专利名称：试剂盒和方法
技术领域：
本发明涉及实时地均质(即非固相)测定样品中的一或几种脱氧核糖核苷激酶的试剂盒和方法，其用于诊断疾病、失调、感染(病毒性和细菌性)或癌症。
背景技术：
脱氧核糖核苷激酶真核细胞中存在至少三种脱氧核糖核苷激酶，胸苷激酶I和2 (TKl和TK2)、脱氧胞苷激酶(dCK)和脱氧鸟苷激酶(dGK)。存在着编码两种不同胸苷激酶的两种人类基因座。可以在细胞的胞浆中发现胸苷激酶。胸苷激酶2定位于线粒体并参与线粒体DNA合成。TK2具有与胸苷激酶I不同的氨基酸序列、底物特异性和表达谱。从细胞周期的Gl期末期开始和贯穿S期，胸苷激酶I的活性最为明显。TK和dCK负责通过补救途径调节细胞中的TTP和dCTP池。所述TK酶在三磷酸腺苷(ATP)的存在下催化胸苷向单磷酸胸苷(TMP)转化。在整个细胞周期都发现脱氧胞苷激酶的活性，并且主要在淋巴来源的细胞中鉴定到其活性。TK2定位于线粒体中并与dCK具有对dC几乎相等的亲和力。疾病的诊断在20世纪80年代早期，表明胸苷激酶活性不仅可以从受各种肿瘤疾病影响的患者的血清中检测到，而且与健康人类个体(其中通常表现出非常低的TK活性)有广泛的差
巳升。目前广泛接受使用TK作为血液癌症疾病诊断和预后的单一肿瘤标记物。在某些情况下，TK已显示出直接的诊断能力。TK和其他脱氧核糖核苷激酶的活性早已与疾病相关联，这由Eriksso等人(2002)和由Topolcan与Holubec (2008)在综述中有所总结。已将TK2和线粒体疾病相联系。检测脱氧核糖核苷激酶的测定放射性底物，如3H-胸苷，已被广泛用于在过滤结合测定中确定TK和dCK的活性。对于常规的临床诊断，基于放射性的测定不是个有吸引力的选择。在最近几年中，已作过几种尝试以开发不基于放射性的测定，所有这些测定在一个方面或其他方面更好。以下是在不同的脱氧核糖核苷激酶的检测中所使用的一组方法、测定和试剂组合物。在EP1385005中，提出基于叠氮胸苷(AZT)的竞争性单磷酸化的不基于放射性的TK活性测定。这项技术已由Diasorin S. r.1.进一步开发成自动的两步骤的LIAISONS:发光诊断测定。在该两步的测定中，首先由样品中存在的TK将AZT磷酸化为单磷酸化的AZTMP。接着从缀合至异氨基苯二酰肼(AZTMP ABEI)的AZTMP检测发光，所述缀合至异氨基苯二酰肼的AZTMP与固体表面底物上的TK磷酸化AZTMP竞争结合抗AZTMP抗体。该两步骤测定的主要缺点是动态读取受限。另一缺点是使用修饰的核苷底物代替天然的胸苷。
在W02009/063254中公开了通过使用单磷酸化的Br_dU的用于确定样品中TK活性的半均质方法，所述单磷酸化的Br-dU通过HPLC分离并通过UV检测。该方法的缺点是用修饰的底物进行所述反应和以分离步骤进行检测。US2008/248472公开了固相测定，其通过试剂混合物中的脱氧核糖核苷激酶互补样品中TK活性以产生Br-dUTP (天然TTP的衍生物)。随后使用RNA依赖的DNA聚合酶通过引物延伸掺入所述Br-dUTP。固相结合的RNA模板由单体rA建成，长200-400个单体，并被连至固相。在ELISA中使用碱性磷酸酶缀合的抗[Br]dU抗体在第二步骤检测掺入的[Br]U来最终确定TK活性。用许多手动交互步骤进行这个两步骤的测定是繁琐的并且执行所述测定花费过长的时间。尚未提出用于测量样品中dCK活性的可靠的检测。附图简述
图1显示了产生TTP和dCTP的补救途径图2显示了根据本发明的方法的检测系统2的原理图3显示了根据本发明的方法的检测系统3的原理图4显示了根据本发明的方法的检测系统I的原理图5通过实时荧光捕获获得的荧光曲线获得实施例3的hrTKl标准点的阈值水平
