专利名称：防治新型鸭呼肠孤病毒病免疫制剂的制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种防治新型鸭呼肠孤病毒病免疫制剂的制备方法及应用。
背景技术：
新型鸭呼肠孤病毒病(俗称鸭出血坏死性肝炎)是2005年以来，在中国福建、 广东和浙江等省番鸭、半番鸭和麻鸭群发生的一种以肝脏不规则坏死和出血混杂、心肌出血、脾脏肿大斑块状坏死、肾脏和法氏囊出血等为主要特征的疫病，该病无明显季节性，各种品种鸭(如番鸭、半番鸭、麻鸭、北京鸭等)均可发生，并有逐年增加的趋势；发病日龄约为3 25日龄，其中以5 10日龄居多，病程5 7d，发病率5% 20%、死亡率2% 15%,日龄愈小或并发感染时其发病率死亡率愈高，给养鸭业造成一定的经济损失。福建省农业科学院畜牧兽医研究所从病毒理化生物学、动物回归试验、基因组特性及分子水平上首次证实鸭出血性坏死性肝炎的病原是一种有别于番鸭呼肠孤病毒(MDRV)、禽呼肠孤病毒 (ARV)的新型鸭呼肠孤病毒(Novel Duck Reovirus, NDRV)。至今为止，该病尚无有效的防治方法。
发明内容
本发明的目的之一是提供鸭呼肠孤病毒NDRV-JM85株鸭呼肠孤病毒NDRV-JM85株，系新型鸭呼肠孤病毒经生物技术传代致弱选育而成，保藏在中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称 CCTCC)，保藏日2011年7月29日，保藏编号CCTCC NO :V201127。保藏单位CCTCC地址在中国武汉市武汉大学。本发明的目的之二是提供用鸭呼肠孤病毒NDRV-JM85株制备防治新型鸭呼肠孤病毒病免疫制剂的方法。所述的制备方法如下鸭呼肠孤病毒NDRV-JM85株在番鸭胚成纤维细胞(MDEF)或11日龄番鸭胚中培养，收获病毒液灭活后与油佐剂制备新型鸭呼肠孤病毒病灭活疫苗。应用该疫苗3次免疫蛋鸡，收获3免后21天至63天的鸡蛋，提取卵黄与适量灭菌生理盐水制备成新型鸭呼肠孤病毒病免疫制剂。本发明的目的之三是提供用鸭呼肠孤病毒NDRV-JM85株制备的防治新型鸭呼肠孤病毒病免疫制剂的应用无NDRV母源抗体的雏鸭在1-2日龄，每羽肌注05ml的免疫制剂；含NDRV母源抗体的雏鸭在10日龄左右注射免疫制剂，1. Oml/羽；小鸭在注射免疫制剂后能够抵抗NDRV 的感染。雏鸭接种适量本发明的免疫制剂，能够预防鸭出血坏死性肝炎(新型鸭呼肠孤病毒病)本发明的优点本发明首次制成新型鸭呼肠孤病毒制备免疫制剂，该制剂制备简便，成本低，安全性好，为防制新型鸭呼肠孤病毒病提供了一种安全有效的方法。
具体实施例方式以下结合具体实施例对本发明进一步说明。(但不是对本发明的限制)。鸭呼肠孤病毒NDRV-JM85株，系新型鸭呼肠孤病毒经生物技术传代致弱选育而成。保藏在CCTCC，保藏日2011年7月四日，保藏编号CCTCC NO :V201127。将上述的鸭呼肠孤病毒NDRV-JM85株为种毒，接种番鸭胚尿囊腔，尿囊腔接种 11日龄番鸭胚增殖病毒，收获含毒尿囊液；或接种番鸭胚成纤维细胞单层，当细胞病变达 75%以上时收获细胞毒；将上述病毒用甲醛灭活后，按适当比例(如1 1比例)与油佐剂混勻，研制成灭活疫苗。将灭活疫苗免疫开产蛋鸡，1. Oml/羽，共免疫3次，每次间隔21天。 收获3免后21天至63天的鸡蛋，无菌提取卵黄与适量灭菌生理盐水混勻并过滤分装，即为新型鸭呼肠孤病毒病免疫制剂。具体方法如下(1)抗原制备将JM85病毒株接种番鸭胚成纤维细胞(MDEF)或11日龄的番鸭胚， 收获细胞病变达75%的细胞毒或24h后死亡番鸭胚的尿囊液毒，-20°C冻存。当病毒对番鸭胚成纤维细胞(MDEF)的TCID5tl彡10,/0. Iml时，可用于病毒的灭活。将收获的尿囊液或细胞毒，按总体积的0.06%加入纯甲醛，37°C灭活Mh。取灭活后的病毒液接种9日龄SPF 鸡胚或11日龄番鸭胚，鸡胚及番鸭胚应全部存活。(2)疫苗制备将灭活病毒液与油佐剂按1 1混合，搅拌均勻制成油包水型乳剂疫苗。该疫苗无菌检验应无菌生长。