专利名称：针对肝细胞核因子4a的RNA干扰序列及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于乙肝防治领域，具体涉及一种特异性针对肝细胞核因子4a的RNA干扰序列及其用途。
背景技术：
乙型肝炎病毒(HBV)感染是一个严重的全球性健康问题。据估计，约有3. 5亿人是慢性乙肝病毒携带者，易发展为肝衰竭，肝硬化和/或肝细胞癌(HCC) [1-3]。最近的研究表明，HBV复制活跃与疾病进展密切相关，尤其血清HBV DNA持续高水平增加了发生肝硬化和HCC的风险[4-7]。目前，已有两类认可的抗乙肝病毒药物，包括干扰素和核苷/核苷酸类似物，观察到用抗病毒药物控制HBV复制降低了发展为肝硬化和肝癌的风险。然而，对于大多数病人需要长期治疗，而且这些抗病毒治疗只对有限的患者有效。此外，干扰素有很多副作用，而核苷或核苷酸类似物在长期治疗后可能会导致病毒耐药性突变[8-12]。因此，目前还没有有效的药物根除乙肝病毒，其中一个原因是HBV持续感染和调控HBV复制的机制尚未完全阐明。因此，对HBV复制生命周期进行更多的研究是必要的。乙型肝炎病毒是一种包膜嗜肝病毒，在其核衣壳中包含一个3. 2kb的部分双链环状DNA基因组。该病毒基因组转录产生3. 5kb，2. 4kb，2. Ikb和0. 7kb的病毒mRNAs，在核衣壳内以3. 5kb前基因组mRNA为模版，利用病毒聚合酶逆转录合成HBV DNA复制中间体 [13]。因此，HBV 3. 5kb前基因组mRNA转录在HBV生命周期中有着关键作用。然而，病毒的复制和表达不仅受病毒本身调控，还受宿主各种因素的制约。以往的研究均表明，核激素受体(NRs)，特别是一些肝富集转录因子(LETFs)，如肝细胞核因子(HNF) 1，HNF3, HNF4，维甲酸X受体α (RXR α)，过氧化物酶体增殖物激活受体α (PPARa的)等，在HBV转录和复制中起关键作用[13-26]。NRs属于转录因子的一个超家族，具有相似的结构域，在其DNA结合区域具有高相似性序列，在调控胚胎发育、细胞分化和不同细胞功能中起重要作用[27-29]。HNF4是属于 NRs 2Α1亚家族，其中有三个亚型，HNF4 a , HNF4 β和HNF4 γ，也是核激素受体进化最保守的成员之一。HNF4ci在肝脏中含量丰富，不仅对于宿主而且对于许多嗜肝病原体的一系列肝脏特异性基因表达至关重要[13-14，19-21，30-31]。已发现HNF4a在HBV生命周期中起重要作用[14-19]。目前体外研究显示，HNF4ci能够在一系列非肝源细胞系中支持HBV前基因组RNA合成和病毒转录。这表明HNF4ci可能是乙肝病毒嗜肝性的决定性因素之一，并在调控HBV转录和复制中起关键作用[14]。其他一些研究表明，HNF4ci通过结合并反式激活三个核受体反应元件(NRREs)来调控HBV复制，这三个核受体反应元件已确定为HBV基因组的增强子 I (NRREenhI)、增强子 II (NRREenhII)和前 C 启动子(NRREpreC) [18，20-26]。 然而，这些结果都来自于体外研究。HNF4ci在体内调控HBV转录和复制的作用仍需要进一步的研究。由于HBV是一种嗜肝病毒，HNF4 α主要在肝脏中表达且在HBV转录复制中起关键作用，因此，如果在肝脏中抑制甚至敲除HNF4 α可能极大地抑制HBV的转录和复制。由此，我们可以验证HNF4ci在调控HBV的转录和复制中的重要作用，也可以找到一个抗HBV持续感染的药物新靶点。然而，以往有研究报道敲除HNF4 α可导致动物在胚胎早期死亡[32]。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是一种在体内体外广泛应用的特异性序列转录后基因沉默的新技术，在近年来发展迅速[33-36]。近来许多研究将HBV特异性小分子干扰RNA(siRNA)在HBV复制细胞或动物模型中直接靶向HBV基因来有效地抑制了 HBV的复制和表达[37-41]。但目前未见针对HNF4ci的RNAi的报道，且本领域目前需要开发HBV 治疗的新的有效药物。
