专利名称：基于lamp技术检测无形体及立克次体的试剂盒及其方法
技术领域：
本发明涉及立克次体的检测试剂盒及方法。具体而言本发明涉及采用环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplifition, LAMP)检测病原微生物的试剂盒，以及其检测方法。
背景技术：
Loop-mediated isothermal amp 1 if ication (LAMP), ^—ft If Wtl@Ι Γ±1 ^ο LAMP法具有高灵敏性，高特异性和操作简便等特点，并能在恒温条件下，一小时内将目的基因扩增IO9倍。斑点热是由一类专性细胞内寄生的斑点热群立克次体(STOR)引起的蜱传立克次体病[P· Parola, C. D. Paddock, D. Raoult, Tick-borne rickettsioses around the world :emerging diseases challenging old concepts, Clin Microbiol Rev, vol.18, no. 4, pp. 719-756,2005. ]0该病在世界范围内广泛分布。STOR可通过多种媒介如蜱、蚤及螨等传播。主要易感人群是从事野外田间活动的农民、森林作业工人、野外军事活动的战士以及旅游人员等。1984年前，世界范围内证实只有5种斑点热群立克次体对人有致病作用。然而，目前已经发现十余种斑点热群立克次体。我国存在的STOR主要有西伯利亚立克次(R. sibirica) [L Zhang，J. Jin, X. Fu et al.，Genetic differentiation of Chinese isolates of Rickettsia sibirica by partial ompA gene sequencing and multispacer typing, Clin Microbiol, vol. 44，no. 7，pp. 2465-2467，2006.]、黑龙江立克次体(R. heilongjiangensis)以及西伯禾丨J亚立克次体内蒙古亚种(Rickettsia sibirica mongolotimonae)[D. Raoult, P. Ε. Fournier, Μ. Eremeeva et al·，Naming of Rickettsiae and rickettsial diseases,Ann N Y Acad Sci, vol. 1063,no. pp. 1_12，2005·]。该类疾病因缺乏典型临床表现，易误诊和延误诊疗可造成严重疾病并可能导致死亡[A. S. Chapman, J.S. Bakken, S. Μ. Folk et al. , Diagnosis and management of tickborne rickettsial diseases Rocky Mountain spotted fever, ehrlichioses, and anaplasmosis—United States :a practical guide for physicians and other health-care and public health professionals, MMWR Recomm R印，vol. 55，no. RR-4，pp. 1—27，2006.]。目前该类疾病诊断及治疗的最大挑战是实验室早期诊断。血清学诊断需要急性期与恢复期双份血清，不利于早期诊断。病原分离培养是可靠的实验室诊断技术，但因分离率低且只有专业实验室能进行，也不利于早期诊断。以特异基因为检测目的的PCR技术是目前取代分离培养的快速诊断技术。但是，荧光定量PCR需要特殊仪器，而普通巢氏PCR费时且易污染。同时两者因哺乳动物DNA干扰也可影响检出阳性率。人粒细胞无形体病(HGA)是一种由嗜吞噬无形体(Anaplasma phagocytophilum) 引起的新发蜱传人兽共患病，1990年及1997年分别于在美国及欧洲报道。该病在欧美流行地区血清流行率为15%-36%[1.工1，工1.]