专利名称：一种苯酚降解菌及其转化吲哚制备靛蓝的方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及利用一种野生型苯酚降解菌转化吲哚制备靛蓝的方法。
背景技术：
靛蓝是一种广泛用于食品、医药、印染和化妆品等行业的古老色素，其化学合成的合成原料、催化剂、中间产物等均具有一定的毒性，给人和环境造成危害。1983年Ensley等人开始采用生物法合成靛蓝，1986年Mermod N等将降解甲苯、二甲苯或甲苯其他衍生物的Pseudomonas putida mt_2的TOL质粒pffffO克隆到Escherichiacoli K-12，获得的基因工程菌能催化吲哚直接生成3-羟基吲哚从而生成靛蓝。利用野生菌合成靛蓝的报道较少，1997年Doukyu等利用假单胞菌ST-200的加氧酶在两相系统中进行生物合成靛蓝，当加入体积分数为20%的二苯甲烷时，假单胞菌对吲哚的最大耐受量为4 mg/mL，靛蓝的生成量仅为5μ8/ιΛ;1997年Allen CCR等发现Rhodococcus sp. NCIMB 12038也能利用某种酶(可能是单加氧酶)催化卩引哚合成靛蓝，文中主要探讨了菌株NCMB12038合成靛蓝的独特现象和其可能的靛蓝合成机制，没有提到靛蓝的产量产率等问题。现有的关于制备靛蓝的研究，涉及的酶资源较为单一，主要集中在萘双加氧酶、甲苯双加氧酶、苯乙烯单加氧酶和P450酶等，而且实际应用研究有限；大多数的研究都是利用基因工程技术调取相关合成基因进行重组，构建工程菌，关于利用野生型菌株合成靛蓝的研究较少，忽视了自然界原生菌株合成靛蓝的优势。
发明内容
本发明的目的，是提供一种降解苯酚的野生菌，以及采用该苯酚降解菌转化吲哚得到靛蓝类色素物质的方法，实现生物法制备靛蓝，产物浓度较高。本发明的目的是通过以下方式实现的。一种能有效催化吲哚合成靛蓝的苯酚降解微生物菌株，它是蒙氏假单胞菌QM(Pseudomonas monteilii QM)，保藏编号为 CGMCC No. 5054。用苯酹降解菌Pseudomonas monteilii QM催化卩引哚合成靛蓝的方法,其特征在于包含以下步骤(I)利用苯酌·诱导Pseudomonas monteilii QM菌在培养基中生长10 14小时至对数末期，然后离心分离，经PH值为7. O 7. 5、浓度为O.1 O. 2mol/L的磷酸缓冲液洗涤制备菌悬浮；(2)在菌悬液中加入吲哚(吲哚用丙酮溶解)进行生物转化以制备靛蓝，生物转化反应时，反应液中Pseudomonas monteilii QM菌的细胞干重浓度为O.1 10g/L,卩引哚浓度为25 200mg/L，在20 40°C温度下，控制摇床转速在50 300r/min，振荡反应I 8小时。
上述生物转化反应的最佳参数为Pseudomonas monteilii QM菌的细胞干重浓度为4. O 8. Og/L,吲哚浓度为25 75mg/L，温度为25 35°C，摇床转速为150 200r/min，振荡反应时间为3 5小时。Pseudomonas monteilii QM菌是用浓度梯度法从大连理工大学校园土壤样品中分离筛选获得的。采集土壤样品后，在富集培养基中富集培养，然后再转到以苯酚为唯一碳源的培养基中驯化。通过逐步减少培养基的营养成分直至混合菌液可以以苯酚为唯一的碳源生长，反复进行平板涂布，最终分离得到能以苯酚为唯一碳源生长的蒙氏假单胞菌；在该菌株的菌液中加入吲哚，它能将吲哚转化生成靛蓝。该野生菌适宜在中性及偏碱性(pH 7. O 8.0)的培养介质中生长，适合生长温度为30 35°C，能在多种培养基上生长(如M9培养基、富集培养基、无机盐培养基)，在固体培养基上呈无色透明的圆形小点，表面光滑，边缘整齐，易挑起。细菌学形态特征革兰氏阴性杆菌，无鞭毛，大小约为(O. 3-0. 5) ymX (1-3) μ m。通过扩增该菌株的16S rDNA，得到了长度为1451bp的16S rDNA全序列。应用NCBI数据库中的BLAST进行相似性分析，结果表明该菌株的16S rDNA序列与GenBank中Pseudomonas monteilii的很多菌株序列相似性高达99%,确定该菌株属于蒙氏假单胞菌,命名为Pseudomonas monteilii QM,其保藏号为CGMCC NO. 5054。生物转化反应前的菌株扩大培养按下述条件进行首先将菌株QM接种到固体培养基(酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L、琼脂15_20g/L，调pH至7. O 7. 2)上培养，即平板活化种子，再将其接种到液体M9培养基(Na2HPO4 · 12H20 17. lg/L、KH2PO4 3. 0g/L、NH4Cl1. 0g/L、NaCl 0.5g/L、FeCl3 0. 00075g/L、lg/L 葡萄糖，2mmol/L MgS04)中，在 20 40 °C, 50 300r/min条件下振荡培养12 16小时，制得种子培养液；然后按体积百分比I 2%的接种量接入液体M9培养基中(添加100 200mg/L的苯酚作诱导剂)振荡培养，待菌体生长10 14小时进入对数末期，离心收集菌体，经pH值为7. O 7. 5、浓度为0.1
