专利名称：一种利用β-环糊精发酵废液生产糖化酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种生物发酵技术，特别是一种利用β -环糊精发酵废液生产糖化酶的方法。
背景技术：
糖化酶(缩写GA或G)是葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase EC 3. 2. 1. 3)的简称，又称Y -淀粉酶，是最重要的工业酶制剂之一，它是一种外切型糖苷酶，从淀粉的非还原性末端依次水解α-1，4糖苷键，切下一个个葡萄糖单元，并像淀粉酶一样，使水解下来的葡萄糖发生构型变化，形成β-D-葡萄糖。对于支链淀粉，当遇到分支点时，它也可以水解 α -1，6糖苷键，由此将支链淀粉全部水解成葡萄糖。糖化酶是工业上应用最广泛的酶类之一，是国内产量最大的酶品种。主要用途是作为淀粉糖化剂，因而广泛地用于制药、制酒及氨基酸、有机酸行业，是最重要的工业酶制剂之一。β -环糊精生产过程中遇到的问题β -环糊精生产废液富含有机碳，废液DE值高达15%。若直接排放到河流中，会大幅增加水体的BOD值，造成水体污染，与国家环保政策相抵触；若将环糊精生产废液曝气处理，将大幅增加生产成本，降低企业经济效益。据调查，目前国内有30多家企业生产β-环糊精，仅此一项国家年损失高达1亿元。废液该如何合理利用，成为一个亟待解决的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种利用β -环糊精发酵废液生产糖化酶的方法，将β -环糊精发酵废液再利用，既增加企业利润，变废为宝，又减轻环保压力。为了实现解决上述技术问题的目的，本发明采用了如下技术方案
本发明的一种利用β -环糊精发酵废液生产糖化酶的方法，包括使用含无孢子黑曲霉菌液体种子作为菌种制备黑曲霉发酵液，特征在于制备黑曲霉发酵液的方法为将菌体含量为IO2-IO4个/mL、PH值4_5的菌种液按装液量体积比的15%的接种量移至装入含有培养基的的一级摇瓶中，培养基的装液量为1/5-2/5，发酵温度为34°C±rC，摇床转速为220-240rpm，发酵pH值为4. 8-5.0，发酵时间为72h ；将一级摇瓶中的发酵液按装液量体积比的15%的接种量移至装入含有培养基的二级摇瓶中，培养基的装液量为1/5-2/5，发酵温度为MO 土rC，摇床转速为220-240rpm，发酵pH值为4. 8-5.0，发酵时间为48h ；将二级摇瓶中的发酵液按装液量体积比的15%的接种量移至装入含有培养基的三级摇瓶中， 培养基的装液量为1/5-2/5，发酵温度为34°C 土 1°C，摇床转速为220-240rpm，发酵pH值为 4. 8-5. 0，发酵时间为72h ；将三级摇瓶中的发酵液按装液量体积比的15%的接种量移至装入含有培养基的四级摇瓶中，培养基的装液量为1/5-2/5，发酵温度为34°C 土 1°C，摇床转速
4为220-240rpm，发酵pH值为4. 8-5. 0，发酵时间为144h，制成发酵液；发酵液可直接作为酶制剂使用。发酵液也可以进一步精制或提取糖化酶后使用。所述的培养基成分为
一级摇瓶培养基玉米淀粉80g/L，豆饼粉40g/L，玉米浆10mL/L，pH值4. 8，余量为水； 二级摇瓶培养基β -环糊精发酵废液200mL/L，玉米淀粉70g/L，玉米粉40g/L，豆饼粉 20g/L,玉米浆5mL/L，高温淀粉酶1_2滴，余量为水，pH值4. 8 ；其中废液中所含淀粉约相当于玉米淀粉30g/L ；
三级摇瓶培养基β -环糊精发酵废液400mL/L ，玉米淀粉80g/L，玉米粉50g/L， 豆饼粉30g/L，玉米浆5mL/L，硫酸铵5g/L，高温淀粉酶1_2滴，余量为水，pH值4. 8 ；其中废液中所含淀粉相当于玉米淀粉60g/L ；
