改进的rna酶h和核酸扩增的检测的制作方法

专利名称：：改进的rna酶h和核酸扩增的检测的制作方法
技术领域：
：本公开描述了一种改进的RNA酶H，用于改善RNA序列的实时逆转录-PCR检测。
背景技术：
：研究基因表达的最广泛使用的技术之一是采用mRNA序列的第一链cDNA作为模板进行PCR扩增。结合逆转录-PCR技术测量PCR反应的动力学的能力使得以必需水平灵敏度来准确并精确测量靶RNA序列变得容易。具体地讲，诸如CATACLEAVE核酸内切酶测定(在第5，763，181号美国专利中详细地描述；见图I)的荧光双重标记杂交探针技术允许实时的逆转录-PCR扩增的检测。通过在扩增反应中包括CATACLEAVE探针连同RNA酶H来实现靶序列的检测。在逆转录-PCR扩增产物中与靶序列互补的CATACLEAVE探针具有包括RNA序列和DNA序列的嵌合结构，并且在5'端和3'端两侧连接可检测标记，例如，FRET对标记的DNA序列。FRET对的荧光标记与淬灭剂的接近阻止了完整探针发射荧光。当探针与逆转录PCR产物退火时，产生能够通过存在于反应混合物中的RNA酶H切割的RNA=DNA复体。在退火探针的RNA部分内的切割导致荧光标记与淬灭剂的分离并导致随后的荧光发射。
发明内容技术问题描述了一种可逆改进的“热启动”RNA酶H组合物，用于改善测试试样中核酸序列的CATACLEAVE探针检测。酶组合物的关键特征是能够在逆转录PCR循环过程中调节RNA酶H的催化活性。因此，在逆转录之前可以首先抑制RNA酶H的活性以最小化RNA:DNA异源双链引物的降解。在完成cDNA合成后，诱导RNA酶H的活性以促进切割和退火到逆转录-PCR产物内的靶DNA序列的CATACLEAVE探针的荧光检测。所述可诱导的RNA酶H酶适用于在单一反应混合物中需要一步逆转录CATACLEAVEPCR的高通量应用。在一个实施例中，本发明包括热启动酶组合物,热启动酶组合物包含具有可诱导的RNA酶H活性的酶。酶可以具有热稳定的RNA酶H结构域，所述结构域可以与SEQIDNO:11、12、13或14的氨基酸序列具有至少70%、80%或90%、95%或99%的序列同源性。热启动组合物可以具有例如DNA聚合酶或逆转录酶活性的聚合酶活性。RNA酶H活性可以是热诱导的或PH诱导的。在一个实施例中，具有可诱导的RNA酶H活性的酶可以是PyrococcusfuriosusRNA酶HII、PyrococcushorikoshiRNA酶HII、ThermococcusIitoralisRNA酶HI、ThermusthermophilusRNA酶HI、大肠杆菌火球菌RNA酶HI或大肠杆菌火球菌RNA酶HII。可以通过化学修饰可逆地改进具有可诱导的RNA酶H活性的酶。在实施例中，可以通过对酶的诸如赖氨酸的氨基酸酰化或通过与具有大约O.2%至大约1%(w/v)的浓度的甲醛反应来对酶进行可逆地改进。在一个实施例中，热启动酶组合物还包括配体，其中，可通过配体与酶的结合抑制可诱导RNA酶H的活性或通过干扰酶与配体的结合诱导可诱导RNA酶H的活性。配体可以是热不稳定的。酶与配体的结合可以是非共价的。配体可以是对于具有可诱导RNA酶H活性的酶具有KT1M或更小的Kd解离常数的小分子、肽或核酸。在一些实施例中，配体可以结合到RNA酶H结构域或可以诱导RNA酶H结构域的构象变化。配体可以是抗体、抗体片段、适体或螯合剂。抗体片段可以是Fab、Fab'>F(ah')2、Fd、单链Fv或scFv、二硫键连接的Fv、V-NAR结构域、IgNar、胞内抗体、IgGDCH2、小体、F(ab')3、四体、三体、二体、(ScFv)2、单结构域抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2或scFv-Fc。RNA酶H的活性可以通过(I)将包含酶的溶液加热至大约90°C或更高的温度或者(2)将包含酶的溶液的pH降低至大约7.O或更低来诱导。所述溶液可以是包含靶核酸序列的聚合酶链式反应试样。酶和配体的结合可以是共价的。例如，配体可以是交联剂。