0.2mol/L的磷酸缓冲液洗涤，然后用相同缓冲液悬浮，使其浓度达到0.1 10g/L(换算成干重)。其中细胞干重按离心法测定将待测培养液放入离心管中，反复作离心、清水洗涤三次后，进行105°C干燥12小时,然后称重。制备种液过程也可以采用富集培养基(酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L，调pH 至 7. O 7. 2)或无机盐培养基((NH4)2SO4 2g/L、KH2PO41. 3g/L，、Na2HPO4 · 12H20 2g/L、苯酌· lOOmg/L)。本发明的苯酚降解菌对吲哚的转化能力较强，且具有广泛的底物广谱性，能转化一系列的吲哚衍生物合成相应的色素。本发明的苯酚降解菌生物转化吲哚生成靛蓝的方法反应条件温和，环境污染小，产物浓度高，可达到42. 5mg/L,生产周期短，成本低，提取步骤简单，生产清洁，适合工业生产和应用。
图1为生物转化反应选定其他参数时,靛蓝浓度随Pseudomonas monteiliiQM菌的细胞干重浓度变化的曲线。图2为生物转化反应选定其他参数时，靛蓝浓度随反应时间变化的曲线。
图3为生物转化反应选定其他参数时，靛蓝浓度随吲哚浓度变化的曲线。本发明涉及的苯酚降解菌的生物保藏信息保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路I号院3号、中国科学院微生物研究所，日期为 2011年 7 月 12 日，编号 CGMCC NO. 5054，分类命名为Pseudomonas monteilii。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例1,采用苯酹降解菌Pseudomonas monteilii QM生物转化卩引哚生产靛蓝，并考察部分参数对靛蓝浓度的影响。苯酹降解菌Pseudomonas monteilii QM的扩大培养和生物转化卩引哚生产靛蓝的步骤和参数如下1、将苯酌·降解菌Pseudomonas monteilii QM菌株接种到固体平板LB培养基(酵母粉 5g/L、蛋白胨 10g/L、NaCl 5g/L、琼脂 15_20g/L，调 pH 至 7. O 7. 2)上，于 37°C静置培养2天，4°C冰箱保存，作为平板活化种子；2、用步骤I所得的平板活化种子，接种到液体M9培养基中(Na2HPO4 · 12H20 17.1g/L、KH2PO4 3. 0g/L、NH4Cl1. 0g/L、NaCl 0. 5g/L、FeCl3 0. 00075g/L、lg/L 葡萄糖，2mmol/LMgS04)，在20 40°C，50 300r/min条件下振荡培养12 16小时，制得种子培养液；该步骤也可以采用富集培养基(酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L)或无机盐培养基((NH4)2SO4 2g/L、KH2PO41. 3g/L，、Na2HPO4 · 12H20 2g/L、苯酚 lOOmg/L)制备种子培养液。3、使用步骤2所得的种子培养液，按体积百分比I 2%的接种量接入添加了100 200mg/L苯酚液体的 M9培养基中振荡培养，待菌体生长至对数期末期，即10 14小时后，离心收集菌体，经pH值为7. O 7. 5、浓度为0.1 0. 2mol/L的磷酸缓冲液洗涤，然后用相同缓冲液悬浮，使其干重浓度为6g/L。4、制备吲哚/丙酮溶液(0.1g吲哚溶于ImL丙酮)，然后用滤膜过滤除菌，吲哚/丙酮溶液中吲哚浓度为lX105mg/L ； 5、在50mL的锥形瓶中加入20mL步骤3制得的扩大培养后的Pseudomonasmonteilii QM菌，步骤4制备的吲哚/丙酮溶液10 μ L，使反应液中吲哚的浓度为50mg/L，在30°C下，摇床转速200r/min，振荡反应5小时。高效液相色谱(HPLC)测定靛蓝产量反应结束时，上清液用三氯甲烷萃取，并用0. 22 μ M的有机滤膜过滤，利用Prominenece LC-20A高效液相色谱仪进行检测，流速1.OmL/min,进样量为10 μ L，柱温为40°C;其中流动相A为甲醇，流动相B为超纯水，0_20min用60-75 %的流动相A和40-25 %的流动相B梯度淋洗，20_25min用60 %的流动相A和40 %的流动相B清洗，35min时停止清洗。其中靛蓝检测波长为289nm，测得靛蓝浓度为42. 50mg/L0生物转化反应时不同参数变化对靛蓝浓度影响的实验当其他参数采用本实施例的数值时,靛蓝浓度随Pseudomonas monteiliiQM菌细胞浓度变化、随反应时间变化、随吲哚浓度变化的曲线分别如图1、图2、图3所示。实施例2,苯酹降解菌Pseudomonas monteilii QM生物转化卩引哚生产靛蓝。
