专利名称：一种亲和吸附介质纯化菠萝蛋白酶的方法
技术领域：
本发明属于纯化菠萝蛋白酶的领域，特别涉及一种亲和吸附介质纯化菠萝蛋白酶的方法。
背景技术：
生物制品随着生物科学技术以及医学的发展，其应用也越来越广泛。但生物制品通常都是从微生物发酵液中或动植物体内提取，再经过一整套分离纯化的工艺流程而制成成品。这些生物产品不同于传统的化工产品，它们一般都具有生物活性，因此对分离操作条件要求更加苛刻，传统的化工分离方法如精馏、沉淀、结晶等都难以在此应用或者效果不理想。而色谱分离也有其缺点如常用的柱状色谱中，其低流速，高压降，缓慢的动力学吸附过程以及昂贵的成本，这些都遏制了其在产业化中的应用。同时亲和色谱技术，也遇到了相应的瓶颈问题市场上对于高纯度的生物大分子的需求也是越来越大，落后的传统色谱技术不能完全跟上市场的需求分离成本大，纯化时间长，操作工序繁琐。如何找到一个合适的配基，能够一对一单独吸附一种生物大分子比如某种蛋白质或者酶，这是目前色谱领域亟待解决的一个难题。一个理想的配基，要求能与目标生物大分子较强的亲和力，能够可逆的吸附与脱附；同时它又能易于键合到某种介质上， 有良好的生物相容性和环境友好性，不易被降解，稳定性；最重要的是它对目标蛋白有定向选择性。这里的定向选择性指的是能够一对一的对目标蛋白或生物大分子有特异亲和性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种亲和吸附介质纯化菠萝蛋白酶的方法，该方法工艺简单，成本低廉，重复性好；所筛选的7肽配基能够特异性识别菠萝蛋白酶，以此作为亲和色谱配基能够体现高效性和专一性；分离方法操作简单，快速、高效、分离量大，纯化倍数和酶活性较高，具有良好的应用前景。本发明的一种亲和吸附介质纯化菠萝蛋白酶的方法，包括(1)将酶标板包被加入菠萝蛋白酶溶液孵育，洗涤后加满封阻液，再次洗涤后加入噬菌体7肽文库孵育；用20 100 μ g/ml菠萝蛋白酶分子TBS洗脱液洗脱并感染10 20ml大肠杆菌ER2738菌液进行扩增8 14h，将菌液离心沉淀后取上清液，加入体积比为1 3 1 6的聚乙二醇PEG 和NaCl溶液，冰置1 2h，8000 12000rpm离心沉淀10 20min，取上清液，重新悬浮于 1 aiil TBS溶液，制得噬菌体TBS溶液；(2)将上述制备的0. 1 Iml噬菌体TBS溶液加入到120 180 μ 1戊二醛溶液中混合均勻，加入120 180 μ 1 PEG 6000震荡12_Mh，之后加入5 IOml氨基乙醇-HCL， 再加1 anl NaCl溶液，室温震荡1 浊，8000 15000rpm离心沉淀，用TBS溶液洗涤， 取上清液，于0 4°C保存，得交联噬菌体7肽亲和吸附介质CAPOP ；(3)将上述制备的0. 01 0. Ig交联噬菌体7肽亲和吸附介质溶于体积百分比为 0. 01 0. 02%的NaN3 TBS溶液中，加入10 20ml浓度为4 20mg/ml的菠萝蛋白酶溶液吸附2 4h，8000 15000rpm离心沉淀，用TBST清洗，以TBS/NaCl缓冲液为洗脱剂，洗脱被吸附的菠萝蛋白酶；(4)测试分离后的菠萝蛋白酶活性和菠萝蛋白酶含量。所述步骤(1)中的大肠杆菌ER2738菌液的浓度为OD6tltl = 0. 2 0. 5。所述步骤(1)中的酶标板包被孔数为96孔。所述步骤O)中的戊二醛溶液浓度为20 25 μ M ；PEG 6000体积百分比浓度为 50% ；氨基乙醇-HCL浓度为1 2M，pH值为8. 0 9. 0 ；NaCl溶液浓度为4 5M。所述步骤(3)中的洗脱工艺为用pH5. 0 9. 0的TBS/NaCl缓冲液于0 40°C进行洗脱。所述步骤中测定菠萝蛋白酶活性是利用酪蛋白为底物，在275nm处测定其酶活力大小；测定菠萝蛋白酶含量是使用紫外分光光度计在^Onm处进行检测。有益效果本发明工艺简单，成本低廉，重复性好；所筛选的7肽配基能够特异性识别菠萝蛋白酶，以此作为亲和色谱配基能够体现高效性和专一性；分离方法操作简单，快速、高效、分离量大，纯化倍数和酶活性较高，具有良好的应用前景。