在一个实施例中，本发明公开了一种扩增靶序列的方法，所述方法包括提供扩增反应混合物；以及使扩增反应组合物进行至少一次扩增反应以形成至少一种扩增产物，并且测量得到的扩增产物的可检测标记，其中，扩增反应包括将反应组合物加热到大约90°C的温度的步骤，扩增反应混合物包含包含靶DNA序列的试样；热启动酶组合物,包含DNA聚合酶和可诱导的RNA酶H活性；第一引物，包含与靶核酸序列的5'端互补的序列；第二引物，包含与靶核酸序列的3'端互补的序列；以及探针，结合到可检测标记并具有能被RNA酶H切割的组分。可以在大约95°C进行加热反应组合物的步骤。探针可以是包含一个或多个DNA序列部分以及RNA序列部分的寡核苷酸，其中，RNA部分以RNA序列的3丨端和5丨端结合到两个DNA序列中的每个DNA序列的方式设置在两个DNA序列之间。加热步骤可以通过破坏具有RNA酶H活性的酶和配体之间的结合来诱导RNA酶H的活性。配体可以是热不稳定的。在另一实施例中，本发明公开了检测试样中的靶核糖核酸序列的方法，所述方法包括提供扩增反应组合物；开始祀RNA的逆转录以形成RNA:cDNA(注意cDNA表示产物是双链DNA，而不是逆转录产物)双链；将反应组合物加热至大约90°C或更高的温度，由此激活可诱导的RNA酶H的活性以降解RNA=DNA双链的RNA配基；开始至少一个扩增反应以形成至少一种扩增产物，并且测量得到的扩增产物的可检测标记，扩增反应组合物包含包含靶RNA序列的试样；热启动酶组合物，包含逆转录酶、DNA聚合酶和可诱导的RNA酶H活性，其中，RNA酶H的活性受配体抑制；探针序列，包含可检测标记并包含RNA酶H的切割序列；第一引物，包含与靶核酸序列的5'端互补的序列；以及第二引物，包含与靶核酸序列的3'端互补的序列。探针可以是包含一个或多个DNA序列部分以及RNA序列部分的寡核苷酸，其中，RNA部分以RNA序列的3'端和5'端结合到两个DNA序列中的每个DNA序列的方式设置在两个DNA序列之间。靶核糖核酸序列可以是逆转录酶病毒。可以在大约95°C进行加热反应组合物的步骤。加热步骤可以激活可诱导的RNA酶H的活性。配体可以是热不稳定的。在另一实施例中，本发明描述了具有在此描述的热启动酶组合物的微阵列。在又一实施例中，本发明公开了用于检测多个试样中的靶核糖核酸序列的方法，所述方法包括提供具有多个扩增反应组合物的微阵列以及在微阵列中对每个扩增反应组合物进行以下步骤开始靶RNA的逆转录以形成RNA:cDNA双链；将反应组合物加热至大约90°C或更高的温度，由此激活可诱导的RNA酶H的活性以降解RNA:cDNA双链的RNA配基；开始至少一个扩增反应以形成至少一种扩增产物，并且测量得到的扩增产物的可检测标记，每个扩增反应组合物包括包含靶RNA序列的试样；如权利要求18所述的热启动酶组合物，包含逆转录酶、DNA聚合酶和可诱导的RNA酶H活性,其中，所述RNA酶H的活性受所述配体抑制；探针序列，包含可检测标记并包含RNA酶H的切割序列；第一引物，包含与靶核酸序列的5'端互补的序列；以及第二引物，包含与靶核酸序列的3'端互补的序列。靶核糖核酸序列可以是逆转录酶病毒。可以在大约95°C进行可以激活可诱导RNA酶H的活性的加热反应组合物的步骤。配体可以是热不稳定的。在一个实施例中，本发明公开了具有可以包括具有逆转录酶活性或DNA聚合物酶活性的酶的热启动组合物的微阵列的试剂盒。上述实施例具有许多优点，包括使用改进的RNA酶H酶来改善RNA序列的CATACLEAVE逆转录PCR检测的灵敏度。改进的检测方法快速、准确并且适合高通量应用。也描述了用于RNA序列的高通量检测的方便、易用并且可靠的诊断试剂盒。技术方案除非另有说明，否则这里描述的实施例的实践采用本领域内常规的分子生物学技术。这样的技术对本领域技术人员来讲是公知的，并且在文献中被充分地解释。参见，例如，Ausubel等作者，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons公司，NY,N.Y.(1987-2008),包括所有增刊；Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版，ColdSpringHarbor,N.Y.