四级摇瓶培养基β -环糊精发酵废液530mL/L，玉米淀粉180g/L，玉米粉50g/L，豆粕 40g/L，玉米浆20mL/L，硫酸铵5g/L，高温淀粉酶适1_2滴，余量为水，pH值4. 8 ；其中废液中所含淀粉约相当于玉米淀粉80g/L。培养基中的玉米浆是制玉米淀粉的副产物，制造玉米淀粉须将玉米粒先用亚硫酸浸泡，浸泡液浓缩即制成黄褐色的液体，叫玉米浆，其有机物含量一般为 3-30%。本发明的β -环糊精发酵废液具体是指工业化生产β -环糊精时，原料经发酵后， 提取出β -环糊精后所剩废料，其主要成分为还原糖，焦糖，环己烷，总有机物含量一般为 3_20%。废液中所含淀粉相当于玉米淀粉20-150g/L。本发明的一种利用β-环糊精发酵废液生产糖化酶的方法，作为液体种子的菌种可以按照普通的制备方法制备，只要符合菌球含量为IO2-IO4个/mL、PH值4-5即可满足要求，例如，其制备方法可以是在无菌条件下，用无菌吸管抽吸0. Iml的解冻的菌球含量为 IO3个/mL的无孢子黑曲霉菌液，在淀粉平皿培养基上涂布，32-36°C恒温培养4_5天；然后挑取淀粉培养基上1-2个菌形规整、内凹陷规则的菌落，放置在查氏平皿培养基上划线分离，于32-36°C恒温培养4-6天使其成熟，成熟后放入0-4°C冰箱中保存；配制查氏半干体培养基，灭菌后用接种铲或环取查氏平皿培养基上已经成熟的1个单菌落于已灭菌的查氏半干体培养基中，查氏半干体培养基所用容器是装液量为100ml/250ml的三角瓶，34°C恒温培养5-8天，在此期间要每天摇瓶5次；然后取查氏半干体培养液以体积比15%的接种量接入种母摇瓶培养基中，种母摇瓶培养基所用容器是装液量为100ml/250ml的三角瓶，摇床转速为300转，在34°C恒温摇床培养48-7 待用。液体种子制备所需要的培养基成分分别为
淀粉平皿培养基酵母粉2g/L，琼脂20 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L, NaCl 2 g/ L，液化玉米淀粉10g/L，pH值5. 0-5. 5 ；液化玉米淀粉是指玉米淀粉溶于水后加入1_2滴高温淀粉酶，煮沸30min后的产物；
查氏平皿培养基蔗糖 30 g/L, NaNO3 2 g/L, K2HPO4 1 g/L, MgSO4 · 7H20 0. 5 g/L, KCl 0. 5 g/L, FeSO4 0. 01 g/L,琼脂粉 20 g/L, pH 值 5. 5-6. 0 ；
查氏半干体培养基蔗糖 30 g/L, NaNO3 2 g/L, K2HPO4 1 g/L, MgSO4 · 7H20 0. 5 g/L, KCl 0. 5 g/L, FeSO4 0. 01 g/L,琼脂粉 1. 5 g/L, pH 值 5. 5-6. 0 ；
种母摇瓶培养基酵母粉2 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L, NaCl 2 g/L，液化玉米淀粉10g/L，pH值5. 0-5. 5。液化玉米淀粉是玉米淀粉溶于水后加入1_2滴高温淀粉酶，煮沸30min的产物。这些技术方案也可以互相组合或者结合，从而达到更好的技术效果。通过采用上述技术方案，本发明具有以下的有益效果
1、本发明使用β-环糊精发酵废液部分代替淀粉生产，生产所得糖化酶的活力不低于只以淀粉为原料时生产所产糖化酶的活力，节约生产成本，增加企业利润。2、将β-环糊精发酵废液再利用，变废为宝，本发明生产所得发酵液直接可作为酶制剂使用，省去了对β -环糊精发酵废液的处理，减轻环保压力。
具体实施例方式实施例1
以下是本发明的利用环糊精发酵废液生产糖化酶的方法的一种具体实施方式
。1、液体种子的制备
在无菌条件下，用无菌吸管抽吸0. Iml的解冻的菌球含量为IO3个/mL的无孢子黑曲霉菌液在淀粉平皿培养基上涂布，34°C恒温培养5天；然后挑取淀粉培养基上1-2个菌形规整、内凹陷规则的菌落，放置在查氏平皿培养基上划线分离，于34°C恒温培养5天使其成熟，成熟后放入0-4°C冰箱中保存；配制查氏半干体培养基，灭菌后用接种铲或环取查氏平皿培养基上已经成熟的1个单菌落于已灭菌的查氏半干体中，装液量为2/5，34°C恒温培养 8天，在此期间要每天摇瓶5次；然后取查氏半干体培养液以体积比15%的接种量接入种母摇瓶培养基中，装液量为2/5，种母摇瓶培养基在34°C恒温摇床培养7 待用，摇床转速为 300转。所述液体种子制备所需要的培养基成分分别为