^61^]\1丄丄&1~ 6『et al. ,The emergence of another tickborne infection in the 12-town area around Lyme, Connecticut human granulocytic ehrlichiosis, Infect Dis, vol.181, no.4, pp. 1388-1393,2000·]。2006年安徽省某医院发生了无形体院内感染事件[L.aiang，Y. Liu, D. Ni et al.，Nosocomial transmission of human granulocytic anaplasmosis in China, JAMA, vol.300, no.19, pp. 2263-2270，2008.]，继后，全国农业高危人群无形体血清流行病学调查结果显示，血清抗体阳性率为13.49% (未发表)。我国立克次体病最大挑战是早期快速诊断。传统间接免疫荧光方法检测抗体不仅需要价格昂贵的荧光显微镜，还需要等病人恢复期标本，不利于早期诊断。灵敏性低的普通PCR、费时易污染的巢氏PCR以及灵敏性较高的荧光定量PCR 等都需要一定的仪器，这就限制了农村地区无形体病的诊断，然而，这些地区且又是立克次体病高发地区。这就急需开发快速、灵敏并且操作简单的检测方法以应用于农村地区。本文采用近年报道的环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplif ition, LAMP) [Τ. Notomi, H. Okayama, H. Masubuchi et al. , Loop-mediated isothermal amplification of DNA, Nucleic Acids Res, vol. 28, no. 12, pp. E63, 2000], 分别以斑点热群立克次体的ompB基因和嗜吞噬无形体的msp2基因为基础设计引物，建立了快速、敏感特异、经济尤其适用于广大农村地区的以上两种病原微生物的LAMP检测试剂盒及检测方法。
发明内容
本发明的目的在于针对现有诊断方法耗时，需要特殊仪器，而且灵敏度和特异性不高，提供一种用于检测斑点热群立克次体和嗜吞噬无形体的特异性强，灵敏性高，快速反应，操作简便，而且不需要特殊仪器的检测方法和试剂盒，能更好的应用于条件设备不足的地区临床诊断。本发明公开了一种采用LAMP技术检测斑点热群立克次体的试剂盒，包括检测 ompB基因的LAMP反应液，所述LAMP反应液含有6条特异性引物、缓冲液、dNTP混合液、 MgSO4溶液、甜菜硷溶液、DNA聚合酶。本发明同时公开了一种采用LAMP技术检测嗜吞噬无形体的试剂盒，包括检测 msp2基因的LAMP反应液，所述LAMP反应液含有6条特异性引物、缓冲液、dNTP混合液、 MgSO4溶液、甜菜硷溶液、DNA聚合酶。本发明还公开了所述试剂盒在制备检测立克次体工具中的应用，其使用包括以下过程1)首先，将包含特异性引物、缓冲液、dNTP混合液、甜菜硷溶液、MgSO4溶液以及 DNA聚合酶的LAMP反应液与待检测样品混合。2)其次，将反应体系置于61-65°c恒温反应0. 5-2h，80-90°C恒温终止反应 3_15min。3)最后进行反应产物检测，将反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；或在反应管中添加的STOR Green I，通过观察颜色判断结果，静置2-lOmin后，反应管中呈绿色的为阳性， 呈橙色的为阴性。本发明所述采用LAMP技术检测斑点热群立克次体的试剂盒包括LAMP反应液，所述反应液中包括6条特异性引物。斑点热群立克次体的LAMP特异性引物的设计通过序列分析软件对Genbank中 17 条 ompB 基因序列进行比对，根据 Rickettsia sp. BJ-90 (Genbank :AY331393)的 8 个区域设计6条引物FIP-I、BIP-I、F3-1、B3-1、LFA-1、LBA-1。所述引物与靶基因的1209位 1427位的核酸序列的一部分或其互补链互补。所述引物F3-1的序列Sequence NO. 1, 引物B3-1的序列为Sequence NO. 2、引物FIP-1的序列为Sequence NO. 3、引物BIP-1的序列为kquence NO. 4、引物LFA-1的序列为kquence NO. 5、引物LBA-1的序列为kquence NO. 6。