(1989)。除非另有定义，否则这里使用的所有技术术语和科学术语具有与本领域技术人员所通常理解的意思相同的意思。本说明书也提供了对术语的定义，以有助于解释本申请的公开内容和权利要求书。如果定义与别处的定义不一致，则将以本申请中所阐述的定义为准。RNA酶H酶和RNA酶H结构域本申请描述了在CataCleave逆转录PCR反应中使用的改进的热稳定RNA酶H组合物。RNA酶H水解RNA-DNA杂交体中的RNA。首先在小牛胸腺中确定了RNA酶H，随后描述了各种生物体中的RNA酶H。实际上，在真核生物和细菌中普遍存在RNA酶H活性。尽管RNA酶H形成了具有不同的分子量和溶核活性的蛋白质家族，但对于各种同种型来讲，底物要求是相似的。例如，至今所研究的大部分RNA酶H用作核酸内切酶，并且需要二价阳离子(例如，Mg2+、Mn2+)以产生具有5'磷酸末端和3'羟基末端的切割产物。在原核生物中，RNA酶H已经被克隆并被广泛地鉴定(参见，Crooke等人，(1995)BiochemJ，312(Pt2)，599-608;Lima等人，(1997)JBiolChem，272，27513-27516;Lima等人，(1997)Biochemistry，36，390-398;Lima等人，(1997)JBiolChem，272，18191-18199；Lima等人，(2007)MoIPharmacoI,71,83-91;Lima等人，(2007)MolPharmacol,71,73-82；Lima等人，(2003)JBiolChem，278，14906-14912;Lima等人，(2003)JBiolChem,278,49860-49867；ItayaM.,Proc.Natl.Acad.Sci.美国，1990，87，8587-8591)。例如，大肠杆菌RNA酶HII是213个氨基酸长，而RNA酶HI是155个氨基酸长。大肠杆菌RNA酶HII表现出与大肠杆菌RNA酶HI仅具有17%的同源性。从鼠伤寒沙门氏菌克隆的RNA酶H与大肠杆菌的RNA酶HI仅在11个位点不同，并且从鼠伤寒沙门氏菌克隆的RNA酶H是155个氨基酸长(ItayaM.和KondoK.,NucleicAcidsRes.,1991,19,4443-4449)。也已经从许多病毒、其他细菌和酵母中克隆并纯化出表现出RNA酶H活性的蛋白质(Wintersberger，U.Pharmac.Ther.，1990,48,259-280)。在许多情况下，具有RNA酶H活性的蛋白质是融合蛋白，其中，RNA酶H融合到其他酶(通常为DNA聚合酶或RNA聚合酶)的氨基端或羧基端。已发现RNA酶H结构域与大肠杆菌RNA酶HI—直高度同源，但是因为其他结构域有较大改变，所以融合蛋白的分子量和其他特性变化很大。在高等真核生物中，已基于分子量、二价阳离子的作用、对巯基试剂的敏感性和免疫学交叉反应性的不同定义了两类RNA酶H(Busen等人，Eur.J.Biochem.，1977，74，203-208)。报道了RNA酶HI酶具有范围为68_90kDa的分子量，通过Mg2+或Mn2+活化并且对巯基试剂敏感。相反，已报道RNA酶HII酶具有范围为31-45kDa的分子量，需要Mg2+以对巯基试剂高度敏感并且受Mn2+抑制(BusenW.和HausenP.,Eur.J.Biochem.,1975,52,179-190；KaneC.Μ.，Biochemistry,1988,27,3187-3196；Busen,ff.，J.Biol.Chem.，1982,257,7106-7108)。在OhtaniN,HarukiM,MorikawaM,KanayaS,JBiosciBioeng,1999；88(I):12-9中报道了来自不同物种的RNA酶的详细对比。也已经从人类胎盘纯化出具有RNA酶HII特性的近同质性的酶(Frank等人，NucleicAcidsRes.，1994，22，5247-5254)。该蛋白质具有大约33kDa的分子量，在6.5-10的pH范围内(优选pH为8.5-9)具有活性。该酶需要Mg2+并受Mn2+和η-乙基马来酰亚胺抑制。