰氏阴性，杆菌，黄色， 尺寸0. 3 0. 5 μ mX 1. O 1. 5 μ m，无鞭毛；菌株LB培养24h菌落特征为圆形，菌落直径 2 3mm，黄色，表面光滑，边缘整齐。
3.根据权利要求2所述的低温降解多环芳烃菌株，其特征在于所述菌株能以多环芳烃为唯一碳源和能源生长。
4.根据权利要求1 3之任一所述的低温降解多环芳烃菌株的筛选方法，其特征在于， 按如下步骤依次实施(1)在室外温度小于_20°C时，从油田污染场地采集距地表下5 20cm处表层土壤样品，以及地下水样品，制备成菌悬液，共同作为菌源进行低温自然富集培养；所述富集培养基含有无机盐培养基、0#柴油、葡萄糖及酵母膏；所述无机盐培养基含有K2HPO4、NaH2PO4、(NH4) 2SO4、MgCl2 · 6H20、EDTA、ZnSO4 · 7H20、CaCl2 · 2H20、FeSO4 · 7H20、 NaMoO4 · 2H20、CuSO4 · 5H20、CoCl2 · 6H20 及 MnCl2 · 2H20 ；(2)取适量菌悬液重新接种至步骤(1)所述的富集培养基中，继续低温适应、富集；(3)连续传代培养，逐次减少葡萄糖和酵母膏用量，直至0#柴油为唯一碳源和能源生长；(4)继续低温适应、富集，同时监测富集培养基中柴油组分的降解情况，发现0#柴油中多环芳烃被降解后，将菌悬液涂布在含0#柴油的固体无机盐培养基上；将分离得到菌种分别接种至含0#柴油的无机盐培养基中，依据各菌株所在培养基中的多环芳烃组分减少和浓度降低情况，进行分离即得目的产物低温降解多环芳烃菌株新鞘氨醇杆菌 (Novosphingobium sp. )0
5.一种如权利要求1 3之任一所述的低温降解多环芳烃菌株在石油烃污染场地地下水生物修复中的应用。
6.根据权利要求5所述的低温降解多环芳烃菌株在石油烃污染场地地下水生物修复中的应用，其特征在于采用菌株的生长细胞低温降解多环芳烃。
7.根据权利要求5所述的低温降解多环芳烃菌株在石油烃污染场地地下水生物修复中的应用，其特征在于采用菌株的静基细胞低温降解多环芳烃。
8.根据权利要求5所述的低温降解多环芳烃菌株在石油烃污染场地地下水生物修复中的应用，其特征在于采用菌株的固定化细胞低温降解多环芳烃。
全文摘要
本发明属于环境工程和微生物工程技术领域，尤其涉及一株低温降解多环芳烃的新鞘氨醇杆菌及其在石油烃污染场地地下水生物修复中的应用。该菌株为新鞘氨醇杆菌(Novosphingobiumsp.)，于2009年10月12日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号CGMCC No.3326。本发明菌株是从吉林油田某污染场地中分离，并经低温强化自然富集筛选得到，该菌株可以以多环芳烃为唯一碳源、能源生长，其生长细胞、静基细胞及固定化细胞均可以在低温条件下降解多环芳烃污染物，特别适用于石油烃污染场地地下水的生物修复。
文档编号C12N1/20GK102277312SQ20111000312
公开日2011年12月14日 申请日期2011年1月10日 优先权日2011年1月10日
发明者张兰英, 张洪林, 李爽, 李长波, 赵国峥, 马会强 申请人:辽宁石油化工大学