Cto 图6实施例3的hrTKl标准点的平均Ct值在对数标度上的线性回归。图7实施例4的hrdCK标准点的平均Ct值在对数标度上的线性回归。图8实施例7多重hrTKl与hrdCK在对数标度上的线性回归。图9犬血清样品中的TKl测量和实施例8中使用的hrTKl标准点在对数标度上的线性回归。图10通过实时荧光捕获获得的线性归一化的荧光曲线获得实施例9的阈值水平
Cto 图11实施例9的致病性犬血清和hrTKl标准点的平均Ct值在对数标度上的线性回归。图12通过实时荧光捕获获得的线性和动态管归一化的荧光获得实施例10的阈值水平Ct。图13实施例10的hrTKl标准点的平均Ct值在对数标度上的线性回归。定义本说明书中的所有术语和词语应当按照其正常含义和在相关领域中的使用来解释。为了明确起见，以下更具体地讨论一些术语。除非另有说明，在整个发明中互换地使用胸苷和脱氧胸苷。坦JIli定是非固相测定，其在延伸引物-模板系统时产生信号，需要最少的引物延伸后操作。这些测定无需分离步骤。所述反应完全在溶液中发生，没有珠或固相附着干扰低亲和力的相互作用。均质测定方法对药物发现中所需的通量和测定小型化是必要的。在任何均质测定中，在测量过程中存在所述测定的所有组分。排除分离步骤是这些测定方法的主要优点，但由于测定成分的非特异性测量这也存在困难(来源http://WWW.genomicglossaries. com/content/Assays. asp, 2010 年 4 月 28 日检索)。
脱氧核糖核苷是包括连接至五碳糖脱氧核糖的含氮碱基的分子。脱氧核糖核苷通常被简单地称为结合至脱氧核糖的碱基。天然的脱氧核糖核苷被定义为未修饰的脱氧核糖核苷。这些的实例包括胞苷、尿苷、腺苷、鸟苷、胸苷和肌苷。天然的脱氧核糖核苷是在野生型活生物体(如人类)中存在的形式的脱氧核糖核苷。修饰的脱氧核糖核苷也称为核苷类似物，是在葡基胺或核酸碱基(nucleobase)上有任何种类修饰的脱氧核糖核苷。在医药中，几种核苷类似物用作抗病毒剂或抗癌剂。修饰的脱氧核糖核苷的实例是叠氮胸苷(AZT)、溴-脱氧尿苷(Br-dU)、碘-脱氧尿苷、乙烯基-脱氧胸苷和氟-脱氧尿苷。 DNA依赖性DNA聚合酶是催化脱氧核糖核苷三磷酸以单链DNA为模板组装为脱氧核糖核酸的酶。在一些文献中，DNA依赖性DNA聚合酶也可称为DNA指导的DNA聚合酶。DNA依赖性DNA聚合酶可以具有三种不同的酶活性(a)5’至3’聚合酶活性,在模板DNA指导下催化由脱氧核糖核苷5’ -三磷酸产生的单核苷酸单元添加至引物链的3’ -羟基末端；(b)仅在双链体DNA上的5’至3’核酸外切酶的活性；(c)主要在单链DNA上有活性的3’至5’核酸外切酶，其可以选择性地去除不匹配的末端核苷酸。注意除DNA聚合酶I外,Taq DNA聚合酶和来自Thermus thermof ilus的Tth聚合酶是至今鉴定的仅有的具有5’ 一3’核酸外切酶活性的DNA依赖性聚合酶。DNA樽板分子是作为DNA依赖性DNA聚合酶的模板的ssDNA分子。DNA引物分子是短的DNA分子，其与DNA模板分子的区段互补并作为DNA依赖性DNA聚合酶的DNA聚合的引物。`完整的形式当本发明中所使用的DNA探针是根据本发明进行的任何聚合酶反应之前的形式时，称其为完整的形式。补救合成涂径示于图1，是合成TTP和dCTP的途径之一。TTP和dCTP是胸苷和脱氧胞苷的相应的脱氧核糖核苷三磷酸。这些首先通过在脱氧核糖核苷激酶的帮助下从例如ATP转移一个磷酸基团(会产生相应的单磷酸TMP或dCMP)来产生。dTMP激酶和胞嘧啶核苷酸(cytidylate)激酶催化形成相应的二磷酸核苷,TDP和dCDP。核苷二磷酸激酶转变二磷酸盐为最终的三磷酸核苷。RNA依赖性DNA聚合酶是催化脱氧核糖核苷三磷酸在第一链合成过程中以单链RNA为模板组装为脱氧核糖核酸的酶。所用的缩写ATP 腺苷5’ -三磷酸AZTMP叠氮-胸苷单磷酸BrdU 溴脱氧尿苷dCDP 脱氧胞苷二磷酸dCK 脱氧胞苷激酶EC 2. 7.1. 21 ；ATP:胞苷_5’ -磷酸转移酶dCMP 脱氧胞苷单磷酸dCMPK胞嘧啶核苷酸激酶EC 2. 7. 4. 14 ；ATP:dCMP磷酸转移酶
