专利名称：固定化漆酶及其制备方法
技术领域：
本发明涉及酶的固定化领域，具体涉及一种固定化漆酶及其制备方法。
背景技术：
漆酶(laccase，Ε. C. 1. 10. 3. 2)是一种含铜多酚氧化酶，广泛存在于真菌、细菌和植物中。漆酶具有较广泛的底物专一性和较强的稳定性，能催化许多酚类和芳香胺类物质， 如苯酚、对氯苯酚、苯胺以及多酚和多胺类物质，因而在生物传感器、生物燃料电池、生物转化及废水处理等领域具有广泛应用。但由于漆酶易溶于水，在水中游离的漆酶不可回收也不能长期保存，且在高温或其他极端环境下漆酶的稳定性不易保持，因而限制了漆酶的实际应用。固定化技术在保持游离漆酶的专一、高效的催化活性的同时，更是提高漆酶重复利用性、操控性和稳定性的有效手段，常用的固定化载体包括活性炭、壳聚糖、多孔硅胶以及微滤膜等多种材料，但现有的固定化材料存在固定化效率低、加工工艺复杂、分离困难以及操作性不高等缺陷。新型介孔材料由于具有纳米规整的有序孔道结构、巨大的比表面积及孔容等特征，在生物催化和分离领域，尤其是在作为酶固定化载体的研究和应用上显示了极大潜力。 有文献报道，用大孔径的磁性介孔硅固定漆酶，固定化酶的活性回收率较高，且提高了漆酶的PH稳定性和热稳定性(Yufang Zhu et al,Chemistry of Materials，2007，6408-6413)， 但该类介孔材料具有制备过程繁琐、难以分离等缺点。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种具有大比表面积和二级介孔结构的磁性介孔碳材料固定的且具有优异酶学性能的固定化漆酶，以及相应提供该固定化漆酶的制备方法。为解决上述问题，本发明采用以下技术方案一种固定化漆酶，其以磁性介孔碳为载体，漆酶通过物理吸附作用固定于所述磁性介孔碳上，所述磁性介孔碳的孔道内嵌入有磁性纳米颗粒，所述磁性介孔碳上的漆酶吸附量在140mg/g以上，所述固定化漆酶的酶活性回收率为60% 95% (优选的技术方案可达75% 95% )。作为对上述的固定化漆酶的优化，所述的磁性介孔碳与漆酶的质量配比为 1 (1 2. 5)。作为对上述的固定化漆酶的优化，所述磁性介孔碳含有有序双峰介孔结构。优选的，该有序双峰介孔结构是指磁性介孔碳孔径分布的两个峰值分别出现在4nm附近区域和 ISnm附近区域。4nm附近区域特别是指孔径主要集中分布在4nm 5nm的孔径范围内，18nm 附近区域特别是指孔径主要集中分布在14nm ISnm的孔径范围内。作为一个总的发明构思，本发明还提供上述的固定化漆酶的制备方法，包括以下步骤先准备磁性介孔碳和漆酶溶液，所述漆酶溶液中漆酶的初始浓度为0. 3mg/ml 1. Omg/ml，所述漆酶溶液的pH值为3. 0 6. 0 ；然后将磁性介孔碳加入至所述漆酶溶液中，在25V 30°C的温度下对混合溶液振荡池以上；再经过洗涤、磁性分离、冷冻和真空干燥后，得到固定化漆酶。上述的制备方法中，优选地，所述漆酶溶液是由漆酶与柠檬酸缓冲液或磷酸缓冲液配制而成，所述柠檬酸缓冲液的PH值为3. 5 4. 0，所述磷酸缓冲液的pH值为4. 5 5 · 5 ο作为对上述的制备方法的优化，所述振荡的转速为IOOrpm 120rpm，所述振荡的时间为3h 7h。作为对上述的制备方法的优化，所述磁性介孔碳通过以下方法制得(1)先将嵌段共聚物(模板剂)与正硅酸乙酯在30°C 35°C的温度下混合搅拌 20h Mh，再将混合液转移至135°C 140°C下水热反应2 Mh，得到白色沉淀，将所述白色沉淀洗涤至中性后过滤、干燥，得到白色粉末；(2)将上述得到的白色粉末在500°C 550°C的温度下煅烧4h ^后(模板剂嵌段共聚物被脱除)得到介孔硅模板；(3)利用初湿浸渍法将由金属硝酸盐、乙醇和糠醇组成的多元溶液渗透到所述介孔硅模板中，然后在70°C 80°C的空气中对渗透有多元溶液的介孔硅模板固化IOh 12h， 干燥后得到复合物；(4)将所述步骤(3)得到的复合物在N2中于800°C 900°C的温度下热处理Ih 池，然后用加热至80°C 90°C的氢氧化钠溶液洗涤移除复合物中的硅模板，再对移除硅模板后的复合物过滤、清洗和干燥，得到磁性介孔碳。上述的制备方法中，优选地，所述金属硝酸盐是指摩尔比为1 (1 11)的 Fe (NO3) 3 与 Ni (NO3) 2 的混合物。上述的制备方法中，优选地，所述漆酶溶液中漆酶的初始浓度为O.^ig/ml或 1. Omg/ml，所述漆酶溶液的pH值为4. 0，所述振荡的转速为IOOrpm，所述振荡的时间为3h。本发明的固定化漆酶的制备方法中，漆酶的固定化时间，漆酶溶液的pH值，以及漆酶溶液中的漆酶初始浓度对固定化漆酶的制备有着重要的影响，我们以不同固定化条件下的载体吸附酶量和固定化酶活性作为确定标准，通过以下实验得到本发明的固定化漆酶的制备方法中的工艺参数。