切割反应的产物具有3'羟基末端和5'磷酸末端。可在实施例中使用的RNA酶H的示例还包括但不限于从嗜热生物体分离出的热稳定RNA酶H酶,例如,PyrococcusfuriosusRNA酶HII、Pyrococcusho;rikoshiRNA酶HII、Thermococcuslitoralis(嗜热高温球菌)RNA酶HI、Thermusthermophilus(嗜热栖热菌)RNA酶HI。例如，在Uemori的第7，422，888号美国专利或公开的Walder的第2009/0325169号美国专利申请中描述了在实施例中可以使用的其他RNA酶H酶，通过引用将它们的内容包含于此。在一个实施例中，RNA酶H酶是与下面示出的PfuRNA酶HII的氨基酸序列(SEQIDNO:I)40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%同源的热稳定RNA酶H。MKIGGIDEAGRGPAIGPLVVATVVVDEKNIEKLRNIGVKDSKQLTPHERKNLFSQITSIA60DDYKIVIVSPEEIDNRSGTMNELEVEKFALALNSLQIKPALIYADAADVDANRFASLIER120RLNYKAKIIAEHKADAKYPVVSAASILAKVVRDEEIEKLKKQYGDFGSGYPSDPKTKKffL180EEYYKKHNSFPPIVRRTffETVRKIEESIKAKKSQLTLDKFFKKP224使用例如计算机程序DNASISMac(TakaraShuzo)、计算机算法FASTA(第3.O版；Pearson,ff.R.等人，Pro.Natl.Acad.Sci.,85:2444-2448,1988)或计算机算法BLAST(第2.O版，Altschul等人，NucleicAcidsRes,25:3389-3402,1997)可以确定同源性。在另一实施例中，RNA酶H酶是具有与SEQIDNO:I的位点5_20、33_44、132-150和158-173对应的至少一个或多个同源区域的热稳定RNA酶H(见图12)。同源区域1:GIDEAGRGPAIGPLVV(SEQIDNO:10;对应于SEQIDNO:I的位点5-20)同源区域2LRNIGVKDSKQL(SEQIDNO:11;对应于SEQIDNO:I的位点33-44)同源区域3:HKADAKYPVVSAASILAKV(SEQIDNO:12;对应于SEQIDNO:I的位点132-150)·同源区域4:KLKKQYGDFGSGYPSD(SEQIDNO:13;对应于SEQIDN0:1的位点158-173)在另一实施例中，RNA酶H酶是具有与SEQIDNO:10、11、12或13的多肽序列有50%、60%、70%、80%、90%序列同源性的至少一个同源区域的热稳定RNA酶H。这里使用的术语“序列同源性”是指在比较窗口上氨基酸与氨基酸相同或者功能上或结构上相似的程度。因此，例如，通过在比较窗口上比较两个最优比对序列、确定两个序列中出现相同氨基酸的位置数以得到匹配位置数、用匹配位置数除以比较窗口中的位置总数(即，窗口尺寸)以及将该结果乘以100以得到序列同源性的百分比，可以计算出“序列同源性百分比”。RNA酶H的改进这里使用的术语“改进的RNA酶H”可以是可逆地结合到或可逆地键合到导致RNA酶H的核酸内切酶活性丧失的抑制因子。抑制因子从RNA酶H的释放或去结合使RNA酶H的至少一部分或全部的核酸内切酶活性恢复。完整的RNA酶H的活性的大约30%-100%可以是足够的。抑制因子可以是配体或化学修饰。配体可以是抗体、适体、受体、辅因子或螯合剂。配体可以键合到RNA酶H酶的活性位点由此抑制酶活性，或者配体可以键合到远离RNA酶的活性位点的位点。在一些实施例中，配体可诱导构象改变。化学修饰可以是交联(例如，通过甲醛)或酰化。可以通过将含有结合RNA酶HII(无活性)的混合物或试样加热到大约65°C至大约95°C或更高的温度，并且/或者可以将混合物或试样的pH降低到大约7.O或更低来实现抑制因子从RNA酶HII的释放或去结合。