专利名称：DNA重组酶Cre基因的改造、重组蛋白表达方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程，具体地说，涉及Cre重组酶突变体的构建及在胰岛beta细胞标记中的应用。
背景技术：
成年胰腺中存在一种自发的再生现象。研究发现，胰腺beta细胞在正常生理状态下，不断进行着低水平分裂和死亡。在一些特殊生理(如肥胖、妊娠、胰岛素阻抗)和病理 (如胰腺损伤、毒素作用)压力下，胰腺细胞包括beta细胞都会有一定程度的再生。通过研究各种胰腺再生动物模型(如注射连脲霉素、胰管结扎、胰腺部分切除)，一些观点认为新生的beta细胞由胰腺祖细胞分裂分化而来。这一结论与形态学上的研究相一致，许多新生的胰岛或胰岛素阳性细胞与胰管结构密切相关，因此，一部分胰管细胞有可能是腺祖细胞。然而，另外一些研究，利用可诱导的Cre-1oxP系统，特异性地将beta细胞标记上碱性磷酸酶。 这些谱系追踪研究表明新生beta细胞是从已有的beta细胞通过分裂而形成的。目前在新生beta细胞的来源及其再生机制上都有严重分歧，很大部分原因是目前的细胞标记技术可能存在一些缺陷，从而也就无法确定beta细胞再生的来源。
目前已建立了多种细胞标记与追踪技术，如荧光染料PKH26和Dil可以通过疏水作用插入到细胞膜的脂双层，实现对细胞膜的标记；核苷类似物5-溴脱氧尿嘧啶核苷 (BrdU)，可以插入分裂细胞的基因组，然后通过抗BrdU抗体加以检测；报告基因GFP、β半乳糖苷酶、荧光素酶等被广泛应用于细胞标记。为实现对细胞的永久性标记则需要改变基因组的结构，如利用慢病毒将报告基因插入染色体。目前最常见的是利用Cre-1oxP系统进行永久性基因组DNA改变，并实现细胞的标记。
Cre是一种来源于卩遼菌体Pl的重组酶,其名称来源于Causes of recombination, 属于λ整合酶超基因 家族。Cre基因的表达产物为343个氨基酸的单聚体蛋白，分子量为 38kDa,能对两个特异位点(IoxP)之间的DNA序列进行重组。整合酶家族重组酶的共同特点是这些酶均由单个多肽构成，作用于核苷酸序列时，不需要其它辅助因子的参与，也不额外消耗能量。
LoxP (locus of X-over Pl)序列来源于Pl卩遼菌体，由两个13bp反向重复序列和 8bp中间间隔序列共同组成，8bp的间隔序列同时也确定了 LoxP的方向。Cre在催化DNA链交换过程中与DNA共价结合，13bp的反向重复序列是Cre酶的结合域。其序列如下5’ - ATAACTTCGTATA - ATGTATGC - TATACGAAGTTAT - 3’3’ - TATTGAAGCATAT - TACATACG - ATATGCTTCAATA - 5’两个LoxP之间的方向和位置可以决定重组后的三种结果删除、翻转、或整合。如果两个Loxp位点同向且位于一条DNA链上，那么Cre重组酶将切除它们之间的序列；如果这两个Loxp位点反向位于一条DNA链上,它们之间的序列方向发生倒转；如果LoxP位点位于不同的DNA链，两条DNA链将通过LoxP位点进行整合。
在胰腺发育研究中，Melton实验室采用基于Cre-1oxP重组系统的转基因小鼠以标记胰岛beta细胞。这个系统需要构建两个品系转基因小鼠，一个携带了融合了突变型雌激素受体(ER)的重组酶CreER，由胰岛素启动子控制其表达，在没有诱导物时，重组酶定位在胞衆中，如加入Tamoxifen, CreER则进入细胞核；另一个品系携带由组成型启动子(CMV) 控制的一段终止序列和报告基因，在终止序列前后有两个同向IoxP位点。在无Cre酶存在的情况下，报告基因因终止序列的存在而不能表达。当两个品系的小鼠杂交，其后代小鼠的 beta细胞表达重组酶CreER,在诱导物Tamoxifen的作用下，CreER进入细胞核，并切除两个IoxP位点之间的终止序列，报告基因得以表达，实现beta的永久标记，即无论被标记的 beta细胞表型如何变化，报告基因始终表达。Melton研究组利用该项技术发现，生理条件下及病理条件下新产生的beta细胞来自已有的beta细胞的分裂，而不是来自胰腺干细胞的分化。
但是这个系统有几项缺陷，一是对实验条件要求高，需要构建两个转基因小鼠品系；二是只能实现一种细胞的标记，如前述实验中只标记胰岛素阳性细胞，而不标记胰岛素阴性细胞，因而无法直接地明确回答新生beta细胞是否也有来自胰腺干细胞的分化；三是CreER的诱导并非绝对特异，即在没有加入诱导物时，也会有少量的重组酶进入细胞核， 这也许是其他研究组利用同样的技术却得到不同的结论的原因；四是RIP的组织特异性在 Cre酶的放大作用下有所减弱，详细情况将在后面实验部分叙述。