步骤I 4同实施例1,控制步骤3制得的扩大培养后的Pseudomonas monteiliiQM菌干重浓度为4. Og/L。在50mL的锥形瓶中加入20mL步骤3制得的扩大培养后的Pseudomonas monteiliiQM菌，步骤4制备的吲哚/丙酮溶液15μ L，使反应液中吲哚的浓度为75mg/L，35°C下、300r/min振荡6小时。按实施例1所述的测量方法，测得靛蓝浓度为35. 24mg/L。实施例3,苯酹降解菌Pseudomonas monteilii QM生物转化卩引哚生产靛蓝。步骤I 4同实施例1,控制步骤3制得的扩大培养后的Pseudomonas monteiliiQM菌干重浓度为8. 0g/L。在50mL的锥形瓶中加入20mL步骤3制得的扩大培养后的Pseudomonas monteiliiQM菌，步骤4制备的吲哚/丙酮溶液20 μ L，使反应液中吲哚的浓度为100mg/L，40°C下、250r/min振荡反应8小时。按实施例1所述的测量方法，测得靛蓝浓度为31. 20mg/L。实施例4,苯酹降解菌Pseudomonas monteilii QM生物转化卩引哚生产靛蓝。步骤I 4同实施例1,控制步骤3制得的扩大培养后的Pseudomonas monteiliiQM菌干重浓度为0. lg/L。在50mL的锥形瓶中 加入20mL步骤3制得的菌株扩大培养后的Pseudomonasmonteilii QM菌，步骤4制备的吲哚/丙酮溶液5 μ L，使反应液中吲哚的浓度为25mg/L，25°C下、50r/min振荡反应2小时。按实施例1所述的测量方法，测得靛蓝浓度为0. 24mg/L。实施例5,苯酹降解菌Pseudomonas monteilii QM生物转化卩引哚生产靛蓝。步骤I 4同实施例1,控制步骤3制得的扩大培养后的Pseudomonas monteiliiQM菌干重浓度为10. 0g/L。在50mL的锥形瓶中加入20mL步骤3制得的扩大培养后的Pseudomonas monteiliiQM菌，步骤4制备的吲哚/丙酮溶液40 μ L，使反应液中吲哚的浓度为200mg/L，20°C下、100r/min振荡反应I小时。按实施例1所述的测量方法，测得靛蓝浓度为8. 50mg/L。
权利要求
1.一种能有效催化吲哚合成靛蓝的苯酚降解微生物菌株，它是蒙氏假单胞菌QM(Pseudomonas monteilii QM)，保藏编号为 CGMCC No. 5054。
2.用苯酹降解菌Pseudomonasmonteilii QM催化Π引哚合成靛蓝的方法,其特征在于包含以下步骤 (1)利用苯酌■诱导Pseudomonasmonteilii QM菌在培养基中生长10 14小时至对数末期，然后离心分离，经PH值为7. O 7. 5、浓度为O.1 O. 2mol/L的磷酸缓冲液洗涤制备菌悬浮； (2)在菌悬液中加入吲哚进行生物转化以制备靛蓝，生物转化反应时，反应液中Pseudomonas monteilii QM菌的细胞干重浓度为O.1 10g/L,卩引哚浓度为25 200mg/L,在20 40°C温度下，控制摇床转速在50 300r/min，振荡反应I 8小时。
3.如权利要求2所述的用苯酹降解菌Pseudomonasmonteilii QM催化卩引哚合成靛蓝的方法，其特征在于，生物转化反应时，Pseudomonas monteilii QM菌的细胞干重浓度为4.O 8. Og/L，吲哚浓度为25 75mg/L，温度为25 35°C，摇床转速为150 200r/min,振荡反应时间为3 5小时。
全文摘要
本发明属于生物工程技术领域，涉及利用一种野生型苯酚降解菌转化吲哚制备靛蓝的方法。其特征在于，采用一种能有效催化吲哚合成靛蓝的苯酚降解微生物菌株，它是蒙氏假单胞菌QM(Pseudomonas monteilii QM)，保藏编号为CGMCC No.5054；生物转化反应时，反应液中Pseudomonas monteilii QM菌的细胞干重浓度为0.1～10g/L，吲哚浓度为25～200mg/L，在20～40℃温度下，控制摇床转速在50～300r/min，振荡反应1～8小时。本发明的生物转化反应条件温和，产物浓度高，可达到42.5mg/L，生产周期短，成本低，提取步骤简单，生产清洁，适合工业生产和应用。
文档编号C12N1/20GK103060218SQ201110317698
公开日2013年4月24日 申请日期2011年10月18日 优先权日2011年10月18日
发明者曲媛媛, 马桥, 许炳雯, 张旭旺, 李新亮, 周豪, 孔春雷, 曹湘禹, 周集体, 沈娥 申请人:大连理工大学