dsDNA 双链 DNAhrdCK人重组脱氧核糖核苷激酶hrTKl人重组胸苷激酶IMMX MasterMix [无样品的试剂混合物]NdPK 核苷二磷酸激酶EC 2. 7. 4. 6 ；ATP:核苷二磷酸磷酸转移酶hrTKl人重组胸苷激酶IssDNA 单链 DNATDP 脱氧胸腺嘧啶二磷酸TK 胸苷激酶EC 2. 7.1. 21 ；ATP:胸苷_5’ -磷酸转移酶TMPK dTMP 激酶EC 2. 7. 4. 9 ；ATP: TMP 磷酸转移酶TMP 脱氧胸苷单磷酸发明概述 本发明旨在提供用于检测脱氧核糖核苷激酶活性的通用的和改进的方法和试剂盒。本发明人已发现仍有基于活性的脱氧核糖核苷激酶活性测定试剂盒和方法的需要，所述试剂盒和方法不仅可以检测样品中的TK，也可以用于dCK测试(例如在癌症治疗中监测药物抗性的发展)，并且其在性能上是稳健的、快速、简单、用户友好而且对临床使用是安全的。使用dCK作为诊断工具用于癌症疾病管理尚未发现其临床应用。然而，在癌症治疗中使用的几种核苷类似物(例如阿糖胞苷和较新的吉西他汀)是由dCK活化的，因此找到用于简单的确定抗性发展的有效的解决是最重要的，因为已知抗性与dCK缺乏相联系。本发明在权利要求中总结。发明详述Taq DNA聚合酶是来自嗜热水生菌(Thermus aquaticus)的DNA依赖性DNA聚合酶。Taq聚合酶(或简单地Taq)具有65_75°C的最佳温度区间。所述Taq DNA聚合酶也具有5’至3’核酸酶活性。出乎意料地发现Taq DNA聚合酶在37°C下对于引物延伸和5’至3’核酸酶活性的剩余活性足以从荧光双重标记的探针(其一标记转移其能量(猝灭)至以热而不是光释放能量的另一标记)释放5’结合的荧光标记物。与之前提出的对脱氧核糖核苷激酶的检测方法相比，因此可以实时地测量脱氧核糖核苷激酶的活性而不是确定终点的酶活性。核酸扩增测定系统中的实时检测除具有提高的灵敏度外，还具有快速、提高的分辨率和更好的精度的优点。也认为对均质脱氧核糖核苷激酶活性测定来说，为了与目前市场上的测定竞争，它必须能够从健康的志愿者(如0. 5U/1-7U/1)中从测定开始的5小时内测量这些活性。在之前的尝试中，使用Taq DNA聚合酶在37°C下引物延伸和5’ -核酸酶反应不幸地没有获得结果。因此，认为并假设所述Taq DNA聚合酶的引物延伸反应和5’核酸酶反应可以被大肠杆菌的DNA依赖性DNA聚合酶I的相同的活性所替代，从而保持均质测定的实时方面。令人失望的是不能使用该DNA聚合酶I，因为该酶非特异地释放5’结合的荧光团。因此，再次认为对两种反应只使用一种孵育温度的真正的实时方法必须被放弃而用两步骤的改变温度的方法代替，即(1)11^或(10^的产生必须在371下发生，(2)所述引物延伸以及5’-核酸酶荧光团的释放必须在更高的温度下(例如在51°C下)孵育以支持Taq DNA聚合酶的活性。期望这能工作，因为所述Taq DNA聚合酶在51°C下应当保留其最高活性的大约40%。此外，认为应当保留其工业实用性，因为通过编程实时PCR仪器来执行温度改变，可以使得温度改变的两步骤测定对测试供应商和操作者来说是不可见的。所以首先构建引物-模板-探针系统以协调至用于51°C下杂交的最佳热力学特性。考虑到MgCl2的浓度，计算所述探针的Tm将达到69°C。