由于目前的的Cre-LoxP系统在进行组织特异性标记时(如胰岛beta细胞)，具有费时费力，及产生非特异性等特点，因此，本发明旨在通过改造Cre重组酶，增强RIP的组织特异性，并构建一个双质粒的胰岛素阳性细胞的标记系统。发明内容
为解决现有技术的不足之处，本发明的目的在于构建一种酶活性减弱的Cre突变体，从而提高RIP的组织特异性。本发明的另一个目的是提供上述酶活性减弱的Cre突变体的构建方法。本发明的第三个目的是提供DNA重组酶活力减弱的重组蛋白的应用。
本发明的目的是通过如下途径实现的通过PCR技术，对DNA重组酶Cre的基因进行改造，即将其173位点的精氨酸改变为组氨酸，获得Cre (R173H)。
本发明对DNA重组酶Cre的基因进行改造，其所述Cre (R173H)突变体173位点组氨酸的核苷酸序列为CGT。
本发明对DNA重组酶Cre的基因进行改造，按如下步骤进行i·根据Cre重组酶173位点的核苷酸序列合成两条单链寡核苷酸作为PCR用引物，ii·以 pRIP-Cre 为模板，PCR 采用 TAKARA 试剂盒 PrimStar Mix ；ii1.将PCR产物自连，转染感受态菌株T0P10，扩增并提取质粒，获得点突变的 pRIP-Cre (R173H);经测序鉴定后转染胰岛beta细胞NIT-1。
本发明对DNA重组酶Cre进行二次基因改造，其特征在于所述点突变PCR引物核苷酸序列为前引物 5' -AACACCCTGTTACATATAGCCGAAATT-3'，后引物 5' -ATAAGCAATCCCCAGAAATGCCA-3'本发明进一步提供用作细胞标记的报告载体。
具体地，本发明提供一个选择性表达报告基因DsRed或EGFP的载体。其特征在于包括如下步骤采用限制性酶切技术分别获得CMV启动子、dsRed和EGFP序列元件；通过寡聚核苷酸合成Cre酶的作用位点IoxP ;采用亚克隆技术将上述各元件组装成一个细胞标记载体，所述载体具有如下顺序排列的原件CMV-loxP2-DsRed-loxP-EGFP。
进一步地，本发明将上述胰岛细胞标记系统，即pRIP-Cre (R173H)和 pCMV-loxP-DsRed-loxP-EGFP,转入Ad293和NIT-1细胞，48小时后检测细胞标记情况。经荧光显微镜检测，约30%的Ad293细胞呈现红色荧光，无细胞呈现绿色荧光；约10%的NIT-1 细胞呈现红色荧光，其中的50%的细胞还同时呈现绿色荧光。上述结果证实胰岛细胞标记质粒有效地标记了胰岛素阳性细胞，即NIT-1细胞，但不标记胰岛素阴性细胞，即Ad293细胞。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果将pRIP-Cre和 pCMV-loxP-DsRed-loxP-EGFP转入Ad293细胞，48小时后呈现绿色荧光的细胞约占呈现红色荧光的细胞的40%。因此，本发明首次在真核细胞中采用双质粒实现胰岛素阳性细胞的标记与追踪，为研究胰岛发育与beta细胞特异性基因治疗方案的研制奠定了基础。
图1为本发明DNA重组酶Cre突变体Cre(R173H)的构建方案图。
图2为本发明点突变PCR电泳鉴定结果图。
图3为本发明pCMV-loxP-DsRed-loxP-EGFP的构建方案图。
图4为本发明pCMV-loxP-DsRed-loxP-EGFP的电泳鉴定结果图。
图5 为本发明用 pRIP-Cre 与 pCMV-loxP-DsRed/loxP-EGFP 共转染 Ad293 和 NIT-1 细胞细胞48小时后的荧光鉴定图。a: Ad293细胞红色荧光照片；b: Ad293细胞绿色荧光照片；c: NIT-1细胞红色荧光照片；d: NIT-1细胞绿色荧光照片。
图6 为本发明用 pRIP-Cre 与 pCMV-DsRed/IoxP2-EGFP 共转染 Ad293 和 NIT-1 细胞48小时后的EGFP阳性细胞与DsRed阳性细胞的比例统计鉴定 7 为本发明用 pRIP-Cre (R173H)与 pCMV-loxP-DsRed/loxP-EGFP 共转染 Ad293 和NIT-1细胞细胞48小时后的荧光鉴定图。a: Ad293细胞红色荧光照片；b: Ad293细胞绿色荧光照片；c: NIT-1细胞红色荧光照片；d: NIT-1细胞绿色荧光照片。
图8 为本发明用 pRIP-Cre (R173H)与 pCMV-DsRed/IoxP2-EGFP 共转染 Ad293 和 NIT-1细胞48小时后的EGFP阳性细胞与DsRed阳性细胞的比例统计鉴定图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1 Cre突变体的构建。
