专利名称：截形叶螨的scar标记及特异性pcr检测方法与试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物害螨的鉴定检测技术，特别是截形叶螨的SCAR标记及特异性PCR 检测方法与试剂盒。
背景技术：
截形叶螨属于蛛形纲蜱螨亚纲真螨目叶螨科，俗称红蜘蛛，是农业生产上的重要害螨，该螨寄主范围广泛，主要为害蔬菜和棉花、小麦等重要农作物。截形叶螨以成螨和幼若螨聚集在植物叶片的背面进行刺吸为害，造成叶片上出现失绿斑点，严重时出现火烧状， 叶片干枯脱落，甚至植株成片死亡。截形叶螨雌成螨梨形，0. 5mm大小，体呈红褐色或锈红色；雄成螨约0. 3mm大小，腹部末端稍尖。如此微小的个体在田间采用肉眼很难观察清楚。同时，在田间，多种叶螨种类经常同域混合发生，比如在蔬菜田，截形叶螨常和二斑叶螨、朱砂叶螨混合发生，而玉米田内则以截形叶螨为主，同时混合发生有其它种类的叶螨。不同叶螨的生物学特性和对不同药剂的抗药性发展及其现状各不相同，叶螨的各项基础研究及其田间防治的基础是摸清楚田间叶螨的种类，至少应明确其优势发生为害种类。传统的种类鉴定方法是根据叶螨雄性外生殖器的形态特征来进行鉴别的，然而，鉴于叶螨是偏雌性比，田间采集到的试虫中， 绝大多数都是雌性叶螨。因此，在传统分类中，为了鉴定叶螨的组成和种类，许多田间采集的叶螨试虫都必须在室内饲养到下一代，获得其雄性个体，把雄性个体的外生殖器做成切片，待切片在烘箱内烘干之后，结合雌雄成螨的体色在显微镜下观察鉴定。这样的鉴定方法需要耗时较长，而且研究发现不同地理区域内同种叶螨的外生殖器形态特征也存在较大变异，分类专业人员遇到难以界定的种类时，尚需教科书进行比对，因此这种传统方法对于非分类专业的研究者来说困难重重。但是，害虫的种类鉴定在害虫防治中占有非常重要的地位，准确快速的种类鉴定是进行其它生物学特性研究和防控技术研究的前提和基础。因此， 建立一套简便快速的分子鉴定技术对于该种叶螨各项相关工作的开展都是至关重要的。随着分子生物技术的发展及其广泛应用，DNA条码(DNA barcoding)被用来解决种类鉴定这个问题(Hebert等，2003a，2003b ;Tautz等，2002)。很多研究者由于其mtCOI 基因的母系遗传及多态性的特性而采用该基因进行研究，多数是采用扩增测序mtCOI序列或者ITS2序列并与其它已登录在GenBank上的该基因序列构建系统进化树，分析样本与已知序列之间的同源性和亲缘关系的远近，进而推断出该基因的所属种类(Hinomoto等， 2007 ；Vera等，2007 ；Tselila等，2007)。但是该技术也存在一些缺点和局限性，比如有些叶螨种类的序列在GenBank中未有登录，这样部分物种就得不到有效的聚类，因而无法进行准确分析，更有甚者，由于叶螨种类的鉴别困难，部分已经登录在GenBank上的特定叶螨的序列尚有待确认其准确性和可信度。另外，聚类树分析技术需要标本在PCR扩增之后， 经过回收、克隆等程序之后进行序列测定，这样会耗费大量的时间和财力。限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism，简称 RFLP)和单链构象多态性 (Single-Stranded Confirmation Polymorphisms，简称 SSCP)等技术也通常被用来进行昆