在第一个尝试中仅测量TK活性，令人惊讶的是37°C温育步骤已产生释放的和归一化的荧光的好的线性图，其来自所包括的两个标准点，即分别来自2000pg、200pg、20pg和2pg hrTKl的活性。获得0. 9669的R2值。来自51°C反应的释放的和归一化的荧光的线性图甚至更差，不过仍然可读。因此，得出的结论是用于检测样品中TK的可能的实时测定方法近在咫尺。更令人惊讶的是第一个实验指示在Ih内测量低至从正常的健康志愿者的血清样品中发现的TK活性的可能性。这代表从最初的初步说明改进了 4h。所述hrTKl的比活性评估为2.1 ii mol/min/mg。该测定只保留描述实时PCR的线性和平稳(饱和)阶段。在37°C下实时检测TK活性的惊人效果直接解决与两步骤温度改变方法相关的其他两个问题。第一，TK显示特征性的TTP抑制。这可能使两步骤测定难以对含有高TK活性的样品进行，即需要稀释步骤。现在可以将其省略，因为所产生的TTP或dCTP持续地被所述Taq DNA聚合酶通过将TTP或dCTP掺入引物-模板系统来去除。第二，Taq DNA聚合酶在较高温度(如51°C)下的非常高的聚合速率(在72°C下35-100nt每秒)可能引起在实时解析测定结果的一些严重的问题，因为较高的TK活性值(甚至低至10U/1)会从测定开始的几分钟内显现从而严重地限制分辨率。同时，由于信号分辨率的需要而仅可 以使用有限量的Taq DNA聚合酶U/反应，健康志愿者的活性在能检测到信号前可能需要几小时。总之，公开了非显而易见的发现，现在可以将其变为用于检测脱氧核糖核苷激酶活性的工业可应用的测定和方法，图5。在随后的实验中(实施例3)验证了所述测定的灵敏度。总之，现已发现天然的底物胸苷(T)和/或脱氧胞苷(dC)或其混合物，和DNA依赖性DNA聚合酶是测量脱氧核糖核苷激酶(如TK或dCK)催化浓度所需要的必要的试剂。这可以在含有用于TK或dCK活性测定的其他已知组分的均质混合物中进行。通过用反应混合物中存在的其他核苷激酶(如dTMP激酶或胞嘧啶核苷酸激酶)和核苷二磷酸激酶的活性互补样品中的TK或dCK催化活性，使得该测定性能稳健、操作快速和简单并且在临床上是安全的。这些试剂可以方便地纳入试剂盒和缓冲液中，用于产生TTP或dCTP，伴随使用引物-模板-检测物(detector)系统的引物延伸，各自有固定的浓度。在本文的剩余部分中，无样品的反应混合物中的试剂称为母液混合物(master mix),缩写为MMX。在MMX中也可以包括DNA依赖性DNA聚合酶。表I总结了用于测定脱氧核糖核苷激酶的方法的试剂盒组分的现有技术情况。总之，之前的脱氧核糖核苷激酶试剂盒权利要求没有包括DNA依赖性DNA聚合酶和天然的T和/或dC底物或其混合物，或其使用方法。表1:现有技术试剂盒组分与本发明比较
权利要求
1.包含DNA依赖性DNA聚合酶和至少一种天然的脱氧核糖核苷的试剂盒。
2.包含DNA依赖性DNA聚合酶和检测系统的试剂盒，所述检测系统包含DNA模板分子、DNA引物分子和荧光部分，所述荧光部分能够从所述DNA依赖性聚合酶合成的dsDNA中被置换出或结合至所述DNA依赖性聚合酶合成的dsDNA。
3.权利要求1或2的试剂盒，还包含至少一种磷酸转移酶。
4.权利要求1至3中任一项的试剂盒,还包括至少一种天然的或修饰的脱氧核糖核苷。
5.权利要求1至4中任一项的试剂盒，其中所述至少一种天然的脱氧核糖核苷选自脱氧胸苷和/或脱氧胞苷或其混合物。
6.权利要求1至5中任一项的试剂盒，其中所述至少一种修饰的脱氧核糖核苷选自修饰的胸苷和修饰的胞苷，例如BrdU和/或IdU,或其混合物。
7.权利要求1至6中任一项的试剂盒，其中所述荧光部分偶联至单链DNA探针。