7日龄健康易感番鸭，每羽颈部皮下注射1. Oml的疫苗后，接种鸭应全部存活，采食、饮水、生长发育等均正常；随机剖杀鸭，心、肝、脾等内脏应未见异常。(3)免疫制剂的制备应用以上制备的疫苗免疫蛋鸡3次，每次间隔21天，每羽每次注射1. Oml0收集3免后21天至63天含新型鸭呼肠孤病毒抗体的高免鸡蛋，蛋壳洗净消毒后，无菌操作，分离蛋黄，加入一定比例的灭菌生理盐水(根据蛋黄中的抗体效价而定)进行勻浆，并每毫升加入青霉素、链霉素各1000单位，硫柳汞1. 0/万，过滤，分装消毒瓶内，-20°C冷藏备用，制备成卵黄抗体免疫制剂。(4)免疫制剂相关指标的测定4. 1无菌检验按现行中华人民共和国《兽药典》进行，均无细菌、霉菌、支原体等生长。4. 2安全性检验用1日龄健康易感雏番鸭10羽，每羽腿部肌肉注射1. 0毫升，观察20天，全部健活。4. 3攻毒保护检验1-2日龄番鸭分成2组，每组10羽，其中免疫制剂组腿肌注射制剂0. 5ml/羽，对照组腿肌注射灭菌hanks液0. 5ml/羽；于注射后第3天，两组分别接种 NDRV强毒，0. 5ml/羽，观察各组试验番鸭的采食、饮水、发病、死亡等情况，并于攻毒后第7 天每组随机剖杀3羽，观察心、肝、脾等病变。结果免疫制剂组人工感染强毒后在整个观察期，采食、饮水等均正常，并随机剖杀3羽，各器官均未见异常。对照组人工感染强毒后，番鸭表现为吃料、饮水减少或死亡，整个观察期间体重明显小于制剂组；剖检可见肝脏、脾脏明显的出血及坏死，心脏出血等病变。(5)免疫制剂的应用
无NDRV母源抗体的小鸭在1-2日龄，每羽肌注0. 5ml的制剂；有NDRV母源抗体的小鸭可在10日龄左右注射免疫制剂，1. Oml/羽。(6)临床应用效果试验结果在NDRV流行疫区挑选3个肉鸭养殖场进行免疫制剂的防治试验。小鸭在1_2日龄，每羽接种NDRV制剂0. 5ml，跟踪观察45天，试验雏鸭未出现不良反应，小鸭在整个饲养期内均无NDRV感染。而周边未采取以上措施的养殖场一直存在NDRV发病和死亡。进一步证明该制剂安全、有效，可用于临床上预防鸭出血坏死性肝炎(新型鸭呼肠孤病毒病)。
权利要求
1.鸭呼肠孤病毒NDRV-JM85株，保藏在CCTCC，保藏日期2011年7月四日，保藏编号 CCTCC NO :V201127。
2.用权利要求1所述的鸭呼肠孤病毒NDRV-JM85株制备防治新型鸭呼肠孤病毒病免疫制剂的方法，其特征在于，所述的制备方法如下用鸭呼肠孤病毒NDRV-JM85株尿囊腔接种11日龄番鸭胚增殖病毒，收获含毒尿囊液； 或接种番鸭胚成纤维细胞单层，当细胞病变达75%以上时收获细胞毒；将上述病毒用甲醛灭活后，按适当比例与油佐剂混勻，研制成灭活疫苗；将灭活疫苗免疫开产蛋鸡，1. Oml/ 羽，共免疫3次，每次间隔21天。收获3免后21天至63天的鸡蛋，无菌提取卵黄与适量灭菌生理盐水混勻并过滤分装，即为新型鸭呼肠孤病毒病免疫制剂。
3.用权利要求1所述的鸭呼肠孤病毒NDRV-JM85株制备的防治新型鸭呼肠孤病毒病免疫制剂的应用。
全文摘要
本发明公开了一种新型鸭呼肠孤病毒株NDRV-JM85，保藏编号CCTCC NOV201127)，以此为种毒，接种番鸭胚尿囊腔，收获含毒尿囊液；或接种MDEF细胞，收获CPE达75％时的细胞毒。以上病毒液用甲醛灭活后按比例加入白油佐剂，混匀后即成安全、有效的新型鸭呼肠孤病毒病油乳剂灭活疫苗。应用疫苗3次免疫产蛋鸡，免疫间隔21天，每次每羽注射1.0ml。收获3免后21天至63天的鸡蛋，提取卵黄与适量灭菌生理盐水制备成新型鸭呼肠孤病毒病高免抗体制剂。无NDRV母源抗体的雏鸭在1-2日龄注射0.5ml/羽的抗体制剂，或含母源抗体的雏鸭在10日龄左右注射1.0ml/羽的抗体制剂，即可预防和控制新型鸭呼肠孤病毒病。本发明适合于GMP条件下的规模化生产。
文档编号C12N7/00GK102492661SQ20111046106
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月29日 优先权日2011年12月29日
发明者朱小丽, 李兆龙, 林锋强, 王劭, 程晓霞, 陈仕龙, 陈少莺 申请人:福建省农业科学院畜牧兽医研究所, 陈少莺