这里使用的术语“未激活RNA酶H”或“无活性RNA酶H”是指在其他相同实验条件下在50°C确定的与未改进RNA酶H(核酸内切酶活性被认为是100%)相比核酸内切酶活性丧失了大于大约75%或大于大约85%或大于大约95%的RNA酶H。这里使用的术语“激活RNA酶H”或“活性RNA酶H”是指如上所述已被改进的在其他相同实验条件下在50°C确定的与未改进RNA酶H(核酸内切酶活性被认为是100%)相比核酸内切酶活性恢复了大于大约5%或大约10%或大约15%或大约20%或大约25%或大约30%或更多的RNA酶H。如这里所使用，“可诱导”RNA酶H活性是指这里描述的改进的RNA酶H，其具有可以通过与配体结合来调节的核酸内切酶催化活性。在允许的条件下，RNA酶H的核酸内切酶催化活性被激活；然而，在不允许的条件下，该催化活性被抑制。在一些实施例中，改进的RNA酶H的催化活性可以在有助于逆转录的温度下被抑制，即，在大约42°C被抑制，并在PCR反应中发现在更高的温度下被激活，即，在大约65°C至95°C被激活。将具有这些特性的改进的RNA酶称作“热诱导的”。在其他实施例中，可以通过改变含酶溶液的pH来调节改进的RNA酶H的催化活性。如这里所使用，“热启动”酶组合物是指具有酶活性的组合物，该酶活性在大约25°C至大约45°C的不允许的温度下被抑制并在例如大约55°C至大约95°C的与PCR反应匹配的温度下被激活。在特定实施例中，“热启动”酶组合物可以具有本领域已知的‘热启动’RNA酶H和/或‘热启动’热稳定DNA聚合酶。可以使用例如甲醛来执行RNA酶H酶的交联。在一个实施例中，对热稳定RNA酶HII进行使用甲醛的受控和受限交联。通过将包含处于无活性状态的改进的RNA酶HII的扩增反应组合物加热到大约95°C或更高的温度长达例如大约15分钟的长时间，使交联逆转(reverse)并使RNA酶HII活性恢复。通常，交联的程度越低，交联逆转后酶的核酸内切酶活性越高。可以通过改变甲醛的浓度和交联反应的持续时间来控制交联的程度。例如，可以使用大约O.2%(w/v)、大约O.4%(w/v)、大约O.6%(w/v)或大约O.8%(w/v)的甲醛来交联RNA酶H酶。使用O.6%甲醒进行交联反应大约10分钟可以足以使来自Pyrococcusfuriosus的RNA酶HII失活。交联的RNA酶HII在大约37°C未显示出任何可测量的核酸内切酶活性。在一些情况下，交联的RNA酶HII的可测量的部分再激活可以发生在大约50°C的温度，该温度低于PCR变性温度。为了避免这种不期望的酶再激活，可能需要将改进的RNA酶HII储存或保持在低于50°C的温度下，直至其再激活。通常，PCR需要在每一循环将扩增组合物加热到大约95°C以使双链靶序列变性，这也将从RNA酶H释放失活因子,部分或全部恢复酶的活性。也可以通过使用例如二羧酸的酰化剂对酶进行赖氨酸残基的酰化来改进RNA酶Ho可以通过将顺式乌头酸酐加到酰化缓冲液中的RNA酶H溶液中并将得到的混合液在大约1-20°C温育5-30小时来执行RNA酶H的酰化。在一个实施例中，可以在大约3_8°C进行酰化18-24小时。酰化缓冲液的类型不受具体限制。在实施例中，酰化缓冲液具有在大约7.5至大约9.O之间的pH。可以通过将扩增组合物的pH降低到大约7.O或更小来恢复酰化RNA酶H的活性。例如，当将Tris缓冲液用作缓冲剂时，可以将组合物加热到大约95°C，导致pH从大约8.7(在25°C)降低到大约6.5(在95°C)。可以根据改进的RNA酶H、PCR中使用的缓冲液等来改变扩增反应组合物中加热步骤的持续时间。然而，通常，将扩增组合物加热到95°C长达大约30秒至4分钟足以恢复RNA酶H的活性。在一个实施例中，使用诸如InvitrogenAgPathTM缓冲液的市售缓冲液，在加热大约2分钟后恢复了PyrococcusfuriosusRNA酶HII的全部活性。可以使用本领域公知的方法确定RNA酶H的活性。例如，根据第一种方法，在限定的测定条件下以及存在等摩尔多聚胸苷酸下，根据特定摩尔数的放射性标记多聚腺苷酸的酸-增溶来定义单位活性(参见EpicentreHybridasethermostableRNaseHI)。