3虫种类的分子鉴定，但是其过程复杂，需要酶切、扩增或者扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染方法等，都是需要花费较长时间，费时费力，鉴于上述技术存在的不同的优缺点，因而其应用受到一定的局限。而基于随机扩增多态性(Random Amplification of Polymorphic DNA，简称 RAPD)基础上转化出来的 sequence characterized amplified region (SCAR)标记具有快速、稳定、准确等优点，因而得到广泛的应用。目前已成功应用于不同昆虫种类的鉴定方面，如烟粉虱(aiang GF等，2007)及其不同生物型、黑刺粉虱(刘循，2009)及西花蓟马(孟祥钦等，2010)等害虫种类的快速鉴别上均成功建立了 SCAR标记方法。研究证明，北方地区蔬菜田叶螨种类主要为截形叶螨、二斑叶螨和朱砂叶螨，其中截形叶螨和朱砂叶螨均为红色体型，二斑叶螨通常为黄绿色体型，这三种叶螨混合在一起发生时，肉眼基本无法鉴定其种类或者优势种类。
发明内容
本发明根据上述领域的需求和空白，提供一种截形叶螨的SCAR标记及特异性PCR 检测方法与试剂盒。截形叶螨的SCAR标记，其核苷酸序列如kq ID No. 1所示。截形叶螨的特异性PCR检测方法，包括如下步骤(1)调制包含有待测DNA模板和特异性引物对的PCR反应液，( 进行PCR反应，(3)检测PCR反应产物中是否出现预期长度的片段，其特征在于所述特异性引物对是根据上述SCAR标记的核苷酸序列设计的，所述特异性引物对的扩增区域在所述SCAR标记的核苷酸序列上。所述特异性引物对的序列如下5， -GCA TGT AAG TCC CAA ATC-3，禾口5，-ATA AAT GGA CAG GCG ATA-3，，预期扩增片段大小为 30;3bp。所述PCR体系为:10μ 1 2XES Taq Master Mix，特异性引物对中上游引物和下游引物(10 μ Μ)分别为1 μ 1，DNA模板约为lng，补充ddH20至20 μ 1。所述PCR扩增的程序为94°C预变性3min，94°C变性lmin，57°C退火45sec，72°C 延伸lmin, 35个循环，最后72°C延伸IOmin0截形叶螨的SCAR标记及特异性PCR检测试剂盒，其特征在于包括以下特异性引物5' -GCA TGT AAG TCC CAA ATC-3'禾口 5' -ATA AAT GGA CAG GCG ATA-3'0本研究采用RAPD扩增筛选到一条在截形叶螨体内特异的DNA片段如kq ID No. 1 所示，经过回收、克隆、测序之后，基于该片段序列重新设计一对特异性的序列特征化扩增区域(sequence characterized amplified region，简称 SCAR)引物，建立了一套鉴别检测截形叶螨的PCR方法，验证试验证明，该方法可以从截形叶螨的基因组DNA中直接扩增出一条特异性很强的、单一的DNA条带，如kq ID No. 2所示，而在其同区域内发生危害的二斑叶螨和朱砂叶螨体内未扩增到该条带，从山楂叶螨中也未检测到任何条带，说明该片段是截形叶螨特有的SCAR标记。根据SCAR标记的特异性，本领域技术人员可根据该SCAR标记设计出多对特异性引物，只要所设计的引物对的扩增区域在SCAR标记的序列上，即可用于特异性鉴别检测截形叶螨。本发明的检测方法还可从截形叶螨的卵、幼螨、若螨、雄螨和
4雌螨中的任何虫态中稳定扩增出预期条带，也就是说，不论田间的任何虫态，均可用来进行 PCR检测，且所需的模板量可到ng级，即单头虫子就可以用于检测，大大增加了检测的快速性和适用性，可以作为更有实际预防意义的早期检测用途。此方法与传统鉴定方法相比，简便快速，省时省力，田间采集样本后即可进行室内鉴定，一天之内可以得出结果，且对分类专业和非分类专业人士来说，该技术易于被掌握， 是一种快速、准确鉴定截形叶螨种类的方法。本发明还提供了优化的PCR体系和程序，可以是检测灵敏度达到纳克级别，即单头虫子即可用于检测，大大提高了检测效率和可操作性。本发明还提高了检测截形叶螨的特异性PCR试剂盒，主要包括特异性引物。为了提高试剂盒的实用性，本领域技术人员可以在试剂盒中加入PCR检测需要的其它试剂或试剂预混液。该特异性SCAR引物对截形叶螨的种类特异性很强，大大缩短了截形叶螨的种类鉴定时间，DNA提取过程需要约6个小时，特异性PCR扩增仅需要3个小时，因此整个过程仅需要1天时间即可完成，且准确率高，技术易于掌握。