发明内容
本发明要解决的技术问题是为抗HBV防治提供一种新的有效选择。本发明解决技术问题的技术方案是提供了一种针对肝细胞核因子4a的RNA干扰序列。该针对肝细胞核因子4a的RNA干扰序列针对的是由SEQ ID No. 1所示的靶点。其中，上述的针对肝细胞核因子4a的RNA干扰序列的为SEQ ID No. 2所示。SEQ ID No. 2是正义链，其反义链由SEQ ID No. 3所示。本发明还提供了一种表达载体。该表达载体能表达针对肝细胞核因子4a上的由 SEQ ID No. 1所示的靶点的RNA干扰序列。其中，所述的针对肝细胞核因子4a的RNA干扰序列是短发夹shRNA序列。其中，上述的针对肝细胞核因子4a的RNA干扰序列具有SEQ ID No. 2或其反义链 SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。进一步的，上述针对肝细胞核因子4a的RNA干扰序列的表达是在体内进行。其中，上述的表达载体为质粒。进一步的，上述的表达载体中表达针对肝细胞核因子4a的RNA干扰序列的表达框架的核苷酸序列为SEQ ID No. 4或其反义链SEQ ID No. 5所示。SEQ ID No. 4是正义链 (Top Strand Oligonucleotide Template)5' -GATCCCCACATGTACTCCTGCAGATTCA AGAGATCTGCAGGAGTACATGTGGTT A~3'表达框架的反义链(Bottom Strand Oligonucleotide Template)为 SEQ ID No. 5 所示5' -AGCTTAACCACATGTACTCCTGCAGATCTCTTGAATCTGCAGGAGTACATGTGGG-3'本发明上述载体可选择本领域常用的各种载体，只要能实现在体内表达上述的 RNA干扰序列的要求即可。本发明的实例主要是选用表达载体pSilenCer4. I-CMV puro质粒。其全长为 4781bp，可将本发明siRNA序列的表达框架接入位于pSilencer4. I-CMV puro的463-515 位点，即接入在BamH I及HindIII位点之间，由而CMV启动子启动表达。本发明还提供了上述的针对肝细胞核因子4a的RNA干扰序列或者上述的表达载体在制备抗乙肝病毒的药物中的用途。本发明也还提供了一种抗乙肝病毒的药物。该抗乙肝病毒的药物含有上述的针对肝细胞核因子4a的RNA干扰序列或者上述的表达载体。以其作为主要的活性活性成分。所述药物的能够通过现有的公知技术制备得到。本发明首次对HNF4ci在体内调控HBV转录和复制的作用和抑制HNF4 α的效果都用RNAi技术进行研究。本发明设计了 4个shRNA序列(参见表1)，并构建了四个HNF4 α特异性短发夹RNAs (shRNAs)表达质粒，但是其中只有一个(shRNAl)证明能有效抑制HNF4a 的表达且具有较好的安全性。在接下来的实验中显示HNF4a shRNAl降低HNF4a的表达与体内体外HBV转录和复制的抑制密切相关，HNF4 α可能在调控体内HBV转录、复制和表达中起关键作用，HNF4 α可能被用作抗HBV药物研究的靶标。本发明的有益效果在于本发明shRNA序列及其表达载体证明能有效地抑制体内 HBV转录和复制且在实验期内没有明显的副作用，为抗HBV提供了一种新的有效选择，在制备抗HBV药物中有很好的应用前景。