在第二种方法中，在限定的测定条件下，根据包含等摩尔量的探针和互补模板DNA的反应的相对荧光强度的特定增加来定义单位活性。在实施示例中更详细地解释了第二种方法。因此，在示例性实施例的上下文中公开了根据本发明的改进的RNA酶H的使用方法，示例性实施例使用Catacleave逆转录PCR检测来检测试试样中的RNA序列。核酸模板的制备在一些实施例中，试样包括纯化的核酸模板(例如，mRNA、rRNA及其混合物)。从试样提取和纯化RNA的程序在本领域内是公知的。例如,可以使用TRIzol试剂(Invitrogen)提取法从细胞分离RNA。然后，使用例如Nanodrop分光光度计和Agilent2100生物分析仪确定RNA的量和质量。在其他实施例中，试样是细胞裂解液，通过使用pH为大约6至大约9的裂解缓冲溶、浓度为大约O.125%至大约2%的两性离子洗涤剂、浓度为大约O.3mg/ml至大约2.5mg/ml的叠氮化物和诸如蛋白酶K(大约lmg/ml)的蛋白酶裂解细胞来产生所述细胞裂解液。在55°C温育15分钟之后，在95°C处理10分钟使蛋白酶K失活，以产生适合于高效PCR或逆转录PCR分析的“基本上无蛋白质”的裂解液。在一个实施例中，Ix裂解试剂包含12.5mMTris乙酸盐或Tris-HCl或HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)(PH=7-8)、0.25%(w/v)CHAPS,O.3125mg/ml叠氮化钠和lmg/ml的蛋白酶K。这里使用的术语“裂解液”是指具有裂解的细胞碎片和核酸的液相。如这里所使用，术语“基本上无蛋白质”是指大部分蛋白质经蛋白酶的水解切割而失活的裂解液。蛋白酶可以包括蛋白酶K。在细胞裂解过程中加入蛋白酶K使核酸酶迅速失活，否则核酸酶会降解靶核酸。可以对“基本上无蛋白质”的裂解液进行除去失活的蛋白质的处理，或者可以不进行该处理。如这里所使用，术语“细胞”可以指原核细胞或真核细胞。在一个实施例中，术语“细胞”可以指诸如细菌的微生物，细菌包括但不限于革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和耐酸细菌等。在某些实施例中，可以使用表面的擦拭取样(swabsampling)来收集待测“细胞”。在其他实施例中，“细胞”可以指病原生物体。在其他实施例中，试样包括病毒核酸，例如，逆转录病毒核酸。在特定实施例中，试样可以包括慢病毒核酸，例如，HIV-I或HIV-2。如这里所使用，“两性离子洗涤剂”指表现出两性离子特性(例如，不具有净电荷、无导电性和电泳迁移率、不与离子交换树脂结合、破坏蛋白质-蛋白质相互作用)的洗涤剂，其包括但不限于CHAPS、CHAPSO和三甲铵乙内酯衍生物，例如，三甲铵乙内酯衍生物优选是以商品名Zwittergent(Calbiochem,SanDiego,CA)和Anzergent(Anatrace公司，Maumee,0H)出售的磺基三甲铵乙内酯。在一个实施例中，两性离子洗涤剂是CHAPS(CAS号75621_03_3；可从SIGMA-ALDRICH购得，产品号为C3023-1G)，CHAPS是3_[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-I-丙磺酸的缩写(在第4，372，888号美国专利中被更详细地描述)，具有结构权利要求1.一种热启动酶组合物，所述热启动酶组合物包含具有可诱导的RNA酶H活性的酶。2.根据权利要求I所述的热启动酶组合物，其中，所述酶包含具有SEQIDN0:10、ll、12或13的氨基酸序列的RNA酶H同源区域。3.根据权利要求I所述的热启动酶组合物，其中，所述RNA酶H同源区域与SEQIDNO:10、11、12或13的氨基酸序列具有至少70%的同源性。4.根据权利要求2所述的热启动酶组合物，其中，所述RNA酶H同源区域与SEQIDNO:10、11、12或13的氨基酸序列具有至少80%的同源性。5.根据权利要求2所述的热启动酶组合物，其中，所述RNA酶H同源区域与SEQIDNO:10、11、12或13的氨基酸序列具有至少90%的同源性。