专利名称：五色荧光矩阵标准物及其制备方法与专用引物组合物的制作方法
技术领域：
本发明属于法医遗传学及生物技术领域，涉及一种五色荧光矩阵标准物质及其制备方法。
背景技术：
近年来，随着毛细管电泳技术、荧光复合扩增技术及多荧光检测技术的应用，基因分型技术发展迅速，特别是在法医学DNA检验领域得到了广泛的应用。目前，基因分型技术主要是通过毛细管电泳设备及荧光检测设备分析不同荧光标记的待测DNA片段的分子量， 从而实现分型的目的。多种荧光分子标记技术使得DNA检测的效率得到极大的提高，甚至可实现相同分子量DNA片段的区分。然而，利用这类仪器分析分子量时需要一个荧光矩阵标准物质来进行不同荧光的划分，也就是荧光矩阵标准物质(Matrix Mandard)。目前，在国内DNA检测实验室最常见的检测设备主要是ABI PRISM 310、3100、 3100-Avant,3130和3130x1型遗传分析仪，内置不同的检测模式，不同的检测模式对应不同的荧光染料组合。常用的荧光染料及其组合有四色组合5-FAM、J0E、NED、R0X(AB公司)， FL、JOE、TAMRA, CXR(Promega 公司)；五色组合 6-FAM、VIC, NED、PET、LIZ (AB 公司)。各组合不同颜色会互相重叠干扰。通过制备荧光标志物，在遗传分析仪上生成正确的Matrix文件给予荧光信号收集和分析时的荧光识别，随之检测信号经过软件处理，计算互相重叠的不同颜色的光谱，并且各颜色通道之间互不干扰，对评估多色荧光系统是非常关键的。不同的荧光标记就必须建立不同的荧光标准物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种扩增五色荧光矩阵标准物质的引物组合物。本发明提供的引物组合物由不同颜色荧光染料标记过的如下5对引物组成由序列表中序列6所示的DNA和序列表中序列7所示的DNA组成的引物对1，由序列表中序列8 所示的DNA和序列表中序列9所示的DNA组成的引物对2，由序列表中序列10所示的DNA 和序列表中序列11所示的DNA组成的引物对3，由序列表中序列12所示的DNA和序列表中序列13所示的DNA组成的引物对4，由序列表中序列14所示的DNA和序列表中序列15所示的DNA组成的引物对5。所述引物组合物中，每对引物对中的两条引物之间的摩尔比为1 1;所述引物对1、引物对2、引物对3、引物对4和引物对5的摩尔比为如下1)或2)1)(0.3-0.5) (0.1-0.3) (0. 5—0. 7) (0.2-0.4) (0. 2—0. 4)；优选摩尔比为 0. 4 0. 2 0. 6 0. 3 0. 3 ；2)0. 4 0. 2 0. 6 0. 3 0. 3。上述不同颜色荧光染料在每对引物的5’端进行标记；不同颜色荧光染料优选为红色、橙色、黄色、绿色或蓝色荧光染料，更优选是FAM、HEX、TAMAR、TET或R0X。所述引物对1、引物对2、引物对3、引物对4和引物对5整体包装或均单独包装。
本发明的另一目的在于提供一种制备五色荧光矩阵标准物质的方法。所述方法包括如下步骤用任一上述的引物组合物中的引物对1、引物对2、引物对3、引物对4和引物对5 在PCR体系中一次扩增出序列表中序列1、序列2、序列3、序列4和序列5所示的5个DNA 片段，得到五色荧光矩阵标准物质。上述PCR体系中的模板是9947A DNA。上述PCR体系中扩增条件是95°C预变性1 Omin ；95°C变性30s，60°C退火30s， 72°C延伸Imin, 35个循环；最后60°C延伸60min。上述的方法制备得到的五色荧光矩阵标准物质属于本发明的保护范围之内。上述的荧光矩阵标准物质在毛细管电泳的荧光校准中的应用也属于本发明的保护范围之内。与传统的四色荧光矩阵标准物质相比，本发明提供的荧光矩阵标准物质制备方法能够在一个反应体系内同时获得含有五种荧光产物的荧光标准物，无需进行单色荧光标准物质的混合和调配即可直接应用于荧光校正。该方法极大的简化了荧光标准物的制备工艺流程，避免了复杂繁琐的操作。
图1为实施例1引物对1扩增得到的产物的毛细管电泳检测图。图2为实施例1引物对2扩增得到的产物的毛细管电泳检测图。图3为实施例1引物对3扩增得到的产物的毛细管电泳检测图。图4为实施例1引物对4扩增得到的产物的毛细管电泳检测图。图5为实施例4引物对5扩增得到的产物的毛细管电泳检测图。图6为实施例4五色荧光标准物的毛细管电泳检测结果。图7为实施例5中四色荧光矩阵标准物的上机结果。图8为实施例5中五色荧光矩阵标准物的上机结果。图9为四色荧光矩阵标准物STR检测结果(红色内标，ROX标记)。图10为五色荧光矩阵标准品进行荧光校准后形成的DNA样本的STR分型图谱(橙色内标，TET标记)。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。本发明中荧光矩阵标准物与荧光标准物、荧光标准品的含义等同。实施例1、单引物扩增荧光矩阵标准品1、引物的设计与合成设计如下的4对引物，并在引物的5’端分别标记不同的荧光分子。引物对1 (D21S11)HEX 标记上游CCCCAAGtgaattgccttct(序列 6)下游AGTCAATGTTCTCCAGAGACagac(序列 7)