通过PCR进行Cre的点突变，在后引物中将173位精氨酸的密码子替换为组氨酸的密码子，以pRIP-Cre质粒为模板，进行全长质粒的PCR扩增，得到的产物经DpnI消化去除作为底物的PRIP-Cre质粒，PCR产物自连后，转化E. coli T0P10 (天根公司)感受态细胞，挑取单克隆接种含有抗生素的LB培养基，37° C振荡培养12小时，质粒提取后经测序鉴定，选取正确pRIP-Cre (R173H)。所述点突变PCR引物核苷酸序列为前引物 5' -AACACCCTGTTACATATAGCCGAAATT-3'，后引物 5' -ATAAGCAATCCCCAGAAATGCCA-3'所述点突变PCR扩增体系为模板(pRIP-Cre) 前引物(10 μΜ) 后引物(10 μΜ)50 ng2x Master Mix ddH2025 μ I 补至50 μ所述点突变PCR扩增条件为94 °C94 °C55 °C72 °C72 °C 3 min (40个循环) 30 s (40个循环) 30 s (40个循环)60 s 5 min hold实施例2用作细胞标记的报告载体的构建。
利用限制性内切酶PacI 和 MluI 切除 pCMV-DsRed-H19-RIP/LoxP2_EGFP (本实验室已构建)中的H19-RIP的片段，利用NEB公司的T4聚合酶补平末端，然后使载体自连，连接产物转化E. coli T0P10 (天根公司)感受态细胞，挑取单克隆接种含有抗生素的LB培养基，于37° C振荡培养12小时，质粒提取后经测序鉴定，选取正确报告载体，即 pCMV-loxP-DsRed-loxP-EGFP。
实施例3胰岛素阳性细胞标记载体的功能验证。
转染前一天接种Ad293和NIT-1细胞，约16_20小时细胞约铺满培养板的70 %面积，且细胞处于对数生长期。于一个0.5 ml离心管中加入0.5 yg的 pRIP-Cre 和 pCMV-loxP-DsRed-loxP-EGFP，或加入 0. 5 yg 的 pRIP-Cre (R173H)和 pCMV-loxP-DsRed-loxP-EGFP,加入无血清培养液将总体积补足至30 μ 1，混匀，加入2. 5 μ I的lipsome。混匀，室温静置5-10分钟，吸去培养板细胞中的培养液，向DNA-1ipsome 复合物中加入100 μ I完全培养液，混匀，马上加入到细胞。细胞在正常生长条件下培养48 小时，然后于荧光显微镜下观察并统计呈现红色荧光及绿色荧光的细胞比例。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的，因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
<110〉汕头大学
<120> DNA重组酶Cre突变体的构建及应用<130>26<140>2<150>Patent In Version 3.2<210>1<211>5779
权利要求
1.一种DNA重组酶活力减弱的重组蛋白，其特征在于所述重组蛋白是对DNA酶重组酶Cre的氨基酸序列进行改造，将其173位点的精氨酸改造成组氨酸。
2.根据权利要求1所述的DNA重组酶活力减弱的重组蛋白，其特征在于所述重组蛋白173位点组氨酸的核苷酸序列为CGT。
3.根据权利要求2所述的DNA重组酶活力减弱的重组蛋白的表达方法，其特征在于按如下步骤进行i ·根据Cre重组酶173位点的核苷酸序列合成两条单链寡核苷酸作为PCR用引物， 以pRIP-Cre为模板； ·将PCR产物自连，转染感受态菌株Τ0Ρ10，扩增并提取质粒，获得点突变的 pRIP-Cre (R173H)；ii1.经测序鉴定后转染胰岛beta细胞NIT-1。
4.根据权利要求3所述的DNA重组酶活力减弱的重组蛋白的表达方法，其特征在于 所述点突变PCR引物核苷酸序列为前引物 5' -AACACCCTGTTACATATAGCCGAAATT-3'，后引物 5' -ATAAGCAATCCCCAGAAATGCCA-3'。
5.权利要求3所述的DNA重组酶活力减弱的重组蛋白在胰岛beta细胞标记中的应用。
全文摘要
本发明涉及DNA重组酶Cre氨基酸序列的改造和应用，其是通过点突变技术将Cre基因第173位的精氨酸改变为组氨酸，上述Cre突变体由一个大鼠胰岛素启动子(RIP)控制其在胰岛beta细胞中的表达。另外，本发明对Cre突变体在胰岛beta标记中的应用进行了初步研究，利用Cre突变体及其作用位点loxP、CMV启动子、绿色荧光报告基因(EGFP)、及红色荧光报告基因(DsRed)，组装成一个双质粒的胰岛素阳性细胞的标记系统。
文档编号C12N15/63GK103013934SQ201110297620
公开日2013年4月3日 申请日期2011年9月27日 优先权日2011年9月27日
发明者魏炽炬, 范文竹, 李迪峥 申请人:汕头大学