图1. 0PB-04对三种叶螨的PCR扩增结果，M =Marker VII, 1-4 朱砂叶螨；5-8 二斑叶螨；9-12 截形叶螨；图2.特异性SCAR引物在不同叶螨种类中的PCR扩增结果，Ml =Marker I ； 1-9 截形叶螨；10-14 朱砂叶螨；15-19 二斑叶螨；20-24 山楂叶螨；图3.截形叶螨引物对北京海淀区观赏茄子上叶螨种群的扩增结果，Ml =MarkerI ； 1-8 观赏茄子上的叶螨种群；9 空白对照。图4.截形叶螨SCAR引物对该螨不同发育阶段的PCR扩增结果，Ml =Marker I ;1_6 截形叶螨卵；7_12 截形叶螨幼螨；13_18 截形叶螨若螨； 19-24 截形叶螨雄成螨。
具体实施例方式实施例1截形叶螨SCAR标记及引物的获得材料和方法1.材料1. 1供试叶螨截形叶螨由福建省农科院植保所提供，室内饲养至今；朱砂叶螨、二斑叶螨由南京农业大学提供，这三个种类通过传统的显微镜下观察其雄性外生殖器形态特征及雌性成螨的颜色等形态特征而鉴定。异域发生的叶螨对照种类采用果树上发生的山楂叶螨，由山东省农科院果树所提{共。上述试验材料，本实验室均有保存，可向公众发放用于验证试验。1. 2 试齐[J
随机扩增引物采用Operon公司的RAPD通用引物系列，采用0PA、0PB、0PC系列，每个系列包含20条引物。叶螨的基因组DNA提取试剂盒、PCR产物纯化系统均购自北京百泰克生物技术有限公司；克隆载体EZ-TTM Fast Ligation Kit 购自GeMtar公司，携带氨苄青霉素抗性基因(Amp)，重组体可通过蓝白斑筛选鉴定；DH5 α感受态细胞购自GeMtar公司；2XEs Taq MasterMix，含ES TaqE 5U/μ 1购自北京康为科技有限公司。氨苄青霉素、X-Gal和IPTG、DNA Marker系列购自天根生化科技(北京)有限公司；Biowest agarose，力口拿大进口分装；引物合成委托上海英竣生物工程公司进行；特异性扩增片段的序列测定委托北京诺赛和擎科生物工程有限公司进行。2.方法2. IDNA 提取单头雌成螨的基因组DNA提取方法采用北京百泰克有限公司的DNA提取试剂盒 (溶液型)，方法参照试剂盒说明书进行。将单头叶螨置于滴有20 μ 1裂解液中的Parafilm 膜上，以0. 2ml的PCR管底部作为勻浆器充分研磨，用另40 μ 1裂解液清洗勻浆器2次，合并混勻；然后以微量移液器移入1. 5ml离心管；加入蛋白酶K 2μ 1，混勻后，55°C条件下水浴4小时；短暂电动离心后，加入RNase2. 5 μ 1，置于37°C烘箱，15 30min ；取出后晾至室温，加入蛋白沉淀液25 μ 1，漩涡振荡器上高速震荡25s ；冰浴5min沉淀蛋白；室温13000r/ min离心5min ；小心吸取上清液到另一个新管中(不要吸入沉淀)，加入等体积的异丙醇， 颠倒混勻30次；室温12000r/min离心lOmin，弃上清；加入Iml 70%乙醇漂洗DNA沉淀，室温12000r/min离心2min，弃上清；加入Iml无水乙醇漂洗DNA沉淀，室温12000r/min离心 2min，弃上清；加入20μ 1 DNA溶解液，于65°C下水浴60min，放于_20°C保存待用。