8.权利要求7的试剂盒，其中所述荧光部分和一猝灭部分偶联至单链DNA探针。
9.权利要求2至6中任一项的试剂盒，其中所述荧光部分是双链DNA表面结合或嵌入分子，例如 PicoGreeruEva 染料或 SYBR GreenI。
10.权利要求7或8的试剂盒，其中结合至所述单链DNA探针的荧光部分在所述探针处于其完整形式时是猝灭的。
11.权利要求9的试剂盒，其中所述DNA依赖性DNA聚合酶具有5’至3’核酸外切酶活性，例如Taq DNA聚合酶或Tth聚合酶。
12.权利要求7或8的试剂盒，其中结合至所述单链DNA探针的荧光部分当处于其完整形式并杂交至其靶模板时达到最大荧光。
13.用于测量样品中脱氧核糖核苷激酶活性的方法，其特征在于a.使样品在容器中与反应混合物接触，所述反应混合物包含DNA依赖性DNA聚合酶、至少一种脱氧核糖核苷和检测系统，所述检测系统包含DNA模板分子、DNA引物分子和荧光部分，所述荧光部分能够掺入所述DNA依赖性聚合酶合成的dsDNA、从所述DNA依赖性聚合酶合成的dsDNA中被置换出或结合至所述DNA依赖性聚合酶合成的dsDNA ；b.孵育所述容器；c.测量来自所述荧光部分的信号；d.使来自所述荧光部分的信号与所述样品中的脱氧核糖核苷激酶活性相关联。
14.权利要求13的方法，其中所述至少一种脱氧核糖核苷是天然的或修饰的脱氧核糖核苷或其混合物。
15.权利要求13或14中任一项的方法，其中所述至少一种天然脱氧核糖核苷选自脱氧胸苷和/或脱氧胞苷或其混合物。
16.权利要求13或14中任一项的方法,其中所述至少一种修饰的脱氧核糖核苷选自修饰的胸苷和修饰的胞苷，例如BrdU和/或IdU,或其混合物。
17.权利要求13至16中任一项的方法，其中所述荧光部分偶联至单链DNA探针。
18.权利要求13至17中任一项的方法，其中所述荧光部分和一猝灭部分偶联至单链DNA探针。
19.权利要求13至16中任一项的方法，其中所述荧光部分是双链DNA表面结合或嵌入分子，例如 PicoGreen、Eva 染料或 SYBR Green I。
20.权利要求13至18中任一项的方法，其中结合至所述单链DNA探针的荧光部分在所述探针处于其完整形式时是猝灭的。
21.权利要求20的方法，其中所述DNA依赖性DNA聚合酶具有5’至3’核酸外切酶活性，例如Taq DNA聚合酶或Tth聚合酶。
22.权利要求17或18的方法，其中结合至所述单链DNA探针的荧光部分当处于其完整形式并杂交至其靶模板时达到最大荧光。
全文摘要
本发明涉及包含DNA依赖性DNA聚合酶和至少一种天然的脱氧核苷的试剂盒，并涉及包含DNA依赖性DNA聚合酶和检测系统的试剂盒，所述检测系统包含DNA模板分子、DNA引物分子和荧光部分，所述荧光部分能够被置换出或能够结合至所述DNA依赖性聚合酶合成的dsDNA。其还涉及用于测量样品中脱氧核糖核苷激酶活性的方法，其特征在于；(i)使样品在容器中与反应混合物接触，所述反应混合物包含DNA依赖性DNA聚合酶、至少一种脱氧核糖核苷和检测系统，所述检测系统包含DNA模板分子、DNA引物分子和荧光部分，所述荧光部分能够掺入所述DNA依赖性聚合酶合成的dsDNA、从所述DNA依赖性聚合酶合成的dsDNA中被置换出或结合至所述DNA依赖性聚合酶合成的dsDNA；(ii)孵育所述容器；(iii)测量来自所述荧光部分的信号；和使来自所述荧光部分的信号与所述样品中的脱氧核糖核苷激酶活性相关联。
文档编号C12N9/12GK103038361SQ201180024021
公开日2013年4月10日 申请日期2011年5月13日 优先权日2010年5月14日
发明者P·斯托尔汉德斯克, J·伦纳斯特兰德 申请人:P·斯托尔汉德斯克, J·伦纳斯特兰德