6.根据权利要求I所述的热启动酶组合物，其中，所述RNA酶H从Pyrococcusfuriosus、Pyrococcushorikoshi、Thermococcuslitoralis、ThermusthermophiIus或大肠杆菌中分离。7.根据权利要求I所述的热启动酶组合物，所述热启动酶组合物还包含聚合酶活性。8.根据权利要求7所述的热启动酶组合物，其中，所述聚合酶活性包含DNA聚合酶活性。9.根据权利要求8所述的热启动酶组合物，其中，所述DNA聚合酶活性是热稳定DNA聚合酶的活性。10.根据权利要求I所述的热启动酶组合物，所述热启动酶组合物还包含逆转录酶活性。11.根据权利要求I所述的热启动酶组合物，其中，所述RNA酶H活性是热诱导的。12.根据权利要求I所述的热启动酶组合物，其中，所述RNA酶H活性通过改变包含酶的溶液的pH诱导。13.根据权利要求I所述的热启动酶组合物，其中，可逆地改良所述具有可诱导的RNA酶H活性的酶。14.根据权利要求13所述的热启动酶组合物，其中，通过将所述酶的氨基酸残基酰化来可逆地改进所述酶。15.根据权利要求14所述的热启动酶组合物，其中，所述氨基酸是赖氨酸。16.根据权利要求13所述的热启动酶组合物，其中，使用甲醛可逆地改进所述具有可诱导的RNA酶H活性的酶。17.根据权利要求16所述的热启动酶组合物，其中，甲醛是以大约O.2-1%(w/v)浓度包含甲醛的溶液。18.根据权利要求I所述的热启动酶组合物，所述热启动组合物还包含配体，其中，所述可诱导的RNA酶H活性受酶与所述配体的结合抑制并且通过干扰所述结合而诱导。19.根据权利要求18所述的热启动酶组合物，其中，所述配体是热不稳定的。20.根据权利要求18所述的热启动酶组合物，其中，所述酶与所述配体之间的所述结合是非共价的。21.根据权利要求18所述的热启动酶组合物，其中，所述配体是对于所述酶具有KT1M或更小的Kd解离常数的小分子、肽或核酸。22.根据权利要求18所述的热启动酶组合物，其中，所述配体结合到所述RNA酶H结构域。23.根据权利要求18所述的热启动酶组合物，其中，所述配体诱导所述RNA酶H结构域中的构象变化。24.根据权利要求18所述的热启动酶组合物，其中，所述配体是抗体、抗体片段、适体或螯合剂。25.根据权利要求24所述的热启动酶组合物，其中，所述抗体片段是Fab、Fab'、F(ah')2、Fd、单链Fv或scFv、二硫键连接的Fv、V-NAR结构域、IgNar、胞内抗体、IgGDCH2^小体、F(ab')3、四体、三体、二体、(ScFv)2、单结构域抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2或scFv-Fc。26.根据权利要求11所述的热启动酶组合物，其中，通过将包含酶的溶液加热到大约90°C或更高的温度诱导所述RNA酶H的活性。27.根据权利要求12所述的热启动酶组合物，其中，通过将包含酶的溶液的pH降低到大约7.O或更低诱导所述RNA酶H的活性。28.根据权利要求27所述的热启动酶组合物，其中，所述溶液是包含靶核酸序列的聚合酶链式反应试样。29.根据权利要求18所述的热启动酶组合物，其中，所述酶与所述配体之间的所述结合是共价的。30.根据权利要求18所述的热启动酶组合物，其中，所述配体是交联剂。31.一种扩增靶序列的方法，所述方法包括提供扩增反应混合物，所述扩增反应混合物包含包含靶DNA序列的试样；如权利要求18所述的热启动酶组合物，包含DNA聚合酶和可诱导的RNA酶H活性；第一引物，包含与靶核酸序列的5'端互补的序列；第二引物，包含与靶核酸序列的3'端互补的序列；以及探针，结合到可检测标记并具有能被RNA酶H切割的组分；以及使扩增反应组合物进行至少一次扩增反应以形成至少一种扩增产物，并且测量得到的扩增产物的可检测标记，其中，扩增反应包括将反应组合物加热到大约90°C的温度的步骤。32.根据权利要求31所述的方法，其中，在大约95°C进行加热反应组合物的步骤。33.