采用紫外分光光度仪检测基因组DNA，浓度为0. 8 1. 2 μ g/mL ；OD260/OD280在1.6 1.8范围内， 表明样品纯度高，无蛋白污染，可用于下一步的PCR反应。2. 2RAPD 扩增RAPD 扩增反应设为 20 μ 1 体系。其中，2XEs Taq MasterMix 为 10 μ 1，DNA 为 1· 5μ 1，RAPD 引物(IOnmol)为 3μ 1，ddH20 为 5· 5μ 1。PCR 反应于 S1000PCR 扩增仪上进行。PCR 扩增程序为94°C进行 ^iin 预变性；94°C lmin，37°C 45sec，72°C Imin :35s，共进行30个循环，之后在72°C下延伸lOmin，最后保存于4°C条件下。扩增反应结束后，取样 6 μ 1，在1 %的琼脂糖凝胶电泳上，于1 X TAB缓冲液中、5V/cm电压下电泳，电泳结束后于自动凝胶成像系统上照相检测。RAPD弓丨物扩增中，发现随机弓I物0PB-04 (GGA CTG GAG T)对不同叶螨种类扩增时， 对于截形叶螨表现出很强的种的特异性扩增条带，一条大约716bp的DNA条带在截形叶螨不同个体中稳定出现，且该特异性条带很亮，而在朱砂叶螨中未出现，在二斑叶螨也有此条带，但经过多次扩增后发现，该特异性条在二斑叶螨种群中不如在截形叶螨中亮度更高，见图1。
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2. 3特异性扩增产物回收克隆和测序在琼脂糖凝胶电泳上回收截形叶螨的特异性扩增条带，采用DNA纯化试剂盒(北京百泰克产品)进行纯化，之后把该纯化片段连接到克隆载体(Ger^tar公司产品)上，转化到T0P10感受态细胞，37°C条件下倒置培养过夜(8h)。第二天，挑取白色阳性克隆，挑取白色菌落至10 μ 1无菌水中，混合均勻，取1 μ 1作为PCR模板，采用通用引物(MU)进行菌体PCR扩增，鉴定重组子。鉴定后的阳性克隆菌液加入LB液体培养基中37°C过夜振荡培养， 采用北京百泰克生物技术有限公司的质粒提取试剂盒提取质粒，阳性质粒采用特异性引物扩增验证后，送北京诺赛生物工程有限公司和北京擎科生物工程有限公司进行测定，所用的测序引物为通用引物T7或M13。回收克隆后测定其序列如SEQ ID No. 1所示，去掉下游的反向互补引物的10个 DNA序列，截形叶螨的特异性扩增片段大小为716bp。2. 4SCAR引物设计及PCR扩增条件的优化根据得到的716bp的特异性片段序列采用I^rimer 5软件设计截形叶螨的SCAR特异性引物对截形 _303F(5，-GCA TGT AAG TCC CAA ATC-3，)和截形 _303R(5，-ATA AAT GGA CAG GCG ATA-3，)。预期扩增片段大小为303bpoSCAR特异性扩增的反应体系设定为20 μ 1，其中2XES Mix (含ES TaqE 5U/ μ 1) 为10μ 1，上游引物和下游引物(ΙΟμΜ)分别为Ιμ ，DNA模板约为lng，补充ddH20至 20 μ 1。反应程序如下94°C预变性3min，之后进行35个循环(94°C变性lmin，57°C退火 45sec，72°C延伸 Imin)，最后 72°C延伸 IOmin0对室内饲养保存的截形叶螨种群进行PCR扩增，以二斑叶螨、朱砂叶螨和山楂叶螨作为对照种群，发现仅在截形叶螨种群中出现一条30!3bp的特异性条带，经回收克隆和测序，结果与预期片段(303bp)的序列一致。而在作为对照的其它三个种类中未出现任何条带，见图2，说明该特异性引物对于截形叶螨具有很强的种的特异性，适合用于截形叶螨的种类鉴定。