引物对 2(D5S818)R0X 上游5,-GGGTGATTTTCCTCTTTGGT-3‘(序列 8)下游5'-TGATTCCAATCATAGCCACA-3‘(序列 9)引物对 3 (D8S1179) FAM 上游TTGCAACTT ATATG TATTT TTGTA TTTCA TG (序列 10)下游ACCAAATTGTGTTCATGAGTATAGT TTC (序列 11)引物对 4(D13S317)TMR 上游5'-CAGAAGTCTGGGATGTGGAGGA-3‘(序列 12)下游5'-GGCAGCCCAAAAAGACAGA-3‘(序列 13)2、PCR反应体系的建立PCR反应体系和反应条件如下
权利要求
1.扩增五色荧光矩阵标准物质的引物组合物，其特征在于它由不同颜色荧光染料标记过的如下5对引物组成由序列表中序列6所示的DNA和序列表中序列7所示的DNA组成的引物对1，由序列表中序列8所示的DNA和序列表中序列9所示的DNA组成的引物对 2，由序列表中序列10所示的DNA和序列表中序列11所示的DNA组成的引物对3，由序列表中序列12所示的DNA和序列表中序列13所示的DNA组成的引物对4，由序列表中序列14 所示的DNA和序列表中序列15所示的DNA组成的引物对5。
2.如权利要求1所述的引物组合物，其特征在于所述引物组合物中，每对引物对中的两条引物之间的摩尔比为1 1;所述引物对1、引物对2、引物对3、引物对4和引物对5的摩尔比为如下1)或2):1)(0. 3-0. 5) (0. 1-0. 3) (0. 5-0. 7) (0. 2-0. 4) (0. 2-0. 4)；优选摩尔比为 0. 4 0. 2 0. 6 0. 3 0. 3 ；2)0.4 0. 2 0. 6 0. 3 0. 3。
3.如权利要求1或2所述的引物组合物，其特征在于不同颜色荧光染料在每对引物的5’端进行标记；不同颜色荧光染料优选为红色、橙色、黄色、绿色或蓝色荧光染料，更优选是 FAM、HEX、TAMAR、TET 或 R0X。
4.如权利要求1-3中任一所述的引物组合物，其特征在于所述引物对1、引物对2、引物对3、引物对4和引物对5整体包装或均单独包装。
5.一种制备五色荧光矩阵标准物质的方法，其特征在于，包括如下步骤用权利要求1-4中任一所述的引物组合物中的引物对1、引物对2、引物对3、引物对4 和引物对5在PCR体系中一次扩增出序列表中序列1、序列2、序列3、序列4和序列5所示的5个DNA片段，得到五色荧光矩阵标准物质。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述PCR体系中的模板是9947ADNA。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于所述PCR体系中扩增条件是95°C预变性 IOmin ；95°C变性 30s，60°C退火 30s，72°C延伸 Imin, 35 个循环；最后 60°C延伸 60min。
8.权利要求5-7中任一所述的方法制备得到的五色荧光矩阵标准物质。
9.权利要求8所述的荧光矩阵标准物质在毛细管电泳的荧光校准中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种五色荧光矩阵标准物及其制备方法与专用引物组合物。本发明提供的引物组合物由不同颜色荧光染料标记过的如下5对引物组成由序列表中序列6所示的DNA和序列表中序列7所示的DNA组成的引物对1，由序列表中序列8所示的DNA和序列表中序列9所示的DNA组成的引物对2，由序列表中序列10所示的DNA和序列表中序列11所示的DNA组成的引物对3，由序列表中序列12所示的DNA和序列表中序列13所示的DNA组成的引物对4，由序列表中序列14所示的DNA和序列表中序列15所示的DNA组成的引物对5。上述5对引物制备得到的五色荧光标准物与传统的四色荧光矩阵标准物质相比，能够在一个反应体系内同时获得含有五种荧光产物的荧光标准物。
文档编号C12Q1/68GK102260671SQ20111020144
公开日2011年11月30日 申请日期2011年7月18日 优先权日2011年7月18日
发明者叶健, 赵兴春 申请人:公安部物证鉴定中心