1.固定化时间范围的确定取40mg磁性介孔碳作为载体，加入IOOmL装有40mg漆酶的磷酸缓冲液中(浓度为50mM，pH值为4. 0)，于30°C下以IOOrpm的速度振荡15min 420min，磁性分离后用缓冲液清洗数次；用福林酚试剂法(lowry法)分别测定固定前缓冲溶液中漆酶量及固定后缓冲液中剩余的漆酶量，计算不同时间内单位载体吸附的漆酶量，得到的结果如表1所示；由表 1可知，单位载体吸附漆酶量随时间增长不断增高，但在池后吸附漆酶量达到平衡，因此， 适宜的固定化时间范围为池以上；考虑到随着时间延长，漆酶活损失增加，因此，上述技术方案中确定的优选振荡固化时间为池 7h，最佳的固定化时间为池。表1 不同振荡时间下载体吸附漆酶量
权利要求
1.一种固定化漆酶，其特征在于所述固定化漆酶以磁性介孔碳为载体，漆酶通过物理吸附作用固定于所述磁性介孔碳上，所述磁性介孔碳的孔道内嵌入有磁性纳米颗粒，所述磁性介孔碳上的漆酶吸附量在140mg/g以上，所述固定化漆酶的酶活性回收率为60% 95%。
2.根据权利要求1所述的固定化漆酶，其特征在于所述的磁性介孔碳与漆酶的质量配比为1 (1 2. 5)。
3.根据权利要求1或2所述的固定化漆酶，其特征在于所述磁性介孔碳含有有序双峰介孔结构。
4.根据权利要求3所述的固定化漆酶，其特征在于所述有序双峰介孔结构是指孔径分布的两个峰值分别出现在4nm附近区域和18nm附近区域。
5.一种如权利要求1 4中任一项所述的固定化漆酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤先准备磁性介孔碳和漆酶溶液，所述漆酶溶液中漆酶的初始浓度为0. 3mg/ml 1. Omg/ml，所述漆酶溶液的pH值为3. O 6. O ；然后将磁性介孔碳加入至所述漆酶溶液中， 在25°C 30°C的温度下对该溶液振荡池以上；再经过洗涤、磁性分离、冷冻和真空干燥后， 得到固定化漆酶。
6.根据权利要求5所述的固定化漆酶的制备方法，其特征在于所述漆酶溶液是由漆酶与柠檬酸缓冲液或磷酸缓冲液配制而成，所述柠檬酸缓冲液的PH值为3. 5 4. 0，所述磷酸缓冲液的PH值为4. 5 5. 5。
7.根据权利要求5或6所述的固定化漆酶的制备方法，其特征在于所述振荡的转速为IOOrpm 120rpm，所述振荡的时间为汕 讣。
8.根据权利要求5或6所述的固定化漆酶的制备方法，其特征在于，所述磁性介孔碳通过以下方法制得(1)先将嵌段共聚物与正硅酸乙酯在30°C 35°C的温度下混合搅拌20h Mh，再将混合液转移至135°C 140°C下水热反应2 Mh，得到白色沉淀，将所述白色沉淀洗涤至中性后过滤、干燥，得到白色粉末；(2)将上述得到的白色粉末在500°C 550°C的温度下煅烧4h 证后得到介孔硅模板；(3)利用初湿浸渍法将由金属硝酸盐、乙醇和糠醇组成的多元溶液渗透到所述介孔硅模板中，然后在70°C 80°C的空气中对渗透有多元溶液的介孔硅模板固化IOh 12h，干燥后得到复合物；(4)将所述步骤(3)得到的复合物在N2中于800°C 900°C的温度下热处理Ih 2h， 然后用加热至80°C 90°C的氢氧化钠溶液洗涤移除复合物中的硅模板，再经过滤、清洗和干燥，得到磁性介孔碳。
9.根据权利要求8所述的固定化漆酶的制备方法，其特征在于所述金属硝酸盐是指摩尔比为1 (1 1. 1)的Fe (NO3) 3与Ni (NO3) 2的混合物。
10.根据权利要求9所述的固定化漆酶的制备方法，其特征在于所述漆酶溶液中漆酶的初始浓度为0. 4mg/ml或1. Omg/ml，所述漆酶溶液的pH值为4. 0，所述振荡的转速为 lOOrpm，所述振荡的时间为池。
全文摘要
本发明公开了一种固定化漆酶，其以磁性介孔碳为载体，漆酶通过物理吸附作用固定于磁性介孔碳上，磁性介孔碳的孔道内嵌入有磁性纳米颗粒，磁性介孔碳上的漆酶吸附量在140mg/g以上，固定化漆酶的酶活性回收率为60％～95％；本发明相应公开了该固定化漆酶的制备方法，包括以下步骤先准备磁性介孔碳和漆酶溶液，漆酶溶液的浓度为0.3～1.0mg/ml，漆酶溶液的pH值为3.0～6.0；然后将磁性介孔碳加入至漆酶溶液中，在25℃～30℃的温度下对该溶液振荡3h以上；经过后续处理得到固定化漆酶；本发明的固定化漆酶基于磁性介孔碳固定漆酶，使得漆酶具有优异酶学性能；本发明的固定化漆酶的制备方法，操作简单，成本低廉。
文档编号C12N11/14GK102286455SQ20111024718
公开日2011年12月21日 申请日期2011年8月26日 优先权日2011年8月26日
发明者伍梦诗, 刘媛媛, 危臻, 庞娅, 曾光明, 李贞 , 汤琳, 雷晓霞 申请人:湖南大学