图1是本发明操作总流程；图2是pH对CAPOP吸附量的影响；图3是离子强度对CAPOP吸附量的影响；图4是温度与时间对CAPOP吸附量的影响；图5是响应面条件pH与菠萝蛋白酶浓度对吸附量影响的3D图；图6是响应面条件pH与温度对吸附量影响的3D图。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1噬菌体展示技术生物淘洗(筛选)菠萝蛋白酶7肽配基及亲和力测定，具体步骤如下96酶标板包被菠萝蛋白酶溶孵育。洗涤后加满封阻液，再次洗涤后加入噬菌体7肽文库孵育。洗涤后用100 μ g/ml菠萝蛋白酶分子TBS洗脱液洗脱残余噬菌液并感染20ml 大肠杆菌ER2738 (0DA_ = 0. 5)进行扩增12h，菌液离心15min取上清，加入1/5(V/V)PEG/ NaCl，冰置lh，12000rpm离心20min，去上清，重悬于Iml TBS溶液(生物淘洗重复淘洗三轮)。第三轮滴度测试后随即挑取10个单克隆进行ELISA检测，阳性结果进行DNA测序。图1是制备方法以及分离纯化菠萝蛋白酶的流程。经ELISA测试后，最佳7肽配基的氨基酸序列是IIe-Gln-Ser-Pro-His-Phe-Phe。实施例2
制备交联噬菌体7肽亲和吸附介质(CAPOP)，具体步骤如下(I)Iml (数量级为 IO12-IO14)噬菌体 TBS 溶液(pH 7.0)混合到 150 μ 1 23. 4 μ M 戊二醛溶液中混勻，同时加入150 μ 1 50%的PEG 6000震荡过夜。(2)次日加入anl IM氨基乙醇-HCL (pH 9. 0)，再加890 μ 1 5Μ的NaCl溶液，室温震荡2h。(3)完成后IOOOOrpm离心沉淀，TBS溶液洗涤5次，去上清，沉淀于0. 02 % NaN3 TBS溶液中重悬，4 °C保存。实施例3用交联噬菌体7肽亲和吸附介质(CAPOP)静态法吸附菠萝蛋白酶，进行单因素条件优化，具体步骤如下方法精确称取一定量按上述方法制备交联噬菌体7肽亲和吸附介质(CAPOP)，置于不同浓度，不同PH值的缓冲液配制的菠萝蛋白酶溶液中，室温震荡不同时间后，测量吸附前后蛋白质溶液在^Onm下的吸光度，按下式计算吸附量q = (Ci-Ct)VsAi (式 1)q是吸附在单位膜量上的菠萝蛋白酶的量(mg/g) ;Ci和Ct是吸附前和吸附后菠萝蛋白酶溶液的浓度；VS是菠萝蛋白酶溶液的体积；m是反应的CAPOP质量。(1)ρΗ值对CAPOP吸附性能的影响及选择优化分析将0. Ig交联噬菌体7肽亲和吸附介质(CAPOP)溶于TBS(pH值4.0 10. 0)溶液中，加入15ml菠萝蛋白酶溶液(IOmg/ ml)，室温下吸附3h，混合液12000rpm离心沉淀，用(0. 2 % ) TBST清洗15次，用TBS/NaCl 进行洗脱被吸附的菠萝蛋白酶，按照(式1)测定菠萝蛋白酶吸附的量。实验结果如图3，最适PH值为9.0。(2)离子强度对CAPOP吸附性能的影响及选择优化分析将0. Ig交联噬菌体7肽亲和吸附介质(CAPOP)溶于TBS(离子强度0 2. OM)溶液中，加入15ml菠萝蛋白酶溶液 (10mg/ml)，室温下吸附3h，混合液12000rpm离心沉淀，用(0.2%) TBST清洗15次，用TBS/ NaCl进行洗脱被吸附的菠萝蛋白酶，按照(式1)测定菠萝蛋白酶吸附的量。实验结果如图 4，最适离子强度为0M。(3)温度，吸附时间对CAPOP吸附性能的影响及选择优化分析将0. Ig交联噬菌体7肽亲和吸附介质(CAPOP)溶于TBS溶液中，加入15ml菠萝蛋白酶溶液(10mg/ml)，在不同温度下(4°C,25°C,37°C )吸附 5min，10min，20min，30min，50min，min 60，90min，120min， 180min取出Iml混合液12000rpm离心沉淀，用(0. 2% ) TBST清洗15次，用TBS/NaCl进行洗脱被吸附的菠萝蛋白酶，按照(式1)测定菠萝蛋白酶吸附的量。实验结果如图5，最适温度为25°C，吸附时间为池。实施例4用交联噬菌体7肽亲和吸附介质(CAPOP)吸附菠萝蛋白酶，进行响应面双因素条件优化，具体步骤如下根据设计软件DX6Trial中CCD方法，实验总共分2组大实验(pH，温度)/ (pH，初始酶液浓度)，其中每组13组小实验(见表1)。结果见图6，图7，最佳的吸附条件为蛋白酶溶液浓度为15. 59mg/ml, pH = 6. 97，25. 80°C时能达到最大静态吸附量。表 权利要求
