专利名称：用于提高检测b细胞免疫球蛋白基因重组的方法
用于提高检测B细胞免疫球蛋白基因重组的方法本申请要求2010年3月29日提交的美国临时专利申请号61/318，417的优先权。发明领域本发明涉及用于识别和量化B细胞免疫球蛋白基因重组的方法。更具体地，本发明涉及设计用于增加来自免疫球蛋白cDNA和/或RNA的PCR-扩增产物数量的引物的方法。
背景技术：
当考虑科学研究的“停滞地带”时，免疫学已经成为了身体及其在健康和疾病时的状态的研究的主要部分。科学家不断地发现身体的天然防御系统和疾病之间的联系，这曾经被认为与免疫学无关。免疫系统的细胞提供炎性应答的最显著部分，且炎症可以与不同疾病，如心血管病、肾病、糖尿病、关节炎、和癌症有关。炎性应答必须小心地平衡,并且当该平衡得不到维持时，可以导致由免疫缺陷引起的疾病，或者在型谱另一端导致“自身免疫疾病”诸如系统性红斑狼疮(SLE)、风湿性关节炎(RA)和结节病。Anthony Fauci博士，Μ.D.,美国国家变态反应和传染病学院(UnitedStatesNational Institute of Allergy and Infectious Disease, NIAID)院长，由于提出“定义处于健康和疾病的人免疫系统状态是人免疫学研究的主要目标”(NIH新闻(NIH News),2010年 3 月 8 日,http: / / www.nih.gov, news/heal th/mar2010/niaid-Q8a.htm)而被弓 I 证。NIAID的的科学家认识到“目前用于检查处于血液中的免疫细胞混合物中基因表达差异的方法没有考虑即使在健康个体中存在广泛范围的各自细胞类型比例的变化”(Mark Davis博士，NIH新闻(NIH NewS)，2010年3月8日)。他们团队关于该问题的方法是一种分析通过使用微阵列技术获得的分子数据的新型数学方法——微阵列细胞特异的显著性分析(csSAM)由B细胞提供的抗体应答在免疫系统针对攻击的应答中产生显著程度的多样性。通过抗原的攻击，B细胞转移至B细胞滤`泡并构建生发中心(GCs)。重排的免疫球蛋白基因，本身作为显著的多样性来源，进一步通过恒定区的类型-转换重组和高变区的体细胞高突变来修饰。这些区域中的突变率已经估计比自发遗传突变的高约IO6倍。需要更灵敏的检测B细胞多样性的方法，以提供对处于健康和疾病的免疫系统状态的更好的理解。发明概述本发明涉及用于提高免疫球蛋白重组区PCR扩增和增加可检测重组分子数量的方法，所述方法包括将约3至约5个随机产生的核苷酸添加至用于PCR扩增一个或多个免疫球蛋白可变区的至少一个引物的3’末端，5’末端，或3’和5’末端二者。附图简述
图1图示来自人患者的B细胞群的免疫球蛋白可变区的PCR扩增结果。泳道1-3图示使用对照引物(在3’末端无随机产生的核苷酸序列)的PCR产物的相对产量，且4-6图示使用实验引物(在3’末端具有随机产生的核苷酸序列)的扩增序列的相对数量。泳道I表示来自正常个体RNA的扩增产物。泳道2来自CLL患者，且泳道3是空白，作为阴性对照。泳道4表示来自由正常个体分离的RNA的扩增产物，泳道5来自CLL患者，且泳道6是阴性对照。扩增条件相同。向引物添加3’随机产生的核苷酸，如通过泳道1、2、4和5中条带之间的强度差别所示，产生显著更多的扩增产物。图2图示多个靶标的测序结果，所述靶标用于检测来自不同个体的重排。检测这些重排及其相对频率、缺乏某些序列等可以提供关于免疫系统状态及其在健康和疾病中作用的有价值信息。详述本发明人已经开发了用于提高免疫球蛋白重组区PCR扩增和增加来自人和/或动物的B细胞群样品的可检测重组分子数量的新方法。本发明包括将约3至约5个随机产生的核苷酸添加至用于PCR扩增一个或多个免疫球蛋白可变区的至少一个引物的3’末端，5’末端，或3’和5’末端二者。所述方法与利用在一个末端或两个末端无随机产生的核苷酸的引物的扩增反应相比，提供增多数量的扩增产物。在生发中心中，B细胞通过体细胞高突变来修饰重排的免疫球蛋白基因。该高突变提供另外的多样性和抗原结合特异性。它还在免疫球蛋白重链和轻链基因的V区中和附近引入突变。近期改善了引物设计，因为开发了计算机程序来协助设计更容易与这些序列结合的简并引物。然而，为了检测表示抗体分子重组的真实群的重组，本发明人已经发现可检测的分子数量可以通过使用下述引物而增加，所述引物在高变区接合处结合并考虑该区中序列的高变性质。本发明提供用于扩增来自人或动物血液样品的RNA和/或cDNA的方法。然而，样品还可以获自人或动物体的骨髓或其他B细胞源。“重组免疫球蛋白序列”表示体内已经发生的不同遗传重排，其导致不同的多样性抗体。扩增可以通过本领域中技术人员已知的多种方法进行，并且其可以通过使用商购试剂盒而简化。用于扩增来自单个样品的多个靶标的方法已经记述在，例如，美国专利申请
发明者韩建 申请人:韩建