图1为用HNF4 a shRNA抑制H印G2细胞中HNF4 α的转录和表达。分别将构建的4 种HNF4 a shRNA表达质粒瞬时转染到H印G2细胞中，转染后3天从H印G2细胞中提取总RNA 和准备细胞裂解物。(A) RT-PCR分析H印G2细胞的HNF4 a mRNA。用β -actin作为RNA内参，M 标准品 Maker ；泳道 1 :HNF4 α shRNAl ；泳道 2 :HNF4 α shRNA2 ；泳道 3 :HNF4 α shRNA3 ； 泳道4 :HNF4 α shRNA4 ；泳道5 阴性shRNA ；泳道6 无shRNA对照。(B)检测H印G2细胞的 HNF4a蛋白表达。用SDS-PAGE分离总细胞细胞裂解液并用抗HNF4 α抗体进行Western印迹分析。泳道1-6与㈧相同。(C和D)定量分析HepG2细胞的HNF4 a mRNA转录和蛋白表达。HNF4 a mRNA和蛋白水平分别用β-actin mRNA和蛋白进行修正，且报道其相对于未转染shRNA的!fepG2细胞的结果(A和B，泳道6)。图2为HNF4 α shRNAl抑制HepG2细胞中HBV的转录和复制。仅瞬时转染了 PHBV4. 1 (泳道1)的!fepG2细胞作为HBV复制的阳性对照，未转染任何质粒的IfepG2 细胞作为空白对照(泳道2)，分别对!fepG2细胞瞬时转染pHBV4. l+pHNF4 α shRNAl、 pHBV4. l+pHNF4 α shRNA4、pHBV4. 1+pNegative control shRNA (泳道 3-5)。转染后 3 天，收集H印G2细胞，提取细胞总RNA和HBV复制中间体DNA。(A) Northern印迹分析HBV 3. 5和 2. 4/2. Ikb转录子。用GAPDH mRNA作为内参。(B) Southern印迹分析HBV复制中间体DNA0 (C)定量分析 3. 5-kb HBV RNA 和总 HBV DNA 复制中间体。3. 5_kb HBV mRNA 由 GAPDH mRNA 条带强度作为内参修正。3. 5-kb HBV mRNA和HBV DNA复制中间体均报道其相对于仅转染了 pHBV4. 1的H印G2细胞(A和B，泳道1)的结果。图3为HNF4 α shRNAl抑制小鼠肝脏中HBV复制。仅注射pHBV4. 1的BALB/ c小鼠(泳道1 3)作为HBV复制的阳性对照，用尾静脉高压注射法分别注射 pHBV4. l+pHNF4 α shRNAl、pHBV4. l+pHNF4 α shRNA4 及 pHBV4. 1+pNegative control shRNA 泳道7 9、10 12和13 15)到小鼠体内，仅注射正常生理盐水的小鼠作为空白对照(泳道4 6)。在共注射3天后处死小鼠，收集小鼠肝组织，提取组织总RNA和HBV复制中间体 DNA0 (A)Northern印迹分析小鼠肝组织中HBV 3. 5和2. 4/2. Ikb转录子。用GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)mRNA作为内参对每个泳道的RNA进行修正。(B) Southern印迹分析小鼠肝组织中HBV复制中间体DNA、HBV RC DNA (HBV环状DNA)、HBV SS DNA (HBV单链DNA)。 (C)定量分析 3. 5-kb HBV RNA 和 HBV DNA 复制中间体。3. 5_kb HBV mRNA 由 GAPDH mRNA 条带强度作为内参修正。3. 5-kb HBV mRNA和HBV DNA复制中间体均报道其相对于仅注射 T PHBV4. 1的小鼠(A和B，泳道1-3)的结果。图4表示HNF4 α shRNAl抑制小鼠肝组织中HNF4 α和HBcAg的表达。仅注射pHBV4. 1的BALB/c小鼠(图3，泳道1 3)作为HBV复制的阳性对照。用尾静脉脉高压注射法分别注射PHBV4. l+pHNF4 α shRNAl (图3，泳道7 9 ；图4A、C)、 pHBV4. l+pHNF4 α shRNA4 (图 3，泳道 10 12)及 pHBV4. 1+pNegative control shRNA (图 3，泳道13 15，图4A、C)到小鼠体内，仅注射正常生理盐水的小鼠作为空白对照(图3，泳道4 6)。HNF4ci和HBcAg的表达分别用免疫组织化学技术检测。A D:小鼠肝组织中 HNF4 α的免疫组化染色，HNF4 α表达着色弱阳性⑴㈧，强阳性(+++) (B D)。E H 小鼠肝组织中HBcAg的免疫组化染色，HBcAg表达着色弱阳性⑴(E)，强阳性(+++) (F G)， 及阴性(H)。HNF4ci和HBcAg的黄色或棕色信号定位在细胞核或胞浆(放大倍数X 400)