淀粉平皿培养基酵母粉2g/L，琼脂20 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，NaCl 2 g/L，液化玉米淀粉(玉米淀粉溶于水后加入1-2滴高温淀粉酶，煮沸30min) 10g/L, pH值 5. 0-5. 5。查氏平皿培养基蔗糖30 g/L, NaNO3 2 g/L, K2HPO4 1 g/L, MgSO4 · 7H20 0. 5 g/L, KCl 0. 5 g/L, FeSO4 0. 01 g/L,琼脂粉 20 g/L, pH 值 5. 5-6. 0。查氏半干体培养基蔗糖30 g/L, NaNO3 2 g/L, K2HPO4 1 g/L, MgSO4 · 7H20 0. 5 g/ L, KCl 0. 5 g/L, FeSO4 0. 01 g/L,琼脂粉 1. 5 g/L, pH 值 5. 5-6. 0。种母培养基酵母粉2 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L, NaCl 2 g/L，液化玉米淀粉(玉米淀粉溶于水后加入1-2滴高温淀粉酶，煮沸30min) 10g/L, pH值5. 0-5. 5。2、黑曲霉发酵液的制备
①将符合要求的菌种液按装液量体积比的15%的接种量移至装入含有培养基的的一级摇瓶中，培养基配方为玉米淀粉80g/L，豆饼粉40g/L，玉米浆10mL/L，pH值4.8 ；培养基的装液量为2/5，发酵温度为34°C，摇床转速为220rpm，发酵pH值为4. 8-5. 0，发酵时间为 72h ；测得发酵液中糖化酶的酶活为3640U/mL。②将一级摇瓶中的发酵液按装液量体积比的15%的接种量移至装入含有培养基的二级摇瓶中，培养基配方为β -环糊精发酵废液200mL/L，玉米淀粉70g/L，玉米粉40g/ L，豆饼粉20g/L，玉米浆5mL/L，高温淀粉酶1_2滴，余量为水，pH值4. 8 ；培养基的装液量为 2/5，发酵温度为34°C，摇床转速为220rpm，发酵pH值为4. 8-5. 0，发酵时间为48h ；测得发酵液中糖化酶的酶活为M93U/mL。
③将二级摇瓶中的发酵液按装液量体积比的15%的接种量移至装入含有培养基的三级摇瓶中，培养基配方为β -环糊精发酵废液400mL/L ，玉米淀粉80g/L，玉米粉 50g/L，豆饼粉30g/L，玉米浆5mL/L，硫酸铵5g/L，高温淀粉酶1_2滴，余量为水，pH值4. 8 ； 培养基的装液量为2/5，发酵温度为34°C，摇床转速为220rpm，发酵pH值为4. 8-5. 0，发酵时间为72h ；测得发酵液中糖化酶的酶活为5598U/mL。④将三级摇瓶中的发酵液按装液量体积比的15%的接种量移至装入含有培养基的四级摇瓶中，培养基配方为β -环糊精发酵废液530mL/L，玉米淀粉180g/L，玉米粉 50g/L，豆粕40g/L，玉米浆20mL/L，硫酸铵5g/L，高温淀粉酶适1_2滴，余量为水，pH值4. 8 ； 培养基的装液量为2/5，发酵温度为34°C，摇床转速为220rpm，发酵pH值为4. 8-5. 0，发酵时间为144h，制成发酵液；测得发酵液中糖化酶的酶活为8022 U/mL。其酶活略高于同等条件下只使用淀粉作为原料时生产所得的酶活。
权利要求
1.一种利用环糊精发酵废液生产糖化酶的方法，包括使用含无孢子黑曲霉菌液体种子作为菌种制备黑曲霉发酵液，其特征是制备黑曲霉发酵液的方法为将菌体含量为 IO2-IO4个/mL，PH值3_5的菌种液按装液量体积比的15%的接种量移至装入含有培养基的的一级摇瓶中，发酵温度为34°C ±1 °C，摇床转速为220-240rpm，发酵pH值为4. 8-5. 0，发酵时间为72h ；将一级摇瓶中的发酵液按装液量体积比的15%的接种量移至装入含有培养基的二级摇瓶中，发酵温度为34°C ±1 °C，摇床转速为220-240rpm，发酵pH值为4. 8-5. 0，发酵时间为48h ；将二级摇瓶中的发酵液按装液量体积比的15%的接种量移至装入含有培养基的三级摇瓶中，发酵温度为34°C ±1 °C，摇床转速为220-240rpm，发酵pH值为4. 8-5. 0，发酵时间为72h ；将三级摇瓶中的发酵液按装液量体积比的15%的接种量移至装入含有培养基的四级摇瓶中，发酵温度为MO ±1 °C，摇床转速为220-240rpm，发酵pH值为4. 8-5. 0，发酵时间为144h，制成发酵液；所得发酵液中含有糖化酶，可直接作为糖化酶使用或进一步精制后使用。