根据权利要求31所述的方法，其中，探针是包含一个或多个DNA序列部分以及RNA序列部分的寡核苷酸，其中，RNA部分以RNA序列的3/端和5/端结合到两个DNA序列中的每个DNA序列的方式设置在两个DNA序列之间。34.根据权利要求31所述的方法，其中，所述加热步骤通过破坏具有RNA酶H活性的所述酶和所述配体之间的结合来诱导所述RNA酶H活性。35.根据权利要求31所述的方法，其中，所述配体是热不稳定的。36.一种检测试样中靶核糖核酸序列的方法，所述方法包括提供扩增反应组合物，所述扩增反应组合物包含包含靶RNA序列的试样；如权利要求18所述的热启动酶组合物，包含逆转录酶、DNA聚合酶和可诱导的RNA酶H活性，其中，所述RNA酶H的活性受所述配体抑制；探针序列，包含可检测标记并包含RNA酶H的切割序列；第一引物，包含与靶核酸序列的5'端互补的序列；以及第二引物，包含与靶核酸序列的3'端互补的序列；开始靶RNA的逆转录以形成RNA:cDNA双链；将反应组合物加热至大约90°C或更高的温度，由此激活可诱导的RNA酶H的活性以降解RNA=DNA双链的RNA配基；开始至少一个扩增反应以形成至少一种扩增产物；以及测量得到的扩增产物的可检测标记。37.根据权利要求36所述的方法，其中，探针是包含一个或多个DNA序列部分以及RNA序列部分的寡核苷酸，其中，RNA部分以RNA序列的3/端和5/端结合到两个DNA序列中的每个DNA序列的方式设置在两个DNA序列之间。38.根据权利要求36所述的方法，其中，靶核糖核酸序列是逆转录酶病毒。39.根据权利要求36所述的方法，其中，在大约95°C进行加热反应组合物的步骤。40.根据权利要求36所述的方法，其中，所述加热步骤激活所述可诱导的RNA酶H的活性。41.根据权利要求36所述的方法，其中，所述配体是热不稳定的。42.一种包含如权利要求1、13或18所述的热启动酶组合物的微阵列。43.一种检测多个试样中的靶核糖核酸序列的方法，所述方法包括提供具有多个扩增反应组合物的微阵列，每个扩增反应组合物包括包含靶RNA序列的试样；如权利要求18所述的热启动酶组合物，包含逆转录酶、DNA聚合酶和可诱导的RNA酶H活性，其中，所述RNA酶H的活性受所述配体抑制；探针序列，包含可检测标记并包含RNA酶H的切割序列；第一引物，包含与靶核酸序列的5'端互补的序列；以及第二引物，包含与靶核酸序列的3'端互补的序列；以及在微阵列中对每个扩增反应组合物进行开始靶RNA的逆转录以形成RNA:cDNA双链；将反应组合物加热至大约90°C或更高的温度，由此激活可诱导的RNA酶H的活性以降解RNAicDNA双链的RNA配基；开始至少一个扩增反应以形成至少一种扩增产物；以及测量得到的扩增产物的可检测标记。44.根据权利要求43所述的方法，其中，靶核糖核酸序列是逆转录酶病毒。45.根据权利要求43所述的方法，其中，在大约95°C进行加热反应组合物的步骤。46.根据权利要求43所述的方法，其中，所述加热步骤激活所述可诱导的RNA酶H的活性。47.根据权利要求43所述的方法，其中，所述配体是热不稳定的。48.一种包含如权利要求42所述的微阵列的试剂盒。49.根据权利要求48所述的试剂盒，所述试剂盒还包含具有逆转录酶活性的酶。50.根据权利要求48所述的试剂盒，所述试剂盒还包含具有DNA聚合酶活性的酶。全文摘要描述了一种可逆改进的“热启动”RNA酶H组合物，用于改善测试试样中核酸序列的CATACLEAVETM探针的检测。酶组合物的关键特征是能够在逆转录PCR循环过程中调节RNA酶H的催化活性。因此，在逆转录之前可以首先抑制RNA酶H的活性以最小化RNA:DNA异源双链引物的降解。在完成cDNA合成后，诱导RNA酶H的活性以促进切割和退火到逆转录-PCR产物内的靶DNA序列的CATACLEAVETM探针的荧光检测。所述可诱导的RNA酶H酶适用于在单一反应混合物中需要一步逆转录CATACLEAVETMPCR的高通量应用。文档编号C12N9/22GK102918147SQ201180026040公开日2013年2月6日申请日期2011年5月25日优先权日2010年5月25日发明者张文腾,詹森·欧普迪克申请人:三星泰科威株式会社