实施例2.对检测方法的重复性、灵敏性及特异性的验证种内验证对2010年采集自中国海淀区观赏茄子寄主上的叶螨种群，由日本茨城大学著名的叶螨分类专家Tetsuo Gotoh教授进行传统形态学鉴定，发现其种类为截形叶螨。采用实施例1 (DNA提取同实施例1的2. 1节，检测方法用实施例1的2. 4节)对该叶螨种群进行 PCR扩增，结果见图3，出现了预期的约303bp的特异性扩增条带，说明所检测的叶螨种群为截形叶螨。采用截形叶螨不同个体验证该引物对在种群内部的重复性，另外采集截形叶螨种群的不同发育阶段，及卵、幼螨、若螨、雄螨和雌螨，采用实施例1设计的引物对进行扩增， 验证其扩增灵敏度和重复性。DNA提取同实施例1的2. 1节，检测方法用实施例1的2. 4 节。结果显示，截形叶螨的不同发育阶段中均可稳定扩增出一条约30!3bp的DNA条带，结果见图4。且能检测出条带的模板最低需要量可到ng级。种间验证采用与截形叶螨同域同时发生的二斑叶螨和朱砂叶螨以及异域发生的果树上山楂叶螨作为对照叶螨来验证该检测方法的可靠性和特异性。DNA提取同实施例1的2. 1节， 检测方法用实施例1的2. 4节。结果显示，可以成功快速地从截形叶螨种群中扩增出一条30!3bp的DNA条带，而在其同域发生的二斑叶螨和朱砂叶螨中未扩增到该条带，另外，从果树山楂叶螨种群中也未检测到任何条带。如图2所示。
权利要求
1.截形叶螨的SCAR标记，其核苷酸序列如kqID No. 1所示。
2.截形叶螨的特异性PCR检测方法，包括如下步骤(1)调制包含有待测DNA模板和特异性引物对的PCR反应液，(2)进行PCR反应，(3)检测PCR反应产物中是否出现预期长度的片段，其特征在于所述特异性引物对是根据权利要求1所述的SCAR标记的核苷酸序列设计，所述特异性引物对的目标扩增区域在所述SCAR标记的核苷酸序列上。
3.根据权利要求2所述的特异性PCR检测方法，所述特异性引物对的序列如下 5' -GCA TGT AAG TCC CAA ATC-3'禾口5，-ATA AAT GGA CAG GCG ATA-3，，预期扩增片段大小为 303bp。
4.根据权利要求2或3所述的特异性PCR检测方法，所述PCR体系为10μ12XES Taq Master Mix，特异性引物对中上游引物和下游引物浓度均为10 μ M，分别加入1 μ 1，DNA 模板约为Ing,补充ddH20至20 μ 1。
5.根据权利要求4所述的特异性PCR检测方法，所述PCR扩增的程序为94°C预变性 3min，94°C变性 lmin，57°C退火 45sec，72°C延伸 lmin，35 个循环，最后 72°C延伸 IOmin0
6.截形叶螨的SCAR标记及特异性PCR检测试剂盒，其特征在于包括以下特异性引物 5' -GCA TGT AAG TCC CAA ATC-3'禾口 5' -ATA AAT GGA CAG GCG ATA-3'0
全文摘要
本发明“截形叶螨的SCAR标记及特异性PCR检测方法与试剂盒”，所述SCAR标记的核苷酸序列如Seq ID No.1所示，所述特异性PCR检测方法，其特征在于所用的特异性引物是根据所述SCAR标记的序列设计且目标扩增区域在所述SCAR标记的序列上。本发明提供的截形叶螨的特异性检测方法及其试剂盒具有对截形叶螨特异性强，检测效率高，可操作性好等优点，是一种易于推广的低成本的截形叶螨检测技术。
文档编号C12N15/11GK102220323SQ20111016757
公开日2011年10月19日 申请日期2011年6月21日 优先权日2011年6月21日
发明者吴青君, 张友军, 徐宝云, 戴宇婷, 王少丽 申请人:中国农业科学院蔬菜花卉研究所