2.根据权利要求1所述利用环糊精发酵废液生产糖化酶的方法，其特征是制备黑曲霉发酵液所用培养基成分为一级摇瓶培养基玉米淀粉80g/L，豆饼粉40g/L，玉米浆10mL/L，pH值4. 8，余量为水；二级摇瓶培养基β -环糊精发酵废液200mL/L，玉米淀粉70g/L，玉米粉40g/L，豆饼粉 20g/L，玉米浆5mL/L，高温淀粉酶1_2滴，余量为水，pH值4. 8 ；三级摇瓶培养基β -环糊精发酵废液400mL/L ，玉米淀粉80g/L，玉米粉50g/L，豆饼粉30g/L，玉米浆5mL/L，硫酸铵5g/L，高温淀粉酶1_2滴，余量为水，pH值4. 8 ；四级摇瓶培养基β-环糊精发酵废液530mL/L，玉米淀粉180g/L，玉米粉50g/L，豆粕 40g/L，玉米浆20mL/L，硫酸铵5g/L，高温淀粉酶适1_2滴，余量为水，pH值4. 8。
3.根据权利要求1所述利用环糊精发酵废液生产糖化酶的方法，其特征是作为液体种子的菌种应当符合菌球含量为IO2-IO4个/mL、PH值4-5的要求。
4.根据权利要求1所述利用环糊精发酵废液生产糖化酶的方法，其特征是作为液体种子的菌种制备方法是在无菌条件下，用无菌吸管抽吸0. Iml的解冻的菌球含量为 IO3个/mL的无孢子黑曲霉菌液，在淀粉平皿培养基上涂布，32-36°C恒温培养4_5天；然后挑取淀粉培养基上1-2个菌形规整、内凹陷规则的菌落，放置在查氏平皿培养基上划线分离，于32-36°C恒温培养4-6天使其成熟，成熟后放入0-4°C冰箱中保存；配制查氏半干体培养基，灭菌后用接种铲或环取查氏平皿培养基上已经成熟的1个单菌落于已灭菌的查氏半干体培养基中，查氏半干体培养基所用容器是装液量为100ml/250ml的三角瓶，34°C恒温培养5-8天，在此期间要每天摇瓶5次；然后取查氏半干体培养液以体积比15%的接种量接入种母摇瓶培养基中，种母摇瓶培养基所用容器是装液量为100ml/250ml的三角瓶，摇床转速为300转，在34°C恒温摇床培养48-7 待用。
5.根据权利要求4所述利用环糊精发酵废液生产糖化酶的方法，其特征是液体种子制备所需要的培养基成分分别为淀粉平皿培养基酵母粉2g/L，琼脂20 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L, NaCl 2 g/ L,液化玉米淀粉10g/L, pH值5. 0-5. 5 ；查氏平皿培养基蔗糖 30 g/L, NaNO3 2 g/L, K2HPO4 1 g/L, MgSO4 · 7H20 0. 5 g/L, KCl 0. 5 g/L, FeSO4 0. 01 g/L,琼脂粉 20 g/L, pH 值 5. 5-6. 0 ；查氏半干体培养基蔗糖 30 g/L，NaNO3 2 g/L，K2HPO4 1 g/L，MgSO4 · 7H20 0. 5 g/L， KCl 0. 5 g/L, FeSO4 0. 01 g/L,琼脂粉 1. 5 g/L, pH 值 5. 5-6. 0 ；种母摇瓶培养基酵母粉2 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L, NaCl 2 g/L，液化玉米淀粉 10g/L，pH 值 5. 0-5.5。
6.根据权利要求1所述利用环糊精发酵废液生产糖化酶的方法，其特征是一级摇瓶培养基、二级摇瓶培养基、三级摇瓶培养基和四级摇瓶培养基在摇瓶中的装液量均为 1/5-2/5。
全文摘要
本发明介绍了一种利用β-环糊精发酵废液生产糖化酶的方法，包括使用含无孢子黑曲霉菌的液体种子作为菌种、制备黑曲霉发酵液；将菌种按装液量体积比的15%的接种量将液体种子接入黑曲霉培养基中进行发酵，在一定的发酵条件下使用含β-环糊精发酵废液的培养基经过逐级扩大培养，得到黑曲霉发酵液，发酵液可直接作为糖化酶产品。本发明使用β-环糊精发酵废液部分代替淀粉生产，节约生产成本，既增加企业利润；将废液再利用，变废为宝，省去了对废液的处理，减轻环保压力。
文档编号C12R1/685GK102206619SQ20111009963
公开日2011年10月5日 申请日期2011年4月21日 优先权日2011年4月21日
发明者何佳, 关随霞, 孙晓菲, 张占洋, 张宏森, 李爱江, 赵启美 申请人:河南科技大学