所述序列中的i为次黄嘌呤可以与胞嘧啶和腺嘌呤配对。或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延长的序列；或者与上述序列同源性大于85%的序列；或者上述序列的互补序列。本发明提供的检测斑点热群立克次体ompB LAMP检测试剂盒还包含有6条引物的 LAMP反应液，共同构成LAMP检测体系。25 μ L ompB LAMP检测体系的具体配置如下:FIP和BIP引物各1. 6uM，LF和 LB 引物各 0.8uM，F3 及 B3 引物各 0. 2uM，20mM Tris-HCl (pH 8. 8), IOmM KCl,8mM MgSO4, IOmM (NH4)2SO4,0· 1% Tween 20，0· 8M 甜菜脸和 dNTPs 1. 4mM, 1 μ 1 Bst DNA 酶(8U/μ 1)。本发明所述的检测斑点热群立克次体ompB LAMP试剂盒的检测反应，先63°C恒温反应lh，80°C终止反应5min。通过3 μ L反应产物在2%的琼脂糖凝胶电泳中检测，或在反应管中添加IyL的1000 X STOR Green I，通过观察颜色判断结果，静置3 5min后，反应管中呈绿色的为阳性，呈橙色的为阴性。本发明采用LAMP技术检测嗜吞噬无形体的试剂盒，包含嗜吞噬无形体的LAMP 特异性引物的设计通过序列分析软件对Genbank中82条msp2基因序列进行比对，根据 A.phagocytophilum isolate EQ6 D22 (Genbank :AY763471)的 8 个区域设计 6 条引物 FIP-2、BIP-2、F3-2、B3-2、LFA-2、LBA-2。所述引物与靶基因的374位 592位的核酸序列的一部分或其互补链互补。所述引物FIP-2的序列为kquence NO. 7，引物BIP_2的序列为 Sequence NO. 8、引物 F3-2 的序列为 kquence NO. 9、引物 B3-2 的序列为 kquence NO. 10、 引物LFA-2的序列为kquence NO. 11、引物LBA-2的序列为kquence NO. 12。所述序列中的i为次黄嘌呤可以与胞嘧啶和腺嘌呤配对。或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延长的序列；或者与上述序列同源性大于85%的序列；或者上述序列的互补序列。本发明提供的msp2LAMP检测试剂盒还包含有6条引物的LAMP反应液，共同构成 LAMP检测体系。25 μ L msp2LAMP检测体系的具体配置如下25 μ L ompB LAMP检测体系的具体配置如下FIP和BIP引物各1. 6uM, LF和LB引物各0. 8uM, F3及B3引物各0. 2uM, 20mM Tris-HCl(pH 8. 8), IOmM KCl,8mM MgSO4, IOmM(NH4)2SO4,0. 1 % Tween 20，0·8Μ 甜菜脸和 dNTPs 1. 4mM,1 μ 1 BstDNA 酶(8U/μ 1)。本发明所述的msp2LAMP试剂盒的检测反应，先63°C恒温反应lh，80°C终止反应 5min。通过3 μ L反应产物在2 %的琼脂糖凝胶电泳中检测，或在反应管中添加1 μ L的 1000 X SYBR Green I，通过观察颜色判断结果，静置3 5min后，反应管中呈绿色的为阳性，呈橙色的为阴性。与现有技术相比，本发明提供的试剂盒及检测方法能够快速、灵敏地检测斑点热群立克次体以及嗜吞噬无形体，具有较高的特异性并且对检测条件要求低，尤其适用于农村地区。