具体实施例方式以下通过具体实施方式
对本发明内容进行详细的说明。实施例一本发明干扰RNA序列的获得及其抗HBV的功效材料和方法1、质粒构建本发明用人类HNF4 α mRNA(GenBank登录号X87870)作为模版来设计shRNA目标序列。设计得到了四对靶向HNF4a (shRNAl、shRNA2、shRNA3、shRNA4，参见表一)的干扰序列，并设计得到了开放阅读框保守序列的片段(每个55bp，由Invitrogen公司合成，其设计均参见SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5)并分别克隆到pSilencer 4. 1-CMV puro载体的 BamHI和HindIII位点之间。 表一设计的肝细胞核因子4a RNA干扰序列
权利要求
1.针对肝细胞核因子4a的RNA干扰序列，其特征在于所述的肝细胞核因子4aRNA干扰序列针对的是由SEQ ID No. 1所示的靶点。
2.根据权利要求1所述的针对肝细胞核因子4a的RNA干扰序列，其特征在于所述的肝细胞核因子4a RNA干扰序列具有SEQ ID No. 2或其反义链SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列。
3.表达载体，其特征在于能表达针对肝细胞核因子4a上的由SEQID No. 1所示的靶点的RNA干扰序列。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于所述的针对肝细胞核因子4a的RNA 干扰序列具有SEQ ID No. 2或其反义链SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求3或4所述的表达载体，其特征在于所述的表达载体为质粒。
6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于所述的质粒中表达针对肝细胞核因子4a的RNA干扰序列的表达框架的核苷酸序列为SEQ ID No. 4或其反义链SEQ ID No. 5 所示。
7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于所述的表达载体为 pSilencer4. I-CMV puro。
8.权利要求1或2所述的针对肝细胞核因子4a的RNA干扰序列或者权利要求3 7 任一项所述的表达载体在制备抗乙肝病毒的药物中的用途。
9.抗乙肝病毒的药物，其特征在于含有权利要求1或2所述的针对肝细胞核因子4a 的RNA干扰序列或者权利要求3 7任一项所述的表达载体。
全文摘要
本发明属于乙肝防治领域，具体涉及一种对乙肝病毒复制具有抑制作用的肝细胞核因子4a特异性短发夹RNA及其用途。本发明要解决的技术问题是为抗HBV治疗提供一种新的有效选择。本发明解决技术问题的技术方案是提供了一种针对肝细胞核因子4a特异性短发夹RNA及能表达该序列的载体。本发明shRNA序列及其表达载体证明能有效地抑制体内HBV转录和复制且没有明显的副作用，为抗HBV提供了一种新的有效选择，在制备抗HBV药物中有很好的应用前景。
文档编号C12N15/113GK102304515SQ201110231219
公开日2012年1月4日 申请日期2011年8月12日 优先权日2011年8月10日
发明者何芳, 刘丽, 刘聪, 周陶友, 唐红, 白浪, 程星, 陈恩强 申请人:四川大学华西医院