1.一种亲和吸附介质纯化菠萝蛋白酶的方法，包括(1)将酶标板包被加入菠萝蛋白酶溶液孵育，洗涤后加满封阻液，再次洗涤后加入噬菌体7肽文库孵育；用20 100 μ g/ml菠萝蛋白酶分子TBS洗脱液洗脱并感染10 20ml大肠杆菌ER2738菌液进行扩增8 14h，将菌液离心沉淀后取上清液，加入体积比为1 3 1 6的聚乙二醇PEG和NaCl溶液，冰置1 2h，8000 12000rpm离心沉淀10 20min， 取上清液，重新悬浮于1 anl TBS溶液，制得噬菌体TBS溶液；(2)将上述制备的0.1 Iml噬菌体TBS溶液加入到120 180 μ 1戊二醛溶液中混合均勻，加入120 180 μ 1 PEG 6000震荡12_24h，之后加入5 IOml氨基乙醇-HCL，再加1 anl NaCl溶液，室温震荡1 浊，8000 15000rpm离心沉淀，用TBS溶液洗涤，取上清液，于0 4°C保存，得交联噬菌体7肽亲和吸附介质；(3)将上述制备的0.01 0. Ig交联噬菌体7肽亲和吸附介质溶于体积百分比为 0. 01 0. 02%的NaN3TBS溶液中，加入10 20ml浓度为4 20mg/ml的菠萝蛋白酶溶液吸附2 4h，8000 15000rpm离心沉淀，用TBST清洗，以TBS/NaCl缓冲液为洗脱剂，洗脱被吸附的菠萝蛋白酶；(4)测试分离后的菠萝蛋白酶活性和菠萝蛋白酶含量。
2.根据权利要求1所述的一种亲和吸附介质纯化菠萝蛋白酶的方法，其特征在于所述步骤(1)中的大肠杆菌ER2738菌液的浓度为OD6tltl = 0. 2 0. 5。
3.根据权利要求1所述的一种亲和吸附介质纯化菠萝蛋白酶的方法，其特征在于所述步骤(1)中的酶标板包被孔数为96孔。
4.根据权利要求1所述的一种亲和吸附介质纯化菠萝蛋白酶的方法，其特征在于所述步骤(2)中的戊二醛溶液浓度为20 25 μ M ；PEG 6000体积百分比浓度为50%;氨基乙醇-HCL浓度为1 2M，pH值为8. 0 9. 0 ；NaCl溶液浓度为4 5M。
5.根据权利要求1所述的一种亲和吸附介质纯化菠萝蛋白酶的方法，其特征在于所述步骤(3)中的洗脱工艺为用pH 5. 0 9. 0的TBS/NaCl缓冲液于0 40°C进行洗脱。
6.根据权利要求1所述的一种亲和吸附介质纯化菠萝蛋白酶的方法，其特征在于所述步骤(4)中测定菠萝蛋白酶活性是利用酪蛋白为底物，在275nm处测定其酶活力大小；测定菠萝蛋白酶含量是使用紫外分光光度计在^Onm处进行检测。
全文摘要
本发明涉及一种亲和吸附介质纯化菠萝蛋白酶的方法，包括(1)仿生配基7肽的筛选；(2)噬菌体及其所展示的7肽配基通过交联剂戊二醛，以氨基乙醇-HCL为猝灭剂制备出交联噬菌体7肽亲和吸附介质CAPOP；(3)交联噬菌体7肽亲和吸附介质，以TBS/NaCl为洗脱剂，采用离心沉淀的方式，离心纯化菠萝蛋白酶；(4)菠萝蛋白酶的酶活以及含量测定。本发明工艺简单，成本低廉，重复性好；所筛选的7肽配基能够特异性识别菠萝蛋白酶，以此作为亲和色谱配基能够体现高效性和专一性；分离方法操作简单，快速、高效、分离量大，纯化倍数和酶活性较高，具有良好的应用前景。
文档编号C12N9/50GK102154252SQ20111006521
公开日2011年8月17日 申请日期2011年3月17日 优先权日2011年3月17日
发明者朱利民, 汪雯, 聂华丽, 陈天翔 申请人:东华大学