图1斑点热群立克次体的特异性LAMP引物筛选。用三套引物分别扩增ompB基因， 使用LMAP浊度仪LA-320监测反应，其中B组的引物扩增时间短，扩增量大。图2两套ompB基因环引物对目的基因扩增效果图。2套环引物4条上下游引物交叉配对对ompB的扩增效果。4组引物扩增效率相差不大，但用kquence NO. 5,Sequence NO. 6引物扩增效果最好。图3斑点热群立克次体LAMP检测的灵敏性测试的琼脂糖电泳图。LMAP 用ompB LAMP法的引物扩增稀释质粒的基因。PCR:用标准质粒扩增稀释质粒的基因。LAMP法的引物更加灵敏。图4斑点热群立克次体LAMP检测的灵敏性测试的实时定量图。LAMP法的引物，在体系中有5个克隆时就能检测到ompB基因的存在。图5嗜吞噬无形体的LAMP引物筛选。用三套引物分别扩增msp2基因，使用LMAP 浊度仪LA-320仪器监测反应，其中B组的引物扩增时间短，扩增量大。图6两套msp2基因环引物对目的基因扩增效果图。2套环引物4条上下游引物交叉配对对msp2的扩增效果。4组引物扩增效率相差不大，但用kquence NO. 11、Sequence NO. 12引物扩增效果最好。图7嗜吞噬无形体LAMP检测的灵敏性测试的实时定量图。LAMP法的引物，在体系中存在25个克隆时就能检测到msp2基因的存在。图8嗜吞噬无形体LAMP检测的灵敏性测试的琼脂糖电泳图。LMAP 用msp2LAMP 法的引物扩增稀释质粒的基因。PCR:用标准质粒扩增稀释质粒的基因。LAMP法的引物更加灵敏。
具体实施例方式实施例1 斑点热群立克次体的检测1.斑点热群立克次体ompB基因的LAMP引物设计从Genbank中检索获得立克次体ompB基因序列，使用DNAstar软件进行比对，在比对所得的保守区域，以Rickettsia sp. BJ-90 (AY331393)序列为模板，使用LAMP引物设计软件(Primer Explorer software, version 4.0)在该区域进行LAMP引物设计，设计3 套引物表1斑点热群立克次体ompB基因的LAMP特异性引物
权利要求
1.一种采用LAMP技术检测斑点热群立克次体的试剂盒，包括检测ompB基因的LAMP反应液，所述LAMP反应液含有6条特异性引物、缓冲液、dNTP混合液、MgSO4溶液、Betaine溶液、DNA聚合酶。
2.根据权利要求1所述的LAMP反应液，其特征在于，所述6条特异性引物的序列为 Sequence NO. 1、Sequence NO. 2、Sequence NO. 3、Sequence NO. 4、Sequence NO. 5、Sequence NO. 6。
3.一种采用LAMP技术检测嗜吞噬无形体的试剂盒，包括检测msp2基因的LAMP反应液，所述LAMP反应液含有6条特异性引物、缓冲液、dNTP混合液、MgSO4溶液、Betaine溶液、DNA聚合酶。
4.根据权利要求3所述的LAMP反应液，其特征在于，所述6条特异性引物的序列为！Sequence NO. 7、Sequence NO. 8、Sequence NO. 9、Sequence NO. 10、Sequence NO. 11、 Sequence NO. 12。
5.权利要求1-4所述的试剂盒在制备检测斑点热群立克次体和嗜吞噬无形体工具中的应用，其使用包括以下过程1)首先，将包含特异性引物、缓冲液、dNTP混合液、Betaine溶液、MgSO4溶液以及DNA 聚合酶的LAMP反应液与待检测样品混合。2)其次，将反应体系置于61-65°C恒温反应0.5-2h，80-90°C恒温终止反应3-15min。3)最后进行反应产物检测，将反应产物进行琼脂糖凝集电泳检测；或在反应管中添加的STOR Green I，通过观察颜色判断结果，静置2-lOmin后，反应管中呈绿色的为阳性，呈橙色的为阴性。
全文摘要
本发明公开了基于环介导恒温扩增技术(LAMP)检测无形体及立克次体的试剂盒及其检测方法。本发明涉及无形体及立克次体的分子生物学检测技术，针对斑点热群立克次体的ompB基因和嗜吞噬无形体的msp2基因设计特异性引物，提供了采用LAMP技术检测斑点热群立克次体以及嗜吞噬无形体的检测试剂盒。该试剂盒具有快速、灵敏、特异性高不受实验条件限制等特点，适用于临床尤其是条件有限的农村地区的斑点热和粒细胞无形体病检测。本发明还公开了利用试剂盒检测立克次体的方法。
文档编号C12R1/01GK102251039SQ20111020217
公开日2011年11月23日 申请日期2011年7月19日 优先权日2011年7月19日
发明者张丽娟, 潘磊 申